CN114236005B - 一种检测动物性食品中瘦肉精的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品安全检测技术领域，公开了一种检测动物性食品中瘦肉精的方法。本发明方法通过取样、粗提处理，将得到的样品粗提液采用三相电膜萃取技术进行萃取；萃取结束后检测接收相中瘦肉精的浓度。本发明在采用液相色谱‑质谱检测样品前，简化了传统对动物性食品复杂基质的前处理方法，使用的三相电膜萃取萃取过程同时完成了萃取分离、浓缩富集和净化过程。因此，本发明方法具有样品净化能力强、分析速度快、富集倍数高、灵敏度高、检出限低、环境友好的特点，更适于常规检测分析，在食品检测领域具有较为广泛的应用前景。

Description

一种检测动物性食品中瘦肉精的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测动物性食品中瘦肉精的方法。
背景技术
瘦肉精如果作为饲料添加剂使用，极易在动物性产品中大量累积。人们食用瘦肉精残留量过多的动物性食品，可能会出现头晕头疼、心跳加速、肌肉震颤等症状，严重危害人类健康。因而，诸多国家颁布了关于猪肉中β-受体激动剂的禁令条例。克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺是动物性产品中市场常见的残留瘦肉精及其主要替代品。近年来，农产品质量安全例行监测工作中发现，在多地区的牛、羊肉中也监测到了“瘦肉精”的残留，各级食药监管部门对牛、羊肉中瘦肉精的监督抽检高度重视。因此，开发一种检测动物性食品中瘦肉精的新方法对保障食品安全具有重要意义。
目前用于检测动物性食品中瘦肉精的方法主要有表面增强拉曼技术、液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法等，其中高效液相色谱串联质谱法具有准确度高、灵敏度高、可实现多种物质的同时检测等优势，已成为主要的检测手段。但由于牛肉、羊肉、猪肉和猪肝等动物性食品基质成分复杂、油脂含量高，痕量检测结果受基质干扰较为严重。因此，在瘦肉精的分析检测前需要对动物性食品样品进行预处理以消除复杂基质的干扰，而选择净化能力强和选择性高的样品前处理方法对固体基质样品中瘦肉精的准确检测尤为重要。固体基质通常包括如动物的肝脏、肌肉、毛发等。固体基质的前处理方法除经典的液液萃取方法外，用的较多的有固相萃取、双相渗析膜分离技术、基质固相分散萃取和超临界液体萃取等。国内外研究表明，瘦肉精的前处理方法多采用固相萃取法，该方法能够降低样品基质的干扰，但存在操作繁琐、假阳性高以及萃取率较低等问题，并且商品化的固相萃取小柱成本较高。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种检测动物性食品中瘦肉精的方法。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种检测动物性食品中瘦肉精的方法，包括以下步骤：
（1）取样：将动物性食品样品均质处理，得到动物性食品分析样品；
（2）粗提：将步骤（1）得到的分析样品与提取剂混合，超声提取分析样品中的瘦肉精；提取后过滤，收集滤液，然后将滤液进行干燥处理，得到样品粗提物；向样品粗提物中加入酸性试剂，搅拌均匀得到样品粗提液；
（3）萃取：以步骤（2）得到的样品粗提液为供体相，采用三相电膜萃取技术萃取样品粗提液中的瘦肉精，萃取完成后检测三相电膜萃取中接收相中瘦肉精的浓度。
优选地，步骤（3）中所述三相电膜萃取技术中采用的膜为高分子多孔膜，所述高分子多孔膜上负载有萃取溶剂；所述高分子多孔膜为聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或聚偏氟乙烯膜；所述萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与磷酸酯类萃取剂的混合溶液；所述磷酸酯类萃取剂为二（2-乙基己基）磷酸酯、三（2-乙基己基）磷酸酯、二（2-乙基己基）亚磷酸酯、磷酸三丁酯中的一种或两种。
优选地，所述2-硝基苯辛醚与磷酸酯类萃取剂的混合溶液中磷酸酯类萃取剂的体积百分比为5～35%。
更加优选地，所述高分子多孔膜为聚丙烯纤维膜。
优选地，所述高分子多孔膜孔径0.2 μm，厚度100 μm～200 μm。
优选地，步骤（2）中所述酸性试剂为pH=3～7的缓冲溶液。
更加优选地，步骤（2）中所述酸性试剂为pH=4的磷酸盐缓冲溶液。
优选地，所述接收相为盐酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液中的任意一种。
更加优选地，萃取莱克多巴胺时所述接收相为盐酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液中的任意一种；所述盐酸水溶液浓度为1～100 mmol/L，所述甲酸水溶液浓度为10 mmol/L，所述乙酸水溶液浓度为10 mmol/L，所述三氟乙酸水溶液浓度为10mmol/L。
更加优选地，萃取莱克多巴胺时所述接收相为10 mmol/L的盐酸水溶液。
更加优选地，萃取沙丁胺醇时所述接收相为盐酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液中的任意一种；所述盐酸水溶液浓度为10 mmol/L，所述甲酸水溶液浓度为20 mmol/L，所述乙酸水溶液浓度为20 mmol/L，所述三氟乙酸水溶液浓度为10 mmol/L。
更加优选地，萃取沙丁胺醇时所述接收相为20 mmol/L的甲酸水溶液。
优选地，步骤（2）中所述三相电膜萃取技术中在供体相和接收相之间施加电场的电压为20 V～140 V。
更加优选地，萃取莱克多巴胺时步骤（2）中所述三相电膜萃取技术中在供体相和接收相之间施加电场的电压为40 V～140 V。
更加优选地，萃取沙丁胺醇时步骤（2）中所述三相电膜萃取技术中在供体相和接收相之间施加电场的电压为20 V～120 V。
优选地，所述萃取时间为5 min～40 min。
更加优选地，萃取莱克多巴胺时所述萃取时间为5 min～30 min。
更加优选地，萃取沙丁胺醇时所述萃取时间为5 min～40 min。
优选地，所述提取剂为甲醇或乙腈。
更加优选地，步骤（1）中所述提取剂为乙腈。
更加优选地，所述超声条件为25℃，超声电功率100%。
优选地，所述瘦肉精为克伦特罗、莱克多巴胺或沙丁胺醇。
更加优选地，所述瘦肉精为莱克多巴胺或沙丁胺醇。
优选地，步骤（1）中所述样品为猪肉、猪肝、羊肉、牛肉中的任意一种或几种。
本发明采用三相电膜萃取技术萃取样品粗提液中的瘦肉精的其中一种操作方法为：
（a）将高分子多孔膜固定在两端开口的中空管的其中一端，然后将萃取溶剂均匀涂抹于所述高分子多孔膜至少一侧，形成支撑液膜；所述高分子多孔膜与中空管形成的空间作为接收相容器，向接收相容器内腔中注入接收相；
（b）在供体相容器中加入样品粗提液，分别向供体相和接收相中插入工作电极和对电极，然后将接收相容器置于供体相容器中，并使所述支撑液膜与样品粗提液液面刚好接触；
（c）将工作电极与电源正极连接，将对电极与电源负极连接，向工作电极和对电极施加电压形成电场，在电场作用下萃取供体相中的瘦肉精。
本发明采用三相电膜萃取技术萃取样品粗提液中的瘦肉精的另外一种操作方法为：
（a）将中空纤维膜一端封闭，在中空纤维膜上负载萃取溶剂；所述中空纤维膜内部空间作为接收相容器，向接收相容器内腔中注入接收相；
（b）在供体相容器中加入样品粗提液，分别向供体相和接收相中插入工作电极和对电极，然后将接收相容器置于供体相容器中，并使所述中空纤维膜封闭端浸没在样品粗提液中；
（c）将工作电极与电源正极连接，将对电极与电源负极连接，向工作电极和对电极施加电压形成电场，在电场作用下萃取供体相中的瘦肉精。
更加优选地，步骤（3）中所述检测用仪器为高效液相色谱串联质谱仪。
更加优选地，所述高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18 (3.0× 100 mm, 1.8 μm)；柱温：40°C；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：0～4.5 min时，流动相为60% A-40% B；4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70%A-30% B；4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60% A-40%B。
更加优选地，所述质谱测定的条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描MRM；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；莱克多巴胺的定量离子对为302/164，碰撞电压为10 V，Fragmentor电压为100 V；沙丁胺醇的定量离子对为240/222，碰撞电压为8 V，Fragmentor电压为100 V。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明通过在电膜萃取装置上施加电场作用，联合有机萃取剂对瘦肉精化合物的选择作用以及高分子多孔膜对大分子化合物的阻隔作用，将瘦肉精的萃取由被动的跨膜扩散转化为主动的定向迁移，大大提高了萃取过程的传质速率，缩短萃取时间，实现了供体相溶液中瘦肉精的快速分离、富集；同时也完成了样品的净化过程，有效避免了萃取技术受动物性食品中基质干扰的难题。
（2）本发明在萃取瘦肉精时，采用酸性试剂作为溶剂来制备供体相溶液——样品粗提物溶液，因为酸性溶剂能够使瘦肉精全部以单电荷离子形式存在，有利于其在电场迁移作用下被萃取分离；同时，采用盐酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液作为接收相，目的是基于电膜萃取过程中电场迁移作用是主要的传质驱动力，酸性溶剂能够使瘦肉精全部以正离子形式存在，有利于其在电场迁移作用下被萃取到接收相中。
（3）本发明将萃取溶剂负载在高分子聚丙烯多孔膜上，萃取溶剂用量少，仅需几微升，避免了传统萃取技术有机溶剂消耗量大、对环境有害的问题；而且，液相萃取过程与反萃取过程同时进行，有效提高了萃取效率。且在本发明的实施例中，萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的混合萃取溶剂（80:20，v/v）时，对莱克多巴胺和沙丁胺醇均有较好的萃取效果，适合样品中瘦肉精的检测，大大简化了实验过程。
（4）本发明提供了一种动物性食品中瘦肉精的样品前处理方法，与液相色谱串联质谱技术联用，建立了一种检测动物性食品中瘦肉精残留量的方法。本方法具有较宽的线性范围（1～1000 ng/mL），较低的检出限（0.05～0.07 ng/mL）和定量限（0.17～0.23 ng/mL），不同浓度下的加标回收率为76.4～99.2%，重现性好，稳定性高，日内和日间平均偏差均小于15%，适用于动物性食品中瘦肉精的准确、高灵敏检测。
（5）本发明与固相萃取技术相比，装置构造简单、易得，成本低廉；无需额外制备吸附剂材料，操作简便。此外，本发明的检测方法传质效率高，花费时间相对不长；整个萃取过程操作方便省时，更适合批量萃取；且本方法中电膜萃取装置可容纳的接收相体积范围更大，可容纳几微升至几十毫升的接收液，可满足多种检测需求，适合不同样品中瘦肉精的检测，更适于常规检测分析，在食品检测领域具有较为广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中三相电膜萃取装置的示意图，其中，1为对电极，2为接收相，3为负载有机萃取溶剂的聚丙烯高分子多孔膜，4为供体相，5为工作电极。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例结合附图，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
（一）三相电膜萃取莱克多巴胺的萃取条件优化
实施例1：萃取溶剂的优化实验
为了探讨不同的萃取溶剂对瘦肉精莱克多巴胺分离富集效果的影响，本发明以含有1 mg/L莱克多巴胺标准品溶液作为供体相，进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中莱克多巴胺的浓度，得到莱克多巴胺的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例1-1～1-6和对比例1-1的实验，具体参数值如表1所示。
实施例1-1
一种检测瘦肉精莱克多巴胺的方法，包括以下步骤：
（1）配制1 mg/L莱克多巴胺标准品溶液：取100 mg/L 的莱克多巴胺标准品，加入pH=4的10 mmol/L磷酸盐缓冲液，配制成1 mg/L莱克多巴胺标准品溶液，将此作为供体相4，进行后续的三相电膜萃取。
（2）三相电膜萃取装置的构建与萃取：
（a）取1 mL移液枪吸头，将孔径为0.2 μm，厚度为200 μm的聚丙烯高分子多孔膜3剪成1×1 cm大小，在高温下将聚丙烯高分子多孔膜粘附在枪头的底部，将枪头另一端剪去部分长度，将其作为接收相容器；
（b）将10 μL有机萃取溶剂涂覆在枪头末端的多孔膜上形成支撑液膜，所述有机萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的混合溶液，混合溶液中2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的体积比为80:20；
（c）向接收相容器中加入200 μL接收相2，所述接收相2为10 mmol/L盐酸水溶液；将2 mL离心管作为供体相容器，加入1 mL供体相4，所述供体相4为步骤（1）制备的1 mg/L莱克多巴胺标准品溶液；向供体相4中插入工作电极5，向接收相2中插入对电极1，将装有接收相2和对电极1的接收相容器插入供体相容器中，使供体相溶液的液面与支撑液膜刚好接触，分别将工作电极5和对电极1与电泳仪电源的正极和负极连接，得到组装好的三相电膜萃取装置（如图1所示）。
（3）分离富集：将离心管置于恒温混匀仪上，设置恒温混匀仪的温度为室温，转速为1000 rpm，电泳仪电源的电压为80 V，时间为20min，同时启动电泳仪电源和恒温混匀仪，在外加电场的驱动和振荡辅助的作用下，进行莱克多巴胺的萃取。
（4）分析检测：萃取结束后，取出接收相容器内的溶液直接进高效液相色谱串联质谱仪，检测莱克多巴胺的含量。
高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18 (3.0 × 100 mm, 1.8μm)；柱温：40°C；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇。液相色谱采用梯度洗脱方式，洗脱条件为：0～4.5 min时，流动相为60%A-40% B；4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70%A-30% B；4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60% A-40% B。
质谱测定的条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描（MRM）；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；莱克多巴胺的定量离子对为302/164，碰撞电压为10 V，Fragmentor电压为100 V。
实施例1-2～1-6和对比例1-1的内容与实施例1-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（2）中采用的有机萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的混合溶液，混合溶液中2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的体积比分别为95:5、90:10、85:15、75:25、70:30、100:0。采用高效液相色谱串联质谱仪检测的接收相中莱克多巴胺的浓度，计算莱克多巴胺的萃取率，具体计算公式如下：
莱克多巴胺萃取率（%）=(CA×VA)/(CDi×VD) × 100%
其中，CA指的是萃取结束后接收相中莱克多巴胺的浓度，CDi指的是供体相中莱克多巴胺的初始浓度，VA和VD分别是指接收相和供体相的体积。
由表1可知，随着混合萃取溶剂中二（2-乙基己基）磷酸酯体积百分比的增加，瘦肉精莱克多巴胺的萃取率呈现先升后降的趋势，当混合萃取溶剂中2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的体积比为80:20时，莱克多巴胺的萃取率达到最大，为80.8%。但仅用2-硝基苯辛醚时，不能萃取出莱克多巴胺，这是因为莱克多巴胺的极性相对较大，与2-硝基苯辛醚亲和力较低。其中，其他混合萃取溶剂也能萃取出莱克多巴胺，可适用于目的不同的实验条件。但为优化瘦肉精莱克多巴胺的萃取率，后续实验均以体积比为80:20的2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯混合萃取溶剂作为优选萃取溶剂。
实施例2：接收相溶剂的优化实验
为了探讨不同的接收相溶剂对瘦肉精莱克多巴胺分离富集效果的影响，本发明以含有1mg/L莱克多巴胺标准品溶液作为供体相，以不同的溶液作为接收相进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中莱克多巴胺的浓度，得到莱克多巴胺的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例1-1、实施例2-1～2-5的实验。
实施例2-1～2-5的内容与实施例1-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（2）中采用的接收相分别为10 mmol/L乙酸水溶液、10 mmol/L甲酸水溶液、10 mmol/L三氟乙酸水溶液、1mmol/L盐酸水溶液、100 mmol/L盐酸水溶液。具体参数值如表2所示。
由表2可知，当接收相分别为1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L盐酸水溶液时，瘦肉精莱克多巴胺的萃取率呈现先升后降的趋势，因此优选10 mmol/L盐酸水溶液为接收相。将实施例1-1的萃取率与实施例2-1～2-3的相比较后发现，与10 mmol/L乙酸水溶液、10mmol/L甲酸水溶液、10 mmol/L三氟乙酸水溶液相比，当接收相为10 mmol/L盐酸水溶液时，莱克多巴胺的萃取率更高，这是因为在支撑液膜中质子化的分析物与扩散的乙酸离子、甲酸离子等形成了离子对，从而抑制了传质的过程。因此，后续实验优选10 mmol/L盐酸水溶液为接收相溶剂。
实施例3：萃取电压的优化实验
为了探讨不同的萃取电压对瘦肉精莱克多巴胺分离富集效果的影响，本发明以含有1mg/L莱克多巴胺标准品溶液作为供体相，在不同的萃取电压下进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中莱克多巴胺的浓度，得到莱克多巴胺的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例1-1、实施例3-1～3-5、对比例3-1的实验。
实施例3-1～3-5和对比例3-1的内容与实施例1-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（3）中采用的电泳仪电源的电压分别为40 V、60 V、100 V、120 V、140 V、0 V。具体参数值如表3所示。
由表3可知，随着萃取电压由40 V增加至140 V，瘦肉精莱克多巴胺的萃取率呈现先升后降的趋势，由74.8%升至80.8%，后降至72.5%，远高于未加电压的萃取率（37.7%），这主要是因为在一定范围内增加萃取电压能够大大促进传质过程，促进莱克多巴胺的萃取，但过高的萃取电压会导致电解现象发生，使体系电流升高，体系不稳定，反而会影响莱克多巴胺的萃取。因此，后续实验萃取电压优选为80 V。
实施例4：萃取时间的优化实验
为了探讨不同的萃取时间对瘦肉精莱克多巴胺分离富集效果的影响，本发明以含有1 mg/L莱克多巴胺标准品溶液作为供体相，在不同时间下进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中莱克多巴胺的浓度，得到莱克多巴胺的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例1-1、实施例4-1～4-5的实验。
实施例4-1～4-5的内容与实施例1-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（3）中采用的萃取时间分别为5 min、10 min、15 min、25min、30 min。具体参数值如表4所示。
由表4可知，随着萃取时间的增加，瘦肉精莱克多巴胺的萃取率呈现先升后降的趋势，当萃取时间为20 min时达到最高，这主要是因为当萃取体系达到平衡后继续延长萃取时间反而会导致莱克多巴胺被反萃取到膜相或供体相，使其回收率下降。因此，后续实验萃取时间优选为20 min。
（二）三相电膜萃取沙丁胺醇的萃取条件优化
实施例5：萃取溶剂的优化实验
为了探讨不同的萃取溶剂对瘦肉精沙丁胺醇分离富集效果的影响，本发明以含有1mg/L沙丁胺醇标准品溶液作为供体相，进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中沙丁胺醇的浓度，得到沙丁胺醇的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例5-1～5-5和对比例5-1的实验，具体参数值如表5所示。
实施例5-1
一种检测瘦肉精沙丁胺醇的方法，包括以下步骤：
（1）配制1 mg/L沙丁胺醇标准品溶液：取100 mg/L的沙丁胺醇标准品，加入pH=4的10 mmol/L磷酸盐缓冲液，配制成1 mg/L沙丁胺醇标准品溶液，将此作为供体相4，进行后续的三相电膜萃取。
（2）三相电膜萃取装置的构建与萃取：
（a）取1 mL移液枪吸头，将孔径为0.2 μm，厚度为200 μm的聚丙烯高分子多孔膜3剪成1×1 cm大小，在高温下将聚丙烯高分子多孔膜粘附在枪头的底部，将枪头另一端剪去部分长度，将其作为接收相容器；
（b）将10 μL有机萃取溶剂涂覆在枪头末端的多孔膜上形成支撑液膜，所述有机萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的混合溶液，混合溶液中2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的体积比为80:20；
（c）向接收相容器中加入200 μL接收相2，所述接收相2为20 mmol/L 甲酸水溶液；将2 mL离心管作为供体相容器，加入1 mL供体相4，所述供体相4为步骤（1）制备的1 mg/L沙丁胺醇标准品溶液；向供体相4中插入工作电极5，向接收相2中插入对电极1，将装有接收相2和对电极1的接收相容器枪头插入供体相容器中，使供体相溶液的液面与支撑液膜刚好接触，分别将工作电极5和对电极1与电泳仪电源的正极和负极连接，得到组装好的三相电膜萃取装置（如图1所示）。
（3）分离富集：将离心管置于恒温混匀仪上，设置恒温混匀仪的温度为室温，转速为1000 rpm，电泳仪电源的电压为80 V，时间为30min，同时启动电泳仪电源和恒温混匀仪，在外加电场的驱动和振荡辅助的作用下，进行沙丁胺醇的萃取。
（4）分析检测：萃取结束后，取出接收相容器内的溶液直接进高效液相色谱串联质谱仪，检测沙丁胺醇的含量。
高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18 (3.0 × 100 mm, 1.8μm)；柱温：40°C；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇。液相色谱采用梯度洗脱方式，洗脱条件为：0～4.5 min，流动相为60%A-40% B；4.5～4.7 min，流动相从60% A-40% B变化为70%A-30% B；4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60% A-40% B。
质谱测定的条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描（MRM）；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；沙丁胺醇的定量离子对为240/222，碰撞电压为8 V，Fragmentor电压为100 V。
实施例5-2～5-5和对比例5-1的内容与实施例5-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（2）中采用的有机萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的混合溶液，混合溶液中2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的体积比分别为95:5、90:10、85:15、75:25、100:0。采用高效液相色谱串联质谱仪检测的接收相中沙丁胺醇的浓度，计算沙丁胺醇的萃取率，具体计算公式如下：
沙丁胺醇萃取率（%）=(CA×VA)/(CDi×VD) × 100%
其中，CA指的是萃取结束后接收相中沙丁胺醇的浓度，CDi指的是供体相中沙丁胺醇的初始浓度，VA和VD分别是指接收相和供体相的体积。
由表5可知，随着混合萃取溶剂中二（2-乙基己基）磷酸酯体积百分比的增加，瘦肉精沙丁胺醇的萃取率呈现先升后降的趋势，当混合萃取溶剂中2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的体积比为80:20时，沙丁胺醇的萃取率达到最大，为90.3%。但仅用2-硝基苯辛醚时，不能萃取出沙丁胺醇。这是因为沙丁胺醇的极性相对较大，与2-硝基苯辛醚亲和力较低。其中，其他混合萃取溶剂也能萃取出沙丁胺醇，可适用于目的不同的实验条件。但为优化瘦肉精沙丁胺醇的萃取率，后续实验均以体积比为80:20的2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯混合萃取溶剂作为优选萃取溶剂。
实施例6：接收相溶剂的优化实验
为了探讨不同的接收相溶剂对瘦肉精沙丁胺醇分离富集效果的影响，本发明以含有1 mg/L沙丁胺醇标准品溶液作为供体相，以不同的溶液作为接收相进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中沙丁胺醇的浓度，得到沙丁胺醇的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例5-1、实施例6-1～6-3的实验。
实施例6-1～6-3的内容与实施例5-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（2）中采用的接收相分别为10 mmol/L三氟乙酸水溶液、10 mmol/L盐酸水溶液、20 mmol/L乙酸水溶液。具体参数值如表6所示。
由表6可知，20 mmol/L甲酸水溶液为接收相溶剂时沙丁胺醇的萃取率最高，这是因为盐酸水溶液作为接收相溶液时，电膜萃取过程中可能由于双电层的影响导致接收相的pH变化，进而影响沙丁醇胺萃取率；乙酸水溶液作为接收相时，支撑液膜中质子化的分析物与扩散的乙酸离子之间容易形成了离子对，从而抑制分析物的传质；三氟乙酸水溶液为接收相时体系电流偏高，体系不稳定。因此，后续实验优选20 mmol/L甲酸水溶液为接收相溶剂。
实施例7：萃取电压的优化实验
为了探讨不同的萃取电压对瘦肉精沙丁胺醇分离富集效果的影响，本发明以含有1mg/L沙丁胺醇标准品溶液作为供体相，在不同的萃取电压下进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中沙丁胺醇的浓度，得到沙丁胺醇的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例5-1、实施例7-1～7-5、对比例7-1的实验。
实施例7-1～7-5和对比例7-1的内容与实施例5-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（3）中采用的电泳仪电源的电压分别为40 V、60 V、100 V、120 V、140 V、0 V。具体参数值如表7所示。
由表7可知，随着萃取电压由40 V增加至120 V，瘦肉精沙丁胺醇的萃取率呈现先升后降的趋势，由45.5%升至90.3%，后降至75.2%，远高于未加电压的萃取率（4.7%），这主要是因为电迁移能促进传质过程，在一定范围内增加萃取电压能够提高沙丁胺醇的萃取率，而过高的萃取电压会导致电解现象的发生，使体系电流升高，表现不稳定，最终影响沙丁胺醇的萃取。因此，后续实验萃取电压优选为80 V。
实施例8：萃取时间的优化实验
为了探讨不同的萃取时间对瘦肉精沙丁胺醇分离富集效果的影响，本发明以含有1mg/L沙丁胺醇标准品溶液作为供体相，在不同时间下进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中沙丁胺醇的浓度，得到沙丁胺醇的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例5-1、实施例8-1～8-4的实验。
实施例8-1～8-4的内容与实施例5-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（3）中采用的萃取时间分别为5 min、10 min、20 min、40min。具体参数值如表8所示。
由表8可知，随着萃取时间的增加，瘦肉精沙丁胺醇的萃取率呈现先升后降的趋势，当萃取时间为30 min时达到最高，这主要是因为当萃取体系达到平衡后继续延长萃取时间反而会导致沙丁胺醇被反萃取到膜相或供体相，表现为回收率下降。因此，后续实验萃取时间优选为30min。
（三）加样回收率试验
分别在上述实施例1-1和实施例5-1优化得到的最佳萃取条件下分离、富集、检测动物性食品中的瘦肉精莱克多巴胺和沙丁胺醇的含量。
实施例9
一种检测动物性食品中莱克多巴胺的方法，包括如下步骤：
（1）样品的粗提取：准确称取5 g动物性食品的样品，切碎后放入50 mL锥形瓶中，向其中加入5 mL提取剂乙腈，超声提取20 min，于3000 rpm下离心10 min，取沉淀物重复提取、离心过程两次，然后合并提取液，得到猪肉样品溶液；将样品溶液经0.22 μm的有机滤膜过滤，然后将滤液在室温下用氮气吹干，得到样品粗提物；向样品粗提物中加入5 mL的pH=410 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液或加标标准溶液进行复溶，得到样品复溶液或加标样品复溶液。所述加标标准溶液为2、50、100 ng/mL三种不同浓度的莱克多巴胺标准溶液（溶剂为pH=4～10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液）。
（2）三相电膜萃取装置的构建与萃取：
（a）取1 mL移液枪吸头，将孔径为0.2 μm，厚度为200 μm的聚丙烯高分子多孔膜剪成1×1 cm大小，在高温下将聚丙烯高分子多孔膜粘附在枪头的底部，将枪头另一端剪去部分长度，将其作为接收相容器；
（b）将10 μL有机萃取溶剂涂覆在枪头末端的多孔膜上形成支撑液膜，所述有机萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与二（2-乙基己基）磷酸酯的混合萃取溶剂（80:20，v/v）；
（c）向接收相容器中加入200 μL接收相2，所述接收相2为10 mmol/L 盐酸水溶液；将2 mL离心管作为供体相容器，加入1 mL供体相4，所述供体相4为步骤（1）制备的样品复溶液或不同加标浓度的样品复溶液；向供体相4中插入工作电极5，向接收相2中插入对电极1，将装有接收相2和对电极1的接收相容器插入供体相容器中，使供体相溶液的液面与支撑液膜刚好接触，分别将工作电极5和对电极1与电泳仪电源的正极和负极连接，得到组装好的三相电膜萃取装置。
（3）分离富集：将离心管置于恒温混匀仪上，设置恒温混匀仪的温度为室温，转速为1000 rpm，电泳仪电源的电压为80 V，时间为20min，同时启动电泳仪电源和恒温混匀仪，在外加电场的驱动和振荡辅助的作用下，进行莱克多巴胺的电膜萃取。
（4）分析检测：萃取结束后，取出接收相容器内的溶液直接采用高效液相色谱串联质谱仪，检测莱克多巴胺的含量。
高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18 (3.0 × 100 mm, 1.8μm)；柱温：40°C；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇。液相色谱采用梯度洗脱方式，洗脱条件为：0～4.5 min时，流动相为60%A-40% B；4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70%A-30% B；4.7-5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60% A-40% B。
质谱测定的条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描（MRM）；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；莱克多巴胺的定量离子对为302/164，碰撞电压为10 V，Fragmentor电压为100 V。
实施例10
一种检测动物性食品中沙丁胺醇的方法的内容与实施例9的基本相同，其不同之处在于：步骤（2）中所述接收相为20 mmol/L甲酸水溶液；步骤（3）中所述萃取时间为30min；步骤（4）中所述质谱测定条件中沙丁胺醇的定量离子对为240/222，碰撞电压为8 V，Fragmentor电压为100 V。
采用高效液相色谱质谱仪测定接收相中莱克多巴胺和沙丁胺醇的浓度时，需要先分别制作莱克多巴胺和沙丁胺醇的标准工作曲线。莱克多巴胺和沙丁胺醇的标准工作曲线制作过程如下：称取5.0 g不含瘦肉精的猪肉样品切碎后放入50 mL锥形瓶中，向其中加入5mL乙腈，超声提取20 min，于3000 rpm下离心10 min，重复两次，合并提取液，得到猪肉样品溶液；将样品溶液经0.22 μm的滤膜过滤，然后将滤液在室温下用氮气吹干，得到样品粗提物；向样品粗提物中加入5 mL的加标标准溶液进行复溶，得到加标样品工作溶液。所述加标标准溶液为莱克多巴胺（或沙丁胺醇）标准品配制成的一系列浓度（1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL）的莱克多巴胺（或沙丁胺醇）标准溶液（溶剂为pH=4～10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液）。按照上述步骤（2）中所述的三相电膜萃取操作对加标样品工作溶液进行萃取，萃取后采用高效液相色谱质谱仪测定接收相中莱克多巴胺（或沙丁胺醇）的色谱图峰面积，绘制莱克多巴胺（或沙丁胺醇）的工作曲线，并得出本发明提出的检测方法的相关性能参数，包括线性范围、线性相关系数、检出限和定量限，如表9所示。
分别按照上述实施例9和实施例10检测莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法，进行实施例9-1～9-16和实施例10-1～10-16的实验，涉及到的具体参数值如表10和表11所示。根据高效液相色谱串联质谱仪测定的实施例9-1～9-16和实施例10-1～10-16接收相容器内的溶液中莱克多巴胺和沙丁胺醇浓度，得到对猪肉、猪肝、羊肉和牛肉样品中莱克多巴胺和沙丁胺醇的检测结果和不同加标水平的样品复溶液中莱克多巴胺和沙丁胺醇的加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果如表10和表11所示。
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综上，本发明的检测方法具有较宽的线性范围（1～1000 ng/mL），较低的检出限（0.05～0.07ng/mL）和定量限（0.17～0.23 ng/mL），不同浓度下的加标回收率为76.4～99.2%，重现性好，稳定性高，日内和日间平均偏差均小于15%，适用于动物性食品中瘦肉精（莱克多巴胺和沙丁胺醇）的准确、高灵敏检测。此外，本发明的检测方法传质效率高，花费时间相对不长；三相电膜萃取装置结构简单易得，组装简易；整个萃取过程操作方便省时，更适合批量萃取；且本方法中三相电膜萃取装置可容纳的接收相体积范围更大，可容纳几微升至几十毫升的接收液，以达到不同的检测目的。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.一种检测动物性食品中瘦肉精的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取样：将动物性食品样品均质处理，得到动物性食品分析样品；所述动物性食品样品为猪肉、羊肉、牛肉中的任意一种或几种；
（2）粗提：将步骤（1）得到的分析样品与提取剂混合，超声提取分析样品中的瘦肉精，提取后过滤，收集滤液，然后将滤液进行干燥处理，得到样品粗提物；向样品粗提物中加入酸性试剂，搅拌均匀得到样品粗提液；所述酸性试剂为pH＝4的磷酸盐缓冲溶液；
（3）萃取：以步骤（2）得到的样品粗提液为供体相，采用三相电膜萃取技术萃取样品粗提液中的瘦肉精，萃取结束后，取出接收相容器内的溶液直接进高效液相色谱串联质谱仪，采用高效液相色谱和质谱分析法检测接收相中瘦肉精的含量；所述瘦肉精为莱克多巴胺或沙丁胺醇；
所述三相电膜萃取技术中采用的膜为高分子多孔膜；所述高分子多孔膜为聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或聚偏氟乙烯膜；
所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18，3.0× 100 mm，1.8 μm；柱温：40℃；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇；液相色谱采用梯度洗脱方式，洗脱条件为：0～4.5 min时，流动相为60% A-40% B，4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70% A-30% B，4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60% A-40% B；
所述质谱分析法的检测条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；莱克多巴胺的定量离子对为302/164，沙丁胺醇的定量离子对为240/222，碰撞电压为10 V或8 V，Fragmentor电压为100 V。
2.根据权利要求1所述的检测动物性食品中瘦肉精的方法，其特征在于，所述高分子多孔膜上负载有萃取溶剂；所述萃取溶剂为2-硝基苯辛醚与磷酸酯类萃取剂的混合溶液；所述磷酸酯类萃取剂为二（2-乙基己基）磷酸酯、三（2-乙基己基）磷酸酯、二（2-乙基己基）亚磷酸酯、磷酸三丁酯中任意一种或几种。
3.根据权利要求2所述的检测动物性食品中瘦肉精的方法，其特征在于，所述2-硝基苯辛醚与磷酸酯类萃取剂的混合溶液中磷酸酯类萃取剂的体积百分比为5～35%。
4.根据权利要求1所述的检测动物性食品中瘦肉精的方法，其特征在于，所述高分子多孔膜孔径0.2 μm，厚度100 μm～200 μm。
5.根据权利要求1所述的检测动物性食品中瘦肉精的方法，其特征在于，所述接收相为盐酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的检测动物性食品中瘦肉精的方法，其特征在于，步骤（3）中所述三相电膜萃取技术中在供体相和接收相之间施加电场的电压为20 V～140 V，所述萃取时间为5 min～40 min。
7.根据权利要求1所述的检测动物性食品中瘦肉精的方法，其特征在于，步骤（2）中所述提取剂为甲醇或乙腈。
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