CN114236006B - 一种检测动物尿液中瘦肉精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全检测技术领域，公开了一种检测动物尿液中瘦肉精的方法。本发明方法通过对样品进行预处理，再采用三相电膜萃取装置进行萃取；萃取结束后，采用高效液相色谱串联质谱仪对三相电膜萃取装置中接收相内的溶液中瘦肉精的含量进行检测。本发明在采用液相色谱‑质谱检测样品前，简化了传统对动物尿液的前处理方法，使用的电膜萃取过程同时完成了萃取分离、浓缩富集和净化过程。本发明方法灵敏度高、检出限低，具有样品净化能力强、分析速度快、富集倍数高、环境友好的特点，更适于批量萃取和常规检测分析，在食品检测领域具有较为广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测动物尿液中瘦肉精的方法。
背景技术
瘦肉精是一类药物的统称，主要是β-受体激动剂（也称β-兴奋剂），常见的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、硫酸特布他林等10多种。自1997年以来，我国就已发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用，2002年又先后下发176号、193号、235号公告，2010年又发布了1519号公告，明确禁止动物食品使用β激动剂类药物作为兽药和饲料添加剂。
由于大部分违禁药物在动物体内主要通过尿液排泄，因此，当前对养殖环节“瘦肉精”等违禁药物的监测方式主要是采集养殖动物的尿液并进行相关药物残留检测，借此可以提前发现是否饲喂“瘦肉精”，从而避免不安全的“瘦肉精”肉品进入消费市场危害消费者。目前，兽药残留测定方法很多，最为通用的是液相色谱串联质谱法。此方法最关键的步骤是样品前处理中低浓度待测物的有效提取。目前，动物尿液中药物残留检测的前处理技术主要有液液萃取和固相萃取两种方式。固相萃取法需要合成有效的吸附剂，该方法对有机溶剂的消耗量较大，目标物洗脱后往往需要挥干进行浓缩富集，操作繁琐，耗时长；液液萃取法的样品净化能力不足、萃取率受共存基质干扰物的影响较大，并且该方法对有机溶剂的消耗量大、污染环境。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种检测动物尿液中瘦肉精的方法。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种检测动物尿液中瘦肉精的方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理：将尿液离心后，取上清液过滤，收集尿液滤液；然后向尿液滤液中加入酸性试剂进行稀释，得到尿液样品溶液；
（2）萃取：以步骤（1）得到的尿液样品溶液为供体相，采用三相电膜萃取技术萃取样品粗提液中的瘦肉精，萃取完成后检测三相电膜萃取中接收相中瘦肉精的浓度。
优选地，步骤（1）中所述酸性试剂为pH=3～7的缓冲溶液，更加优选地，步骤（1）中所述酸性试剂为pH=4的磷酸盐缓冲溶液。
优选地，步骤（1）中尿液滤液与酸性试剂的体积比为1:2。
优选地，步骤（2）所述三相电膜萃取技术中采用的膜为高分子多孔膜；所述高分子多孔膜为聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或聚偏氟乙烯膜，更加优选地，所述高分子多孔膜为聚丙烯膜。
优选地，所述高分子多孔膜孔径为0.2 μm，厚度为100 μm～200 μm。
优选地，步骤（2）所述三相电膜萃取技术中高分子多孔膜上负载有机萃取溶剂；所述有机萃取溶剂为2-硝基苯辛醚。
优选地，步骤（2）所述三相电膜萃取技术中接收相为盐酸水溶液、乙酸水溶液、甲酸水溶液或三氟乙酸水溶液，更加优选地，所述接收相为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液浓度为20 mmol/L。
优选地，步骤（2）中所述三相电膜萃取技术中在供体相和接收相之间施加电场的电压为20 V～140 V。
更加优选地，步骤（2）中所述三相电膜萃取技术中在供体相和接收相之间施加电场的电压为40 V～140 V。
优选地，所述萃取时间为5 min～30 min。
优选地，所述瘦肉精为克伦特罗。
优选地，所述尿液样品为动物的尿液。
本发明采用三相电膜萃取技术萃取尿液样品溶液中的瘦肉精，其中一种操作方法为：
（a）将高分子多孔膜固定在两端开口的中空管的其中一端，然后将有机萃取溶剂均匀涂抹于所述高分子多孔膜至少一侧，形成支撑液膜；所述高分子多孔膜与中空管形成的空间作为接收相容器，向接收相容器内腔中注入接收相；
（b）在供体相容器中加入尿液样品溶液，分别向供体相和接收相中插入工作电极和对电极，然后将接收相容器置于供体相容器中，并使所述支撑液膜与尿液样品溶液液面刚好接触；
（c）将工作电极与电源正极连接，将对电极与电源负极连接，向工作电极和对电极施加电压形成电场，在电场作用下萃取供体相中的瘦肉精。
本发明采用三相电膜萃取技术萃取尿液样品溶液中的瘦肉精的另外一种操作方法为：
（a）将中空纤维膜一端封闭，在中空纤维膜上负载有机萃取溶剂；所述中空纤维膜内部空间作为接收相容器，向接收相容器内腔中注入接收相；
（b）在供体相容器中加入尿液样品溶液，分别向供体相和接收相中插入工作电极和对电极，然后将接收相容器置于供体相容器中，并使所述中空纤维膜封闭端浸没在尿液样品溶液中；
（c）将工作电极与电源正极连接，将对电极与电源负极连接，向工作电极和对电极施加电压形成电场，在电场作用下萃取供体相中的瘦肉精。
更加优选地，步骤（2）中所述检测用仪器为高效液相色谱串联质谱仪。
更加优选地，步骤（2）中所述高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：Eclipse PlusC18 (3.0 × 100 mm, 1.8 μm)；柱温：40°C；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：0～4.5min时，流动相为60% A-40% B；4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70% A-30% B；4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60%A-40% B。
更加优选地，步骤（3）中所述质谱测定的条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描MRM；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；克伦特罗的定量离子对为277/203，碰撞电压为22 V，Fragmentor电压为100 V。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明将有机萃取溶剂附着在高分子多孔膜上形成支撑液膜，然后在接收腔内加入接收相溶液，通过在接收相溶液和样品相溶液之间施加电场，在电场作用下促使瘦肉精的萃取由被动的跨膜扩散转化为主动的定向迁移，大大提高了萃取过程的传质速率，缩短萃取时间，同时提高萃取效率，富集待测物质，完成了样品的净化过程，简化样品的前处理过程。且本方法具有较宽的线性范围（1～1000 ng/mL），较低的检出限（0.07 ng/mL）和定量限（0.25 ng/mL），不同浓度下的加标回收率为71.7%～80.3%，重现性较好，稳定性较高，日内和日间平均偏差均小于15%，适用于动物尿液中瘦肉精的准确、高灵敏检测。
（2）本发明在萃取尿液中瘦肉精时，采用盐酸水溶液、乙酸水溶液、甲酸水溶液、三氟乙酸水溶液等酸性水溶液作为接收相，同时以酸性试剂为溶剂作为供体相，目的是为使瘦肉精全部以单电荷离子形式存在，在电场驱动下被萃取到接收相中，有利于其在电场迁移作用下被萃取分离。而且本发明中萃取溶剂负载在高分子多孔膜上，有机萃取剂用量少，仅需几微升，避免了传统萃取技术有机溶剂消耗量大，对环境有害的问题。
（3）本发明提供的三相电膜萃取装置构造简单、易得，成本低廉，操作简便；传质效率高，耗时较短；整个萃取过程操作方便省时，更适合批量萃取；且接收相容器中可容纳的接收相体积范围更大，可容纳几微升至几十毫升的接收液，可通过微调参数满足多种检测需求，更适于常规检测分析，在食品检测领域具有较为广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中三相电膜萃取装置的示意图，其中，1为对电极，2为接收相，3为负载有机萃取溶剂的高分子聚丙烯多孔膜，4为供体相，5为工作电极。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例结合附图，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
（一）三相电膜萃取克伦特罗的萃取条件优化
实施例1：接收相溶剂的优化实验
为了探讨不同的接收相溶剂对瘦肉精克伦特罗分离富集效果的影响，本发明以含有1mg/L克伦特罗标准品溶液作为供体相，以不同的溶液作为接收相进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中克伦特罗的浓度，得到克伦特罗的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例1-1～1-4的实验，具体参数值如表1所示。
实施例1-1
一种检测克伦特罗的方法，包括如下步骤：
（1）配制1 mg/L克伦特罗标准品溶液：取100 mg/L 的克伦特罗标准品，加入pH=4的10 mmol/L磷酸盐缓冲液，配制成1 mg/L克伦特罗标准品溶液，将其作为供体相4，进行后续的三相电膜萃取。
（2）三相电膜萃取装置的构建与萃取：
（a）取1 mL移液枪吸头，将孔径为0.2 μm，厚度为200 μm的高分子聚丙烯多孔膜3剪成1×1 cm大小，在高温下将高分子聚丙烯多孔膜粘附在枪头的底部，将枪头另一端剪去部分长度，将其作为接收相容器；将10 μL 2-硝基苯辛醚涂覆在枪头末端的多孔膜上形成支撑液膜，向接收相容器中加入200 μL 接收相2，所述接收相2为20 mmol/L 甲酸水溶液；
（b）将2 mL离心管作为供体相容器，加入1 mL供体相4，所述供体相4为步骤（1）制备的1 mg/L克伦特罗标准品溶液；向供体相4中插入工作电极5，向接收相2中插入对电极1，将装有接收相2和对电极1的接收相容器插入供体相容器中，使供体相溶液的液面与支撑液膜刚好接触，分别将工作电极5和对电极1与电泳仪电源的正极和负极连接，得到组装好的三相电膜萃取装置（如图1所示）；
（3）分离富集：将离心管置于恒温混匀仪上，设置恒温混匀仪的温度为室温，转速为1000 rpm，电泳仪电源的电压为120 V，时间为20min，同时启动电泳仪电源和恒温混匀仪，在外加电场的驱动和振荡辅助的作用下，进行克伦特罗的电膜萃取。
（4）分析检测：萃取结束后，取出接收相容器内的溶液直接进高效液相色谱串联质谱仪，检测克伦特罗的含量。
高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18 (3.0 × 100 mm，1.8 μm)；柱温：40 °C；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇。液相色谱采用梯度洗脱方式，洗脱条件为：0～4.5 min时，流动相为60%A-40% B；4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70%A-30% B；4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60% A-40% B。
质谱测定的条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描（MRM）；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；克伦特罗的定量离子对为277/203，碰撞电压为22 V，Fragmentor电压为100 V。
实施例1-2～1-4的内容与实施例1-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（2）中采用的接收相分别为10 mmol/L三氟乙酸水溶液、10 mmol/L盐酸水溶液、20 mmol/L乙酸水溶液。采用高效液相色谱串联质谱仪检测的接收相中克伦特罗的浓度计算克伦特罗的萃取率，具体计算公式如下：
克伦特罗的萃取率（%）=(CA×VA)/(CDi×VD)×100%
其中，CA指的是萃取结束后接收相中克伦特罗的浓度，CDi指的是供体相中克伦特罗的初始浓度，VA和VD分别是指接收相和供体相的体积。
由表1可知，当20 mmol/L甲酸水溶液为接收相时，克伦特罗的萃取率最高，甲酸具有一定的缓冲能力，能够稳定萃取过程中接收相的pH和体系的电流；以10 mmol/L三氟乙酸水溶液为接收相溶液时，克伦特罗萃取过程中电流较大，电膜萃取体系不稳定；以10 mmol/L盐酸水溶液为接收相溶液时克伦特罗的萃取率较低，可能是由于双电层导致克伦特罗的反萃取所致；以20 mmol/L乙酸水溶液作为接收相溶液时，SLM中质子化的分析物与扩散的乙酸离子形成了离子对，从而抑制了克伦特罗的传质。因此，后续实验优选20 mmol/L甲酸水溶液为接收相溶剂。
实施例2：萃取电压的优化实验
为了探讨不同的萃取电压对瘦肉精克伦特罗分离富集效果的影响，本发明以含有1 mg/L克伦特罗标准品溶液作为供体相，在不同的萃取电压下进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中克伦特罗的浓度，得到克伦特罗的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例1-1、实施例2-1～2-5、对比例2-1的实验。
实施例2-1～2-5和对比例2-1的内容与实施例1-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（3）中采用的电泳仪电源的电压分别为40 V、60 V、80 V、100 V、140 V、0 V。具体参数值如表2所示。
由表2可知，随着萃取电压由40 V增加至140 V，瘦肉精克伦特罗的萃取率呈现先升后降的趋势，由53.4%升至83.1%，后降至70.2%，远高于未加电压的萃取率（0.08%），这主要是因为电场的驱动能大大促进克伦特罗的传质过程，且在一定范围内增加萃取电压能够促进克伦特罗的萃取，但过高的萃取电压可能会导致电解现象的发生，使体系电流升高和不稳定，反而会影响克伦特罗的萃取。因此，后续实验萃取电压优选为120 V。
实施例3：萃取时间的优化实验
为了探讨不同的萃取时间对瘦肉精克伦特罗分离富集效果的影响，本发明以含有1 mg/L克伦特罗标准品溶液作为供体相，在不同时间下进行三相电膜萃取，萃取结束后通过液相色谱串联质谱技术检测接收相中克伦特罗的浓度，得到克伦特罗的萃取率和相对标准偏差（RSD），具体实验内容参见以下实施例1-1、实施例3-1～3-5的实验。
实施例3-1～3-5的内容与实施例1-1的基本相同，其不同之处在于：步骤（3）中采用的萃取时间分别为5 min、10 min、15 min、25min、30 min。具体参数值如表3所示。
由表3可知，随着萃取时间的增加，瘦肉精克伦特罗的萃取率呈现先升后降的趋势，当萃取时间为20 min时达到最高，这主要是因为当萃取体系达到平衡后继续延长萃取时间反而会导致克伦特罗被反萃取到膜相或供体相，进而表现为回收率下降。因此，后续实验萃取时间优选为20min。
（二）加样回收率试验
通过上述实施例优化得到的最佳萃取条件下（实施例1-1），对动物尿液中的瘦肉精进行分离、富集、检测。
实施例4
一种检测动物尿液中克伦特罗的方法，包括如下步骤：
（1）猪尿样品的预处理：将10～20 mL猪尿样品在5000 rpm转速下4℃离心10 min，取上清液用0.22 μm的水系滤膜过滤，再采用pH=4 10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液将其稀释3倍，得到样品稀释液。以100 μg/mL克伦特罗标准溶液为储备液，以样品稀释液为溶剂，配制2、50、100 ng/mL三种不同浓度的克伦特罗标准溶液作为加标猪尿样品溶液。
（2）三相电膜萃取装置的构建与萃取：
（a）取1 mL移液枪吸头，将孔径为0.2 μm，厚度为200 μm的高分子聚丙烯多孔膜3剪成1×1 cm大小，在高温下将高分子聚丙烯多孔膜粘附在枪头的底部，将枪头另一端剪去部分长度，将其作为接收相容器；将10 μL 2-硝基苯辛醚涂覆在枪头末端的多孔膜上形成支撑液膜，向接收相容器中加入200 μL接收相2，所述接收相2为20 mmol/L甲酸水溶液；
（b）将2 mL离心管作为供体相容器，加入取1 mL供体相4，所述供体相4为步骤（1）制备的样品稀释液或不同加标浓度的加标猪尿样品溶液；向供体相4中插入工作电极5，向接收相2中插入对电极1，将装有接收相2和对电极1的接收相容器插入供体相容器中，使供体相溶液的液面与支撑液膜刚好接触，分别将工作电极5和对电极1与电泳仪电源的正极和负极连接，得到组装好的三相电膜萃取装置；
（3）分离富集：将离心管置于恒温混匀仪上，设置恒温混匀仪的温度为室温，转速为1000 rpm，电泳仪电源的电压为120 V，时间为20min，同时启动电泳仪电源和恒温混匀仪，在外加电场的驱动和振荡辅助的作用下，进行克伦特罗的电膜萃取。
（4）分析检测：萃取结束后，取出接收相容器内的溶液直接采用高效液相色谱串联质谱仪，检测克伦特罗的含量。
高效液相色谱测定的条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18 (3.0 × 100 mm, 1.8μm)；柱温：40°C；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇。液相色谱采用梯度洗脱方式，洗脱条件为：0～4.5 min时，流动相为60%A-40% B；4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70% A-30% B；4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60%A-40% B。
质谱测定的条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描（MRM）；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；克伦特罗的定量离子对为277/203，碰撞电压为22 V，Fragmentor电压为100 V。
在优化的萃取条件下通过绘制克伦特罗的标准工作曲线，验证本发明提出的电膜萃取-高效液相色谱串联质谱法的线性范围、准确度和检出限。克伦特罗的工作曲线制作过程如下：将不含瘦肉精的猪尿样品在5000 rpm转速下4℃离心10min，取上清液用0.22 μm的水系滤膜过滤，再采用pH=4 10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液将其稀释3倍，得到猪尿样品稀释液。以100 μg/mL克伦特罗标准溶液为储备液，以猪尿样品稀释液为溶剂，配制一系列浓度（1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL）的克伦特罗加标的猪尿样品工作溶液。按照上述步骤（2）中所述的三相电膜萃取操作对加标的猪尿样品工作溶液进行萃取，萃取后采用高效液相色谱质谱仪测定接收相中克伦特罗的色谱图峰面积，绘制克伦特罗的工作曲线，并得出本发明提出的检测方法的相关性能参数，包括线性范围、线性相关系数、检出限和定量限，如表4所示。
按照上述实施例4检测克伦特罗的方法，实施例4-1～4-4中涉及到的具体参数值如表5所示。根据高效液相色谱串联质谱仪测定的实施例4-1～4-4接收相容器内的溶液中克伦特罗浓度，得到对猪尿空白样品（实施例4-1）中克伦特罗的检测结果和不同加标水平（2、50、100 ng/mL）（实施例4-2～4-4）的猪尿样品溶液中克伦特罗的加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果如表5所示。其中，加标回收率计算公式如下所示：
加标回收率（%）=(C2-C1)/C3×100%
其中，C1指的是猪尿空白样品中克伦特罗的浓度，C2指的是加标猪尿样品溶液中克伦特罗的浓度，C3指的是克伦特罗的加标量。
综上，本发明的检测方法具有较宽的线性范围（1～1000 ng/mL），较低的检出限（0.07 ng/mL）和定量限（0.25 ng/mL），不同浓度下的加标回收率为71.7～80.3%，重现性较好，稳定性较高，日内和日间平均偏差均小于15%，适用于动物尿液中瘦肉精（尤其是克伦特罗）的准确、高灵敏检测。此外，本发明的检测方法传质效率高，耗时较短；三相电膜萃取装置结构简单易得，组装简易；整个萃取过程操作方便省时，更适合批量萃取，且本方法中三相电膜萃取装置可容纳的接收相体积范围更大，可容纳几微升至几十毫升的接收液，以达到不同的检测目的。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (6)
1.一种检测动物尿液中克伦特罗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品预处理：将尿液离心后，取上清液过滤，收集尿液滤液；然后向尿液滤液中加入酸性试剂进行稀释，得到尿液样品溶液；所述酸性试剂为pH＝4的磷酸盐缓冲溶液；所述尿液样品为动物的尿液；所述尿液滤液与酸性试剂的体积比为1:2；
（2）萃取：以步骤（1）得到的尿液样品溶液为供体相，采用三相电膜萃取技术萃取样品粗提液中的克伦特罗；萃取结束后，取出接收相容器内的溶液直接进高效液相色谱串联质谱仪，采用高效液相色谱法和质谱分析法检测接收相中克伦特罗的含量；
所述三相电膜萃取技术中采用的膜为高分子多孔膜；所述高分子多孔膜为聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或聚偏氟乙烯膜；
所述高效液相色谱法的检测条件为：色谱柱：Eclipse Plus C18，3.0 × 100 mm，1.8μm；柱温：40℃；进样量：3.0 μL；流速：0.35 mL/min；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇；液相色谱采用梯度洗脱方式，洗脱条件为：0～4.5 min时，流动相为60%A-40% B，4.5～4.7 min时，流动相从60% A-40% B变化为70% A-30% B，4.7～5 min时，流动相从70% A-30% B变化为60% A-40% B；
所述质谱分析法的检测条件为：离子源：电喷雾ESI源；扫描模式：多反应检测扫描；正负离子模式：正离子模式；毛细管电离电压：4000 V；克伦特罗的定量离子对为277/203，碰撞电压为22 V，Fragmentor电压为100 V。
2.根据权利要求1所述的检测动物尿液中克伦特罗的方法，其特征在于，所述高分子多孔膜孔径为0.2 μm，厚度为100 μm～200 μm。
3.根据权利要求1所述的检测动物尿液中克伦特罗的方法，其特征在于，步骤（2）所述三相电膜萃取技术中高分子多孔膜上负载有机萃取溶剂；所述有机萃取溶剂为2-硝基苯辛醚。
4.根据权利要求1所述的检测动物尿液中克伦特罗的方法，其特征在于，步骤（2）所述三相电膜萃取技术中接收相为盐酸水溶液、乙酸水溶液、甲酸水溶液或三氟乙酸水溶液。
5.根据权利要求1所述的检测动物尿液中克伦特罗的方法，其特征在于，步骤（2）所述三相电膜萃取技术中在供体相和接收相之间施加电场的电压为20 V～140 V。
6.根据权利要求1所述的检测动物尿液中克伦特罗的方法，其特征在于，所述萃取时间为5 min～30 min。
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