CN111323510B - 一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，它先配制、混合标准品工作溶液、样品溶液、线性溶液、空白溶液、加标回收试验样品溶液，再用三柱二维液质联用法测定，得到曲线方程斜率、曲线方程截距、最后结果分析及验证结构。本发明将三柱二维凝胶色谱‑串联质谱联用技术应用于鸡肉中喹诺酮类药物的快速、高效、灵敏的检测，它利用凝胶色谱的体积排阻原理，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；利用在线柱切换液相‑质谱联用技术，实现喹诺酮类药物残留在线净化目的，提高了检测效率，方法前处理简单，检测周期短，相对于其他方法具有绿色环保，快速、准确等特点，人为干预因素减少，同时还具有有机溶剂消耗小，成本低的特点。

Description

一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法。
现有技术
喹诺酮类药物具有抗菌效果明显、性质稳定、价格便宜等优点，是用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学药物，目前被广泛应用于畜禽等疾病防治。在畜牧业生产中，使用抗菌药物无疑会提高生产效率，并带来巨大经济效益，但由于上述药物存在使用不当可导致动物源性食品中药物的残留，且在动物体内无法代谢完全，其残留量通过食物链进入人体，进而对人体健康构成危害，如骨关节病、中枢神经反应、泌尿道反应、肝肾毒性和消化系统疾病等。目前许多国家和地区均通过各种途径来控制或降低畜产品中的药剂残留量，以保护消费者的安全。然而，在经济利益的驱动下，养殖业中存在非法添加兽药的现象，为了保护人民的身体健康，必须从在各个环节上确保畜产品的安全，从源头进行控制的有效手段。因此研究食品中喹诺酮类兽药残留检测方法具有重要的意义。
目前对动物源性食物中的喹诺酮类兽药残留的理化分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留，廖洁丹、和高效液相色谱质谱联用法等(LC/MS)。LC方法专属性不高，不适用于复杂基质中痕量组分的测定。液相色谱-串联质谱法具有较高的专属性和灵敏度，常用于药物的多残留分析，但目前文献的前处理过程均较为复杂，分析周期较长，有些化合物受到基质干扰严重。随着人们对食品样品复杂体系的分离分析要求不断提高，传统的一维液相色谱的峰容量和分离度比较有限，已经不能满足食品分析。因此在一维液相色谱理论和相关技术的基础之上，诞生了多维液相色谱这一结合多种分离方式的技术手段，其中二维液相色谱作为多维液相色谱的主体，已成为食品分析研究的重要方向。二维液质联用技术可以将凝胶净化柱净化与分离分析系统相连，实现在线净化，样品经过相应的试剂提取后不再需要人工净化等操作，直接由系统进样后净化，然后通过在线柱切换直接导入质谱系统进行分析，减少了人工操作带来的不确定性，节约了试剂，节约了时间，减少了工作量。该平台的建立，能够对兽药残留的突发性食品安全事件进行快速的响应，在最短时间内快速的确定安全事件的兽药残留来源，为突发事件的应对和控制提供有效的数据支持和技术保障。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法。
所述的一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.1mL1.0mg/mL的8种喹诺酮类药物诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星、马坡沙星、沙氟沙星和奥比沙星储备液至10mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1mL混合液至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容，制成1mg/L的混合标准品工作溶液，于4℃下保存备用；
2)样品溶液的制备：取待测鸡肉制品，置50mL高速离心管中，精密加入乙腈20mL，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10％甲醇水溶液复溶，制得样品溶液备用；
3)线性溶液的制备：称取不含喹诺酮类药物的鸡肉制品，置50mL高速离心管中，精密加入20mL乙腈溶液，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL复合溶剂复溶，过滤后制得空白基质溶液，精密吸取不同量的步骤1)制得的混合标准品工作溶液，由空白基质溶液稀释得到各喹诺酮药物浓度分别为4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；
4)空白溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的样品，置50mL高速离心管中，精密加入20mL乙腈溶剂，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10％甲醇水溶液复溶，制得空白溶液，供色谱测定；
5)加标回收试验样品溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的鸡肉样品，置50mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1)制得的混合标准品工作溶液，获得检出限为1ng/mL、定量限为3ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入20mL复合溶剂，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10％甲醇水溶液复溶，制得加标回收试验样品溶液，供色谱测定；
6)用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液
a进样过程：由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；
b曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
以线性溶液中的目标化合物峰面积定量，得到曲线方程A＝aC+b，
式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；
c结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一喹诺酮类药物的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该喹诺酮类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C＝(A-b)/a
式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积；
a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120％，证明该检测方法可行。
所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于外标法定量。
所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于步骤3)中的复合溶剂为10％甲醇水溶液。
所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于步骤3)中的过滤采用0.22μm的滤膜过滤。
所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现喹诺酮类药物残留的在线净化。
所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于色谱和质谱条件
1)一维液相色谱条件
色谱柱：凝胶柱4.6×150mm，5μm，
Figure BDA0002425121270000061
流动相为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；流速为0.35mL/min；富集柱：XBridge C8 DirectConnect HP 10μm；
2)二维液相条件色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱2.1×50mm，1.7μm；流动相A相为0.1％甲酸水，流动相B相为0.1％甲酸甲醇；梯度洗脱；柱温为35℃；进样量为5μL；
3)质谱条件
离子源为电喷雾离子源，正离子模式，ESI+；毛细管电压为3.0kV；离子源温度为150℃；脱溶剂气为N2；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流速为800L/h；锥孔流速为150L/h；碰撞气为Ar；扫描方式为多反应监测；
所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于测定的进样过程如下：在四元泵的作用下，由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向一维色谱柱进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，结果由紫外检测器检测，左切换阀和右切换阀在0-5.5min保持初始状态，即均处于位置2，左切换阀的2号位和3号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀亦是2号位与3号位相通，切至废液的状态；在5.5-13.5min左切换阀切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱中进行富集，在13min左切换阀切换至位置2，二元泵将富集柱上的目标化合物反冲至二维色谱柱上进行分离，右切换阀位置不变，利用二元泵流动相将富集柱上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在18.5min时右切换阀切换至位置1，即右切换阀的2号位与1号位相通，进入质谱检测器进行分析；获得典型色谱图。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明首次将三柱二维凝胶色谱-串联质谱联用技术应用于动物源性食品中喹诺酮类药物的快速、高效、灵敏的检测，方法前处理简单，实现在线净化；它利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；利用在线柱切换液相-质谱联用技术，实现喹诺酮类药物残留在线净化目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，解决了传统药物残留分析技术中前处理方法操作繁琐、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证以及多种药物同时分析时很难满足待测药物均取得很好的定性定量效果的问题，将实验人员从日益繁重的检测任务解脱出来，方法使用较少的有机试剂，检测周期短，相对于其他方法具有绿色环保，快速、准确等特点；本发明建立了一个全新的喹诺酮类兽药残留的快速检测方法，简单易操作的分析过程，使人为干预因素减少，方法的回收率和精密度显著提高，同时该技术还具有有机溶剂消耗小，成本低的特点；本发明通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析。可有效监测和应对多种兽药残留的食品安全突发事件，避免和降低多种兽药残留食品安全风险带来的危害。同时，作为一种新的快速检测技术，不仅减少了有毒有害化学试剂的接触，降低了实验的成本，也有利于实验人员的自身健康和安全，达到绿色检测的目的。通过针对多种兽药残留检测的二维液质联用法的项目研究，能提升兽药残留的检测能力，为政府行政部门的分析决策提供先进技术支撑。
附图说明
图1为本发明的三柱二维液质联用工作原理图；
图2为不同流动相比例下的色谱图(其中2-a为纯水；2-b为5％甲醇+0.1％甲酸水；2-c为10％pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液水溶液；2-d为pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液；2-e为空白鸡肉样品)；
图3为采用PH＝7.4磷酸盐缓冲溶液作为流动相时的一维色谱图；
图4为鸡肉样品中8种喹诺酮类药物的MRM谱图(添加水品为4μg/kg)。
图中：1-四元泵，2-自动进样器，3-一维色谱柱，4-紫外检测器，5-左切换阀，6-右切换阀，7-二维色谱柱，8-富集柱，9-二元泵，10-质谱检测器。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所用的的仪器、试剂与材料如下：ACQUITY Xevo TQ-S液质联用仪(美国Waters公司)，配有电喷雾离子化源(ESI源)和Masslynx数据处理系统；U3000+超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Turbo Vap LV自动氮吹浓缩仪(上海Biotage公司)；KS 4WOIC低温摇床(德国IKA公司)；Multifuge X1台式离心机(美国ThermoFisher Scientific公司)；MS3涡旋混合器(广州依科公司)；KH-500DV超声波清洗器(昆山禾创超声仪器)；
所用的药品如下：诺氟沙星对照品(批号：130450-201206，含量99.5％，中国食品药品检定研究院)、依诺沙星对照品(批号：0452-9901，含量91.1％，中国药品生物制品检定所)、环丙沙星对照品(批号：R172G005，含量98.0％，CNW)、洛美沙星对照品(批号：130452-200902，含量90.3％，中国药品生物制品检定所)、氧氟沙星对照品(批号：130454-201206，含量99.5％，中国食品药品检定研究院)、马坡沙星对照品(批号：40729，含量99.0％，Dr.E)、盐酸沙氟沙星对照品(批号：20629，含量95％，Dr.E)、奥比沙星对照品(批号：20330，含量99％，Dr.E)；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯(德国Merck公司)；氢氧化钠、磷酸二氢钾均为分析纯(上海沃凯生物技术有限公司)；试验用水为超纯水；微孔滤膜(0.22μm)。
如图1-4所示，本发明的一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，包括如下步骤：
1)混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.1mL1.0mg/mL的8种喹诺酮类药物诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星、马坡沙星、沙氟沙星和奥比沙星储备液至10mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1mL混合液至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容，制成1mg/L的混合标准品工作溶液，于4℃下保存备用；
2)样品溶液的制备：本发明的鸡肉制品使用前先进行前处理：取大于500g的可食用部分，采用高速粉碎机混匀，于-18℃下保存；取处理后的待测鸡肉制品，置50mL高速离心管中，精密加入乙腈20mL，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10％甲醇水溶液复溶，制得样品溶液备用；
该步骤中对样品前处理条件进行了优化：本发明实验中选用甲醇、乙腈等提取溶剂进行试验，用高效液相色谱联用质谱仪分析。通过对比实验数据，乙腈的提取效果优于甲醇，且加入的甲酸含量对提取效果影响不大，为了简化实验步骤，以及氮吹方便，拟选用100％乙腈作为本实验提取液，提取溶剂用量经过试验比较，考察10、15、20mL、25mL提取溶剂，进行1-3min匀浆提取，回收率20mL最优，选用25mL与20mL回收率相差不大，且提取次数对回收率影响不大，本发明实施例中选择20mL提取溶剂进行2min匀浆提取；
3)线性溶液的制备：称取不含喹诺酮类药物的鸡肉制品，置50mL高速离心管中，精密加入20mL乙腈溶液，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL复合溶剂10％甲醇水溶液复溶，以0.22μm的滤膜过滤过滤后制得空白基质溶液，精密吸取不同量的步骤1)制得的混合标准品工作溶液，由空白基质溶液稀释得到各喹诺酮药物浓度分别为4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；
4)空白溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的样品，置50mL高速离心管中，精密加入20mL乙腈溶剂，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10％甲醇水溶液复溶，制得空白溶液，供色谱测定；
5)加标回收试验样品溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的鸡肉样品，置50mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1)制得的混合标准品工作溶液，获得检出限为1ng/mL、定量限为3ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入20mL复合溶剂，高速匀浆1-3min，于4000-5000r/min离心4-6min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10％甲醇水溶液复溶，制得加标回收试验样品溶液，供色谱测定；
6)用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液，本发明采用的三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现喹诺酮类药物残留的在线净化，具体过程下如：
a进样过程：如图1所示，本发明测定时进样过程如下：在四元泵1的作用下，由自动进样器2分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向一维色谱柱3进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，结果由紫外检测器4检测，左切换阀5和右切换阀6在0-5.5min保持初始状态，即均处于位置2，左切换阀5的2号位和3号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀亦是2号位与3号位相通，切至废液的状态；在5.5-13.5min左切换阀5切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱8中进行富集，在13min左切换阀5切换至位置2，二元泵9将富集柱8上的目标化合物反冲至二维色谱柱7上进行分离，右切换阀6位置不变，利用二元泵9流动相将富集柱8上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在18.5min时右切换阀6切换至位置1，即右切换阀6的2号位与1号位相通，进入质谱检测器10进行分析；获得典型色谱图；
本发明的色谱和质谱条件如下：
6.1)一维液相色谱条件
色谱柱：凝胶柱4.6×150mm，5μm，
Figure BDA0002425121270000121
流动相为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；流速为0.35mL/min；富集柱：XBridge C8 Direct Connect HP 10μm；
本发明在该步骤对一维凝胶柱色谱流动相选择进行优化，具体如下：本实验选择了纯水、5％甲醇+0.1％甲酸水、10％pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液水溶液、pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液六种流动相进行实验喹诺酮类药物的一维条件摸索，通过实验，发现采用采用纯水作为流动相时，在30min未出峰，如图2-a所示；采用5％甲醇+0.1％甲酸水出峰过早，与基质杂质峰重合，不适用于杂质分离，如图2-b所示；采用10％pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液水溶液为流动相时，各目标化合物出峰时间不够聚拢，不利于化合物的整体切换，如图2-c所示；采用pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液为流动相时，各目标物出峰时间集中在7.5-10.0min之间，适合目标化合物与基质杂质峰分离，且集中在7.5-10.5min出峰，利于化合物的整体切换如图2-d所示；空白鸡肉样品(基质干扰)在7.5min前出峰，如图2-e所示；从上图对比可以看出，采用10％pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液水溶液和pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液作为流动相，与目标物有了较好的分离，同时色谱峰良好，有利于二维色谱柱切换入质谱的时间选择；但从图2-c和图2-d可以看出，降低缓冲液浓度，目标化合物的聚拢效果不如pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，效果不是很理想，故选用pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液为本实验一维色谱流动相；
该步骤中，本发明还对柱切换时间进行了选择，具体为：使用超高效液相色谱串联紫外检测器的技术，确认阀切换的时间(在U3000超高效液相色谱仪完成实验条件摸索)。准确称取5g空白样品，置于50mL离心管中，按照试验方法步骤进行前处理，所得基质液分别加入混标储备液适量，如图3所示，0-7min保持初始状态，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，在7-10.5min，将目标化合物切换至富集柱中进行富集，在10.5min，二元泵将富集柱上的目标化合物反冲至二维色谱柱上进行分离，此时利用二元泵流动相将富集柱上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，最后切换阀进入检测器进行分析；
本发明还对基质效应的消除进行分析：分子排阻色谱法也称为空间排阻色谱(SEC)和凝胶色谱法；多孔凝胶作为固定相的独特性是用于分离基质干扰和目标化合物，第一维色谱用凝胶色谱法使分子的大小进行分离，大分子基质分子先出来，然后目标化合物出来之后。与其他色谱模式不同，SEC凝胶色谱不依赖分析物之间的化学作用，可以依靠分子量的大小进行分离，排除多种蛋白质、磷脂等的干扰。并且流动相没有有毒有机试剂，而是用了水相作为流动相，绿色环保。采用全扫描法对试剂空白和基质空白的分子量为500-1500基质干扰物质进行全扫描对比，来评估整个体系的净化效果。结果显示试剂空白(水)的全扫描图和样品基质的全扫描图的离子响应基本一致。对试剂空白和基质空白的进行184(磷脂类分子)子离子扫描，经过凝胶柱进行对比评估整个体系的净化效果。结果显示试剂空白(水)的子离子扫描图和样品基质的子离子扫描图的离子响应基本一致。说明净化效果很好。对试剂空白和基质空白的进行184(磷脂类分子)子离子扫描，不经过凝胶柱，进行对比评估整个体系的净化效果。结果显示试剂空白(水)的子离子扫描图明显响应低于样品基质的子离子扫描图的离子响应。
6.2)二维液相条件色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱2.1×50mm，1.7μm；流动相A相为0.1％甲酸水，流动相B相为0.1％甲酸甲醇；梯度洗脱，其洗脱程序时间表如表1所示；柱温为35℃；进样量为5μL；
表1梯度洗脱时间表
Figure BDA0002425121270000151
6.3)液相色谱中的左切换阀、右切换阀在进样分析过程中左切换阀、右切换阀切换过程如表2所示：
表2左切换阀、右切换阀切换过程表
Figure BDA0002425121270000161
表2中不同位置切换阀流路走向如下：左切换阀位置1：1～2，3～4，5～6；左切换阀位置2：2～3，4～5，6～1；右切换阀位置1：1～2；右切换阀位置2：2～3；
6.3)质谱条件
离子源为电喷雾离子源，正离子模式，ESI+；毛细管电压为3.0kV；离子源温度为150℃；脱溶剂气为N2；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流速为800L/h；锥孔流速为150L/h；碰撞气为Ar；扫描方式为多反应监测，8种喹诺酮类化合物因含有羟基等多电子集团而适合在ESI源的正离子模式下形成[M+H]+准分子离子，以此为母离子；用10μL/min的流速向质谱系统输入1mg/L混合标准溶液，确定8种喹诺酮类抗菌药物的最佳质谱条件，包括定量离子对、定性离子对、喷雾电压、碰撞能量等质谱参数，得到8种喹诺酮类药物的多反应监测质谱参数如表3所示。
表3 8种喹诺酮类药物的多反应监测质谱参数表
Figure BDA0002425121270000171
备注：表3中的*为定性离子；
b曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
方法的线性范围和检出限：采用基质加标工作曲线进行外标法定量。使用空白基质，采用不同浓度的标准溶液进行加标，按上述方法进行提取、浓缩，并进行定容、检测，得到基质加标工作曲线。实验表明，在4.0～100.0ng/mL范围内，8种喹诺酮类药物的线性方程相关系数均大于0.994，检出限(LOD)信噪比均大于3。8种喹诺酮类药物的线性方程、相关系数、LOD的结构见表4所示。
表4 8种喹诺酮类药物的检出限和回归方程和相关系数
Figure BDA0002425121270000181
以线性溶液中的目标化合物峰面积定量，得到曲线方程A＝aC+b，
式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；
c结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一喹诺酮类药物的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该喹诺酮类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C＝(A-b)/a
式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积；
a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120％，证明该检测方法可行；
方法的回收率和精密度的计算：在空白鸡肉样品中添加喹诺酮类标准溶液，分别添加3个不同浓度水平的混合标准溶液，每个水平重复测定，采用外标法进行定量，计算回收率和精密度。图4位鸡肉中8种喹诺酮类药物的MRM谱图。结果表明，本方法8种药物的回收率范围为92.5％～109.7％，RSD都小于9.2％(见表5)，表明本方法有良好的准确度和精密度，满足喹诺酮类药物检测的要求。
表5鸡肉样品中8种喹诺酮类药物的灰色收率和精密度
Figure BDA0002425121270000191
Figure BDA0002425121270000201
e实际样品检测
为了位验证该方法的可靠性，对67批市售鸡肉进行喹诺酮类药物检测，氧氟沙星检出2批次，与国标检测方法结果一致。
本文首次将三柱二维凝胶色谱-串联质谱联用技术应用于动物源性食品中喹诺酮类药物的快速、高效、灵敏的检测，方法前处理简单，实现在线净化。利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰。利用在线柱切换液相-质谱联用技术，实现喹诺酮类药物残留在线净化目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，解决了传统药物残留分析技术中前处理方法操作繁琐、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证以及多种药物同时分析时很难满足待测药物均取得很好的定性定量效果的问题，将实验人员从日益繁重的检测任务解脱出来，方法使用较少的有机试剂，检测周期短，相对于其他方法具有绿色环保，快速、准确等特点。建立了一个全新的喹诺酮类兽药残留的快速检测方法，简单易操作的分析过程，使人为干预因素减少，方法的回收率和精密度显著提高，同时该技术还具有有机溶剂消耗小，成本低的特点。通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析。可有效监测和应对多种兽药残留的食品安全突发事件，避免和降低多种兽药残留食品安全风险带来的危害。同时，作为一种新的快速检测技术，不仅减少了有毒有害化学试剂的接触，降低了实验的成本，也有利于实验人员的自身健康和安全，达到绿色检测的目的。通过针对多种兽药残留检测的二维液质联用法的项目研究，能提升兽药残留的检测能力，为政府行政部门的分析决策提供先进技术支撑。

Claims (6)

1.一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.1mL1.0mg/mL的8种喹诺酮类药物诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星、马坡沙星、沙氟沙星和奥比沙星储备液至10mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1 mL混合液至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容，制成1 mg/L的混合标准品工作溶液，于4℃下保存备用；
2）样品溶液的制备：取待测鸡肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入乙腈20mL，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10%甲醇水溶液复溶，制得样品溶液备用；
3）线性溶液的制备：称取不含喹诺酮类药物的鸡肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入20 mL乙腈溶液，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL复合溶剂复溶，过滤后制得空白基质溶液，精密吸取不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液，由空白基质溶液稀释得到各喹诺酮药物浓度分别为4ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；
4）空白溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入20mL乙腈溶剂，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10%甲醇水溶液复溶，制得空白溶液，供色谱测定；
5）加标回收试验样品溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的鸡肉样品，置50 mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液，获得检出限为1ng/mL、定量限为3 ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为10 ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入20mL复合溶剂，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10%甲醇水溶液复溶，制得加标回收试验样品溶液，供色谱测定；
6）用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液
a进样过程：由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内，
色谱和质谱条件
1）一维液相色谱条件
色谱柱：凝胶柱 4.6×150 mm，5 μm，150 Å；流动相为pH=7.4的磷酸盐缓冲液；流速为0.35 mL/min；富集柱：XBridge C8 Direct Connect HP 10 μm；
2 ）二维液相条件色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1×50 mm，1.7 μm；流动相A相为0.1 %甲酸水，流动相B相为0.1 %甲酸甲醇；梯度洗脱；柱温为35 ℃；进样量为5 μL，梯度洗脱条件如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
3） 质谱条件
离子源为电喷雾离子源，正离子模式，ESI+；毛细管电压为3.0 kV；离子源温度为150℃；脱溶剂气为N2；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流速为800 L/h；锥孔流速为150 L/h；碰撞气为Ar；扫描方式为多反应监测；
b 曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
以线性溶液中的目标化合物峰面积定量，得到曲线方程A=aC+b，
式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；
c 结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一喹诺酮类药物的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该喹诺酮类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C=(A-b)/a
式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积；
a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120%，证明该方法可行。
2.根据权利要求1所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于外标法定量。
3.根据权利要求1所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于步骤3）中的复合溶剂为10%甲醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于步骤3）中的过滤采用0.22 μm的滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现喹诺酮类药物残留的在线净化。
6.根据权利要求1所述的测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于测定的进样过程如下：在四元泵（1）的作用下，由自动进样器（2）分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向一维色谱柱（3）进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，结果由紫外检测器（4）检测，左切换阀（5）和右切换阀（6）在0-5.5min保持初始状态，即均处于位置2，左切换阀（5）的2号位和3号位相通，基质干扰物排至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀亦是2号位与3号位相通，切至废液的状态；在5.5-13.5 min左切换阀（5）切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱（8）中进行富集，在13 min左切换阀（5）切换至位置2，二元泵（9）将富集柱（8）上的目标化合物反冲至二维色谱柱（7）上进行分离，右切换阀（6）位置不变，利用二元泵（9）流动相将富集柱（8）上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在18.5 min时右切换阀（6）切换至位置1，即右切换阀（6）的2号位与1号位相通，进入质谱检测器（10）进行分析；获得典型色谱图。
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