CN109001348B

CN109001348B - 一种同时检测猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类药物残留的方法

Info

Publication number: CN109001348B
Application number: CN201710420933.XA
Authority: CN
Inventors: 徐春奎; 李艳; 裔群英; 丁立彤; 陈梦静; 吕晓峰; 张冷思; 徐凯; 吴雅; 戚宇; 沈青龙
Original assignee: Yancheng Agricultural Products Quality Supervision Inspection And Testing Center
Current assignee: Yancheng Agricultural Products Quality Supervision Inspection And Testing Center
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2017-06-07
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2037-06-07
Also published as: CN109001348A

Abstract

一种同时检测猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：S1.提取：乙腈和Na₂EDTA‑McⅡ‑vaine缓冲溶液对待测样品进行提取；S2.净化：提取后上清液过HLB固相萃取柱净化(无需活化小柱)，氮吹干复溶，供上机检测；S3.上机检测。本发明提供的技术方案较现有技术而言具有较大进步，主要体现在：操作快速简单，一般前处理一个样品的时间仅仅需要2个小时，上机检测时间为原来的一半，大大节约了时间，达到了省时省力的效果，最重要的是检测结果稳定。

Description

一种同时检测猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类药物残留的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及猪肉中10种磺胺类和10种氟喹诺酮类药物残留的同时检测方法，具体涉及利用乙腈和Na₂EDTA-Mc Ⅱ-vaine缓冲盐溶液对待测样品进行快速前处理以及液质上机检测的测定方法。

背景技术

磺胺类和氟喹诺酮类药物残留是目前影响动物源性食品中质量安全问题的重要因素，检测磺胺类和氟喹诺酮类这两种药物残留对人体健康具有重要意义。磺胺类和氟喹诺酮类药物是感染性疾病的主要治疗药物，由于有促进动物生长、改善动物产品品质、降低动物发病率及死亡率等作用，常被作为饲料添加剂用于饲料中。但长期不合理使用这些人畜共用或与医用同源的药物作为饲料添加剂，可使机体内某些致病菌产生耐药性，从而降低了治疗效果并残留于动物性食品中，对人体健康造成危害，因此，开发快速、高效的检测技术对于动物性食品的质量控制，保障动物源性食品安全具有重要意义。

目前磺胺类检测方法主要采用NY5029-2001附录E《磺胺类药物在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法》以及确证方法农业部1025号公告-23-2008《动物源食品中磺胺类药物残留检测液相色谱-串联质谱法》，氟喹诺酮类检测方法为GB/T21312-2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱质谱法》，磺胺类液质检测方法为：

1.取待测组织样品，乙酸乙酯多次提取后，合并提取液；

2.在提取液中加入0.1mol/L盐酸，旋蒸，将残留的兽药转移到盐酸层；

3.再经过离心、过固相萃取柱净化、氮吹浓缩等步骤，最后上机检测。

但该类方法存在以下明显的缺点：

1.提取所用乙酸乙酯用量大(一个样品为30mL)，乙酸乙酯气味较大；

2.由于经过旋蒸耗时较长，因此前处理时长要3个小时左右；

3.净化过程繁琐，需要经过预活化、上柱、洗柱、洗脱，且药物残留回收一般不稳定。

氟喹诺酮类检测目前方法主要是：

1.取待测组织样品，Na₂EDTA-Mc Ⅱ-vaine缓冲溶多次提取后，合并提取液；

2.再经过离心、固相萃取柱净化、氮吹浓缩等步骤，最后上机检测。

但该类方法存在以下明显的缺点：

1.净化过程繁琐，需要经过预活化、上柱、洗柱、洗脱，同时提取体积较大，过柱耗时较长；2.药物残留回收率不稳定。

针对上述存在的问题，我们需要作出一些改进。

发明内容

为解决现有方法检测时间长、效果不稳定，且两类药物残留分别前处理以及分别上液质检测的问题，本发明提供了一种相对操作简单、耗时短、效果稳定的一种猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类药物残留同时检测的液质方法。

本发明的具体技术方案是：

一种同时检测猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：

S1.提取：乙腈和Na₂EDTA-McⅡ-vaine缓冲溶液对待测样品进行提取；

S2.净化：提取后上清液过HLB固相萃取柱净化(无需活化小柱)，氮吹干复溶，供上机检测；

S3.上机检测。

优选地，所述S1中0.1mol/L Na₂EDTA-Mc Ⅱ-vaine缓冲溶液配制为准确称取37.2g Na₂EDTA·2H₂O、27.49g Na₂HPO₄·12H₂O和12.9g柠檬酸于烧杯内，定容至1000mL，调节pH至4.0，混合均匀。

优选地，所述S1中提取液为乙腈和Na₂EDTA-Mc Ⅱ-vaine缓冲溶液体积之间的数值比例为4:1。

优选地，所述S1中涡旋的时间设定为30秒。

优选地，所述S1中水平振荡的时间设定为10分钟。

优选地，所述S1中超声提取的时间设定为5分钟。

优选地，所述S1中离心的时间设定为5分钟，转速设定为10000r/min。

优选地，所述S2中HLB固相萃取小柱无需活化。

优选地，所述S3中上机检测条件为：

色谱条件——色谱柱：C18柱(Rapid Resolution HD 2.1×10 0mm，1.8-Micron)；流动相：A相为0.1％(v/v，下同)甲酸水(含5mM的乙酸铵)，B相为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序：0-0.5min，保持90％A，0.5-1min，从90％A变为80％A，1.0-4.0min，从80％A变为75％A；4.0-7.0min从75％A变为10％A，7.0-8.5min，保持10％A；流速：0.4mL/min；进样量：1.0μL；时间：10min；柱温：30℃；

质谱条件——电离模式：电喷雾正离子(ESI+)；毛细管电压：40kV；离子源温度：350℃；干燥气流速：11L/min，雾化器压力：45psi；采集方式：多反应监测扫描模式(MRM)；增加电压(+)：200V。

本发明提供的技术方案较现有技术而言具有较大进步，主要体现在：

合并两类药物残留检测方法，操作快速简单，一般前处理一个样品的时间仅仅需要2个小时，上机检测时间为原来的一半，大大节约了时间，达到了省时省力的效果，最重要的是检测结果稳定。

具体实施方式

以下结合现有技术及实施例对本发明所揭示的一种同时检测猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类药物残留的方法作进一步阐释。

1.现有技术采用的前处理方法。

现有技术(磺胺类)：称取5g(±0.05g)试样，加入15mL乙酸乙酯涡动2min，5000r/min离心10min，分离上清液于100mL鸡心瓶中，残渣重复提取一次，合并乙酸乙酯层；在提取液中加入5mL 0.1mol/L盐酸，45℃旋蒸出乙酸乙酯，将残留的盐酸层转移至10mL离心管中，分别用2mL0.1mol/L盐酸和5mL正己烷洗涤鸡心瓶，转移至同一离心管，手动振摇20次，3500r/min离心5min，弃去正己烷，再用3mL正己烷重复一次，取下层液待净化备用；MCX柱依次用3mL甲醇、3mL 0.1mol/L盐酸预洗，将上述备用液在重力作用下过柱，然后分别用2mL0.1mol/L盐酸和2mL的体积比为55:25:20的水甲醇乙腈洗涤小柱，最后用2mL的体积比为75:10:10：5的水甲醇乙腈氨水洗脱药物，收集洗脱液于45℃水浴氮气吹干，用水定容至1mL，过0.2μm有机系微孔滤膜，供上机待测。

现有技术(氟喹诺酮类)：称取5g(±0.1g)试样，加入20mL0.1mol/LNa₂EDTA-McⅡ-vaine缓冲溶液,1000r/min漩涡混合1min，超声提取10min，离心10000r/min离心5min，提取三次，合并上清液待净化；HLB固相萃取小柱依次用甲醇、水各6mL活化，取全部备用液过柱，再用2mL 5％甲醇水淋洗抽干，最后用6mL甲醇溶液洗脱；洗脱液用氮吹干，用1mL0.2％甲酸水溶液复溶，涡旋混匀，供上机待测。

2.本发明采用的技术方案。

准确称取2.00g均匀猪肉试样，再加入1.00mL 0.1mol/LNa₂EDTA-Mc Ⅱ-vaine缓冲溶液，以及4.00mL乙腈，涡旋30s，中速水平振荡10min，超声提取5min，10000r/min离心5min，转移上清液到一新的离心管中，重复上述步骤再提取一次，合并混匀两次提取液；取5mL提取液待净化，固相萃取小柱无需活化，直接将待净化液过柱，挤干，洗脱液于50℃下氮吹至1mL以下，用1.0mL甲醇-0.1％甲酸溶液(1:9，v/v)复溶，涡旋混匀，过0.22μm有机系微孔滤膜，供上机待测。

本发明采用的方案是在以下条件下进行检测：

1.色谱条件

色谱柱：C18柱(Rapid Resolution HD 2.1×10 0mm，1.8-Micron)；流动相：A相为0.1％(v/v，下同)甲酸水(含5mM的乙酸铵)，B相为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序：0—0.5min，保持90％A，0.5—1min，从90％A变为80％A，1.0—4.0min，从80％A变为75％A；4.0—7.0min从75％A变为10％A，7.0—8.5min，保持10％A；流速：0.4mL/min；进样量：1.0μL；时间：10min；柱温：30℃。

2.质谱条件

电离模式：电喷雾正离子(ESI+)；毛细管电压：40kV；离子源温度：350℃；干燥气流速：11L/min，雾化器压力：45psi；采集方式：多反应监测扫描模式(MRM)；增加电压(+)：200V。

表1：10种磺胺类和10种氟喹诺酮类药物残留的保留时间、定量离子对、定性离子对、锥孔电压和碰撞能量

表2：猪肉基质中10种磺胺类和10种氟喹诺酮类的加标回收情况

备注：猪肉基质中均未检测出上述兽药。

本发明采用的方案得出的结果与分析：

从表2可以看出，在猪肉组织样品中通过添加10种磺胺类和10种氟喹诺酮类，在低浓度(25μg/kg)时磺胺类加标回收率在62.30-81.12％，RSD在0.92-10.83％，氟喹诺酮类加标回收率在81.52-95.98％，RSD在0.31-7.19％；在中等浓度水平时(50μg/kg)磺胺类加标回收率在61.83-83.33％，RSD在0.45-6.36％，氟喹诺酮类加标回收率在87.15-101.58％％，RSD在0.49-5.27％；在高浓度水平时(100μg/kg)磺胺类加标回收率在63.61-84.39％，RSD在0.04-7.89％，氟喹诺酮类加标回收率在85.73-96.66％，RSD在0.24-8.92％；从上述分析结果可以看出，两类参数在低中高浓度的加标回收结果均较好。

现有技术与本发明之间的对比：

笔者采用在空白猪肉样品中添加两类药物计算回收率来评价前处理及上机检测效果，现有技术对这两类参数检测效果均较好，加标回收率在54.6-77.1％的范围之间(数据未列出)，但是洛美沙星和磺胺喹恶啉加标回收低于60％，且现有技术前处理一个样品需要花费时间在4h左右，而且两类参数分开前处理及上机检测。本发明采用乙腈和Na₂EDTA-McⅡ-vaine缓冲盐溶液对两类药物残留同时提取，经过振荡超声充分提取，用HLB固相填料进行萃取净化，无需活化小柱，快速简洁，一般前处理一个样品需要花费2h左右，与现有技术相比，大大节约了时间，达到了省时省力的效果，最重要的是，本发明技术检测方法加标回收结果均比较稳定，磺胺类加标回收在61.83-84.39％，RSD在0.04-10.83％，氟喹诺酮类在81.52-101.58％，RSD在0.24-8.92％，均比较满意；且RSD均在15％之内，20种药物标准曲线在6.25-200μg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，均符合检测技术方法要求。

以上实施例是对本发明的具体实施方式的说明，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案，因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。

Claims

1.一种同时检测猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类药物残留的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

准确称取2.00g均匀猪肉试样，再加入1.00mL 0.1mol/LNa₂EDTA-McⅡ-vaine缓冲溶液，以及4.00mL乙腈，涡旋30s，中速水平振荡10min，超声提取5min，10000r/min离心5min，转移上清液到一新的离心管中，重复上述步骤再提取一次，合并混匀两次提取液；取5mL提取液待净化，固相萃取小柱无需活化，直接将待净化液过柱，挤干，洗脱液于50℃下氮吹至1mL以下，用1.0mL甲醇-0.1%甲酸溶液, v/v为1:9，复溶，涡旋混匀，过0.22μm有机系微孔滤膜，供上机待测；上机检测条件为：

色谱条件——色谱柱： C18 柱，Rapid Resolution HD 2.1 ×10 0mm，1.8-Micron；流动相：A相为0.1％甲酸水，含5mM的乙酸铵，B相为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序：0-0.5min，保持90%A，0.5-1min，从90%A变为80%A，1.0-4.0min，从80%A变为75%A；4.0-7. 0min从75%A变为10%A，7.0-8.5min，保持10%A；流速：0.4mL/min；进样量：1.0 μL；时间：10min；柱温：30℃；

质谱条件——电离模式：电喷雾正离子，ESI+；毛细管电压：40kV；离子源温度：350℃；干燥气流速：11L/ min，雾化器压力：45psi；采集方式：多反应监测扫描模式，MRM；增加电压：+200V；

0.1 mol/L Na₂EDTA-McⅡ-vaine缓冲溶液配制为准确称取37.2g Na₂EDTA·2H₂O、27.49g Na₂HPO₄·12H₂O和12.9g柠檬酸于烧杯内，定容至1000mL，调节pH至4.0，混合均匀。