CN111239279B - 一种测定肉中瓜尔胶的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定肉中瓜尔胶的分析方法，采用三氟乙酸对添加瓜尔胶的畜肉进行降解；然后通过高分辨率质谱对水解液扫描，并结合空白畜肉结果，进行差异组分查找，确定瓜尔胶水解后的特征标志物离子；在此基础上，进一步的利用串联质谱，获得特征标志物离子的多重反应监测定性和定量的离子对，完成基于高效液相色谱‑串联质谱的瓜尔胶分析方法的建立。

Description

一种测定肉中瓜尔胶的分析方法

技术领域

本发明涉及一种测定肉中瓜尔胶的分析方法，属于食品安全和食品分析检测领域。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

瓜尔胶是从瓜尔豆中提取的一种天然的多糖，其主链由(1-4)β-D-甘露糖为结构单元连接，侧链为α-D-半乳糖组成，通过(1-6)糖苷键与主链相接。作为一种广泛使用的食品添加剂，瓜尔胶在肉制品中主要用作增稠剂、粘合剂和持水剂。因瓜尔胶价格低廉，近年来成为目前世界上最应用广泛的亲水性胶体之一。由于肉价的不断攀升，不法分子通过对牲畜屠宰前泵注或者生鲜肉直接注入的方式，制售含有瓜尔胶的畜鲜肉或者冻肉(“注胶肉”)。该行为不仅涉嫌行业欺诈，而且注胶肉可能会通过胶水引入致病微生物和外源性有害物质污染，如防腐剂、重金属、色素等。

目前国内外关于瓜尔胶的注胶肉尚无相关的检测标准或者规范。虽然水分质量分数在相关标准中作为部分畜肉的判断标准之一，但是仅通过水分测定无法判断注水肉与注胶肉。低场核磁共振技术可以提供肉中水分的存在状态和分布方式，实现注胶成分的分段预测。近红外光谱技术通过大样本量实验，结合主成分分析、判别分析、结合最小二乘法等化学计量学手段，可以实现注胶肉的判别。以上两种方法虽然操作相对简单，但是其结果的准确性严重的依赖于判别模型，其判定注入胶的参数不明确，无法作为定性和定量的依据在执法检测中应用。

因此，急需建立畜禽肉中瓜尔胶的检测方法，满足检测和执法需求，遏制畜禽肉注瓜尔胶不法行为，保障食品安全。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于针对现有技术中的缺陷，提供一种测定肉中瓜尔胶的分析方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种测定肉中瓜尔胶的分析方法，包括以下步骤：

1)将待分析肉样品研磨后用1.5～2.5mol/L的三氟乙酸水溶液在温度75～85℃条件下降解25～35min，其中，样品与三氟乙酸水溶液的投料比例为1g：1mL；降解结束后，冷却，离心得到上清水解液；取上清水解液按照1:1～1.5体积比加入甲醇洗涤后在75℃条件下氮吹至干，重复数次直至pH为中性，用水复溶后，经0.22μm水相滤膜过滤，得到待分析降解液；

2)基于高效液相色谱-串联质谱对待分析降解液进行分析，选取粒径为5.0μm，柱长为150mm，柱内径为2.1mm的HILIC柱作为色谱柱；其中，液相色谱条件为：

进样量：10μL；

柱流速：0.5mL/min；

柱温:30℃；

质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测；毛细管温度：300℃；毛细管电压：-3500V；脱溶剂气温度：350℃；壳气流速：50psi；辅助气流速：30psi。

3)获得特征标志物离子的多重反应监测定性和定量的离子对，完成基于高效液相色谱-串联质谱的瓜尔胶分析方法的建立。

按上述方案，在步骤1)中，所述降解在封闭反应容器中进行并伴有涡旋。

按上述方案，在步骤2)中，还包括采用流动相进行洗脱以获得更优的分离效果，所述流动相由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈。

按上述方案，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～15min，A相从15v/v％升至35v/v％，B相从85v/v％降至65v/v％；15～20min，A相从35v/v％降至15v/v％，B相从65v/v％升至85v/v％。

按上述方案，所述肉为畜禽肉，包括生鲜肉、冷却肉或冻肉。

按上述方案，三氟乙酸水溶液的浓度为2mol/L。

按上述方案，降解条件为：温度为80℃，时间为30min。

按上述方案，采用标准曲线法定量分析，定量离子对为341-179，采用标准曲线法定量，按公式(1)处理系统计算瓜尔胶的含量：

式中；

X—试样中待测组分的含量，单位为克每千克

c—待测组分相应值在标准曲线上计算得到的浓度，单位为微克每升

V—样品定容体积，单位为毫升

f—样品的稀释倍数

m—样品称样量，单位为克

注：计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字，在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过其算数平均值的10％。

按上述方案，所述方法的平均回收率为79～90％，相对标准偏差为6.5～8.5％。

按上述方案，所述方法的瓜尔胶在牛肉中的检出限为50mg/kg，定量限为200mg/kg。

与相关技术相比，本发明产生的有益效果是：

(1)本发明首次提出一种测定肉中瓜尔胶的新分析方法，该方法能够准确判定肉中是否含有瓜尔胶，以及能够确定瓜尔胶的含量。

(2)本发明样品前处理过程简单、所用时间短。

(3)本发明所建立的方法灵敏度和准确性较好，满足实际检测和执法需求。

(4)本发明的方法抗干扰性强，即使肉中掺杂与瓜尔胶复配的其他胶体，采用本发明的方法也能将其进行检测。可以根据不同胶体在液相色谱质谱的特征离子不同，把瓜尔胶与其他胶体进行区分(例如瓜尔胶的特征母离子峰是341，503，665，827；卡拉胶的特征母离子峰是403，483)。

附图说明

构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是瓜尔胶多糖的结构单元。

图2是三氟乙酸降解瓜尔胶液注肉电喷雾质谱图。

图3是瓜尔胶水解液二糖-五糖离子的MRM离子流图。

图4是盐酸降解瓜尔胶液注肉电喷雾质谱图。

图5是三氟乙酸分别采用不同浓度时目标物响应示意图。

图6是分别采用不同降解温度时目标物响应示意图。

图7是分别采用不同降解时间时目标物响应示意图。

图8是HILIC柱峰形图。

图9是氨基柱峰形图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，目前国内外关于瓜尔胶的注胶肉尚无相关的检测标准或者规范。因此，急需建立一种畜禽肉中瓜尔胶的检测方法，满足检测和执法需求，遏制畜肉注瓜尔胶不法行为，保障食品安全。在试验研究过程中，相比于其他大分子天然多糖胶体，本发明人发现由于瓜尔胶结构上甘露糖主链和半乳糖侧链并非严格按照2：1的比例均匀分布，二糖以上寡糖立体化学特征或者糖苷键的连接位置不完全相同，这将导致瓜尔胶部分水解后产生的寡糖片段会存在多种(差向)异构体，而且还由于瓜尔胶多糖分子量庞大，这在实际检测中存在很大的技术难点，因而，目前国内外关于瓜尔胶的注胶肉尚无相关的检测标准或者规范。

针对此，在本发明的一个典型的实施方式中，提供一种测定肉中瓜尔胶的分析方法，该方法包括：

(1)分别将待分析肉样品和无瓜尔胶肉样品采用三氟乙酸水溶液进行降解，得到待分析肉样品水解液和无瓜尔胶肉样品水解液；

(2)通过高分辨率质谱对水解液进行扫描，进行差异组分查找，确定瓜尔胶水解后的特征标志物离子；

(3)利用串联质谱，获得特征标志物离子的多重反应监测定性和定量的离子对，完成基于高效液相色谱-串联质谱的瓜尔胶分析方法的建立。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述肉包括但不限于生鲜肉、冷却肉或冻肉，肉的种类包括但不限于畜禽肉，具体包括牛肉、羊肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉等中的一种或多种。

在本发明的一个或一些实施方式中，为了保证检测结果的灵敏性，寡糖片段分析采用电喷雾在负离子下模式进行之前，将体系的pH调成中性。经过试验验证和分析，若是单纯的通过添加氨水等碱性物质调整pH，会使碱性物质和降解液体系中的其他分子发生反应，增加系统基质的复杂性，将导致灵敏度、准确度和精密度下降；若是单纯的通过提高体系温度而使酸进行挥发，会破坏降解体系中寡糖的结构，从而使得检测结果不准确。而本发明采用加热或洗涤的方式将低沸点的三氟乙酸去除，避免了以上问题。具体的方法为：可采用甲醇进行洗涤除去三氟乙酸，然后放入75℃水浴中氮吹至干，重复数次可将三氟乙酸去除。

在试验研究过程中，发明人发现三氟乙酸水溶液的投料体积和浓度对瓜尔胶的定性有较为重要的影响，经过试验验证，采用其他降解剂无法得到稳定的寡糖片段，从而无法实现对肉中瓜尔胶的准确定性。因此，在本发明的一个或一些实施方式中，本发明提供了一个针对较为合适的投料比例和物料浓度，即：样品与三氟乙酸水溶液的投料比例为(1～1.5)g：(1～1.5)mL，需采用相对较浓的三氟乙酸水溶液，三氟乙酸水溶液的浓度为1.5～2.5mol/L；优选的，样品与三氟乙酸水溶液的投料比例为1g：1mL，其中三氟乙酸水溶液的浓度为2mol/L。采用以上范围的投料比例和物料浓度，能够快速实现肉中瓜尔胶的准确定性。

进一步的，发明人在试验过程中还发现，针对三氟乙酸水溶液，降解温度和时间对于检测结果同样也有着较为重要的影响。本申请发明人在研究中发现，降解温度和降解时间需要在一个特定的范围内才会实现肉中瓜尔胶的准确定性。对此，发明人经过研究得到，降解条件为：温度为75～85℃，时间为25～35min，优选的，温度为80℃，时间为30min。

在本发明的一个或多个实施方式中，具体的降解方法包括：将样品研磨后与三氟乙酸水溶液混合，封闭反应容器，涡旋，然后在75～85℃下反应25～35min，每8～12min振摇一次；反应结束后，冷却，离心得到上清水解液；取上清水解液按照1:1～1.5体积比加入甲醇洗涤后75℃条件下氮吹，重复数次，将三氟乙酸除去后，用水复溶后，经0.22μm水相滤膜过滤，得到待分析降解液。

基于以上阐述，可以获知本发明的水解液存在多种(差向)异构体寡糖片段，本发明人根据该特点，选择HILIC柱作为色谱柱。HILIC可为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留，弱极性物质在溶剂前沿就出来了。经过试验验证，HILIC柱有利于实现目标组分和基质干扰物质的分离，从而降低基质效应的影响。本发明采用HILIC柱可以获得对称性好和半峰宽更窄的峰形，而其他色谱柱针对该降解液无法达到此技术效果。

进一步的，所述HILIC柱的粒径为5.0μm，柱长为150mm，柱内径为2.1mm。

基于此，本发明人经过研究获得本技术方法的流动相，它是由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈，采用梯度洗脱。采用流动相，可以获得更优的分离效果。

针对复杂且存在多种差向异构体寡糖的降解液，本发明人选择了合适时间的梯度洗脱程序，能够实现最佳分离。具体的，梯度洗脱程序为：0～15min，A相从15v/v％升至35v/v％，B相从85v/v％降至65v/v％；15～20min，A相从35v/v％降至15v/v％，B相从655v/v％升至85v/v％。

经过发明人筛选和优化获得的液相色谱条件如下：

进样量：10μL；

柱流速：0.5mL/min；

柱温:30℃。

在本发明的一个或一些实施方式中，经过发明人筛选和优化获得的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测；毛细管温度：300℃；毛细管电压：-3500V；脱溶剂气温度：350℃；壳气流速：50psi；辅助气流速：30psi。

在本发明的一个或一些实施方式中，定量离子对为341、179。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1.试剂和材料

水为GB/T6682规定的一级水。

瓜尔胶：食品添加剂级。

甲醇：色谱纯。

乙腈：色谱纯。

三氟乙酸：纯度>98％。

2.0mol/L三氟乙酸水溶液：称取228g三氟乙酸于1L容量瓶中，用水定容。

对照品储备液：称取瓜尔胶0.1g，用9mL温水溶解后，转移至10mL的容量瓶中，冷却后用水定容，配置成质量浓度为10mg/mL的储备液。

微孔滤膜：0.22μm。

2.仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源(ESI)。

电子分析天平：感量0.0001、0.001g。

氮吹仪。

涡旋混匀器。

高速冷冻离心机。

微量移液器：100μL，1mL，5mL。

pH计。

组织捣碎机。

恒温水浴。

3.前处理方法

牛肉放入刀式研磨仪均质，充分混匀，均分成两份，分别装入清洁容器内，并标明标记。制样操作过程中，应防止样品受到污染。称取试样10g(精确到0.01g)于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL的2mol/L三氟乙酸水溶液，加盖涡旋1min后置于80℃水浴中30min，每10min振摇一次。取出放冷至室温后，5000r/min离心5min。取上清水解液按照1:1体积加入甲醇洗涤后放入75℃水浴中氮吹至干，重复数次，将三氟乙酸去除后用1mL水复溶后，经0.22μm水相滤膜过滤，上机分析。

4.仪器分析方法

液相色谱条件：

a)色谱柱:HILIC柱，150mm×2.1mm(内径)，粒径5.0μm；

b)进样量：10μL；

c)流动相:A为H₂O，B为乙腈，梯度洗脱条件见表1；

表1液相色谱的梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A％	流动相B％
			0	15	85
15	35	65
			20	15	85

d)柱流速：0.5mL/min；

e)柱温:30℃；

质谱条件：

a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；

b)扫描方式：负离子模式；

c)检测方式：多反应监测；

d)毛细管温度：300℃；

e)毛细管电压：-3500V；

f)脱溶剂气温度：350℃；

g)壳气流速：50psi；

h)辅助气流速：30psi。

表2瓜尔胶水解寡糖离子对、碰撞气能量以及去簇电压

*为定量离子对

5.定性检测

选取肉样，按照上述前处理进行水解，水解后如果存在系列的寡糖母离子341，503，665，872(m/z)为定性离子，可对目标化合物进行定性检测。

6.定量检测

标准曲线法定量：取瓜尔胶标准工作溶液，加入去离子水，分别配成浓度为50-1000μg/L间5个浓度的标准溶液，将5个浓度的标准溶液分别加入等量的空白牛肉基质中，用上述前处理方法进行提取，然后过0.22μm滤头，进液相色谱串联质谱检测，以浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，做标准曲线，通过标准曲线计算得出样品检测结果。

7.检出限

本方法的测定低限采用添加法进行实际测定得到。本方法瓜尔胶在牛肉中的检出限均为50mg/kg，定量限均为200mg/kg。

通常情况下，一些不法商贩为了牟利，每100千克肉注入15～35kg胶水，一般用于水性增稠胶体的高分子量瓜尔胶添加量都是在5％固含量以内，按照最低注胶水15kg计算，15kg胶水中胶的含量为0.75kg。因此，注胶肉中胶的含量为7.5g/kg。本实验的方法可以满足实际市场的检测需要。

7.回收率

选用不含待测组分的阴性控制样品，控制样品为牛肉样品，进行了200mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg浓度水平添加回收试验，每个添加浓度水平下做6个平行样品，平均回收率和精密度数据见表3。

表3牛肉回收率和精密度数据

从表3可以看出，平均回收率为79～90％,相对标准偏差为6.5～8.5％，表明该方法准确可靠，精密度良好。

比较例1

硫酸危险性过高，因此未使用硫酸作为酸解液处理样品，经过盐酸酸解液处理后的样品，不能扫描出目标物的特征离子峰，谱图如图4所示。

比较例2

三氟乙酸的浓度分别采用0.5mol/L，1mol/L，2mol/L，和3mol/L，在三氟乙酸浓度为2mol/L时，目标物响应最高，参见图5。

降解温度分别采用40℃，60℃，80℃，和100℃，在降解温度为80℃时，目标物响应最高，参见图6。

降解时间分别采用20分钟，30分钟，40分钟，和50分钟，在降解时间为30分钟时，目标物响应最高，参见图7。

比较例3

比较了HILIC柱和氨基柱两种色谱柱，结果表明HILIC柱峰形更好，四种特征离子峰能完全分离，参见图8-9。

实施例2

从某市场采购羊肉样品2个，按照上述方法进行分析，检出瓜尔胶含量为10.5g/kg，经过

样品号	瓜尔胶含量(g/kg)
		1#	3.2g/kg
2#	6.5g/kg

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种测定肉中瓜尔胶的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将待分析肉样品研磨后用1.5～2.5mol/L的三氟乙酸水溶液在温度75～85℃条件下降解25～35min，其中，样品与三氟乙酸水溶液的投料比例为1g：1mL；降解结束后，冷却，离心得到上清水解液；取上清水解液按照1:1～1.5体积比加入甲醇洗涤后在75℃条件下氮吹至干，重复数次直至pH为中性，用水复溶后，经0.22μm水相滤膜过滤，得到待分析降解液；

2)基于高效液相色谱-串联质谱对待分析降解液进行分析，选取粒径为5.0μm，柱长为150mm，柱内径为2.1mm的HILIC柱作为色谱柱；其中，液相色谱条件为：

进样量：10μL；

柱流速：0.5mL/min；

柱温:30℃；

质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测；毛细管温度：300℃；毛细管电压：-3500V；脱溶剂气温度：350℃；壳气流速：50psi；辅助气流速：30psi；

3)获得特征标志物离子的多重反应监测定性和定量的离子对，完成基于高效液相色谱-串联质谱的瓜尔胶分析方法的建立；

在步骤2)中，还包括采用流动相进行洗脱，所述流动相由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈；

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～15min，A相从15v/v％升至35v/v％，B相从85v/v％降至65v/v％；15～20min，A相从35v/v％降至15v/v％，B相从65v/v％升至85v/v％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述降解在封闭反应容器中进行并伴有涡旋。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肉为畜禽肉，包括生鲜肉、冷却肉或冻肉。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，三氟乙酸水溶液的浓度为2mol/L。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，降解条件为：温度为80℃，时间为30min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用标准曲线法定量分析，定量离子对为341-179，采用标准曲线法定量，按公式(1)处理系统计算瓜尔胶的含量：

式中；

X—试样中待测组分的含量，单位为克每千克

c—待测组分相应值在标准曲线上计算得到的浓度，单位为微克每升

V—样品定容体积，单位为毫升

f—样品的稀释倍数

m—样品称样量，单位为克

注：计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字，在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过其算数平均值的10％。

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