CN111103363B - 测定人血清中万古霉素和降解产物浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属药物浓度监测技术领域，涉及一种液相色谱‑串联质谱法LC‑MS/MS同时测定人血清中万古霉素和晶状降解产物CDP‑1的浓度的方法。本方法以去甲万古霉素为内标，采用甲酸酸化血清后加入定量的乙腈沉淀蛋白，以乙腈和甲酸水作为流动相，通过LC‑MS/MS法测定人血清万古霉素和CDP‑1的浓度。本方法样品取样量少，预处理简单、快速，可用于常规临床患者血清样本中万古霉素和降解产物CDP‑1的浓度测定，尤其可定量肾功能不全患者血液透析后产生不同程度CDP‑1而降低抗菌活性成分万古霉素浓度，能为临床制定和调整万古霉素个体化给药方案，能提高临床疗效和细菌清除率，降低细菌耐药性产生，降低肾毒性等毒副反应的发生。
Description
技术领域
本发明属药物浓度监测技术领域，涉及检测人血清中药物浓度的方法，具体涉及基于液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定人血清中万古霉素和晶状降解产物CDP-1(包括2种降谢产物CDP-1-m和CDP-1-M)浓度的方法。
背景技术
据资料记载，糖肽类抗生素万古霉素在临床治疗实践中已历经60年历史，主要用于干预革兰阳性菌引起的感染，目前仍是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的首选药物。医疗实践显示，万古霉素药代动力学个体差异大，安全范围小，治疗窗窄，常发生肾毒性和耳毒性等不良反应，故推荐进行治疗药物浓度监测(TDM)。现有技术公开了万古霉素是时间依赖性的抗生素，药代动力学/药效学(PK/PD)显示其疗效与24小时下的药时曲线下面积/最小抑菌浓度(AUC24/MIC)有关，由于AUC较难直接定量，常采用谷浓度为其替代指标。2016年中国药理学会制订了《中国万古霉素治疗药物浓度监测指南》，推荐成人患者万古霉素血药浓度应维持在10-15mg/L，成人严重MRSA感染者血药谷浓度应维持在10～20mg/L，但是血药谷浓度≥15mg/L乃是肾毒性发生率增加的危险因素。
有临床研究显示，血液透析患者由于导管污染等原因容易引起感染，革兰阳性菌是主要的病原菌，美国感染病协会(IDSA)指南推荐万古霉素用于MRSA、氨苄西林耐药肠球菌等导管相关感染，但万古霉素的用法用量仍来自国外。为了达到目标靶浓度，IDSA指南推荐对于肾功能不全的患者(包括透析患者)进行万古霉素浓度监测，因而根据血药浓度监测结果调整给药方案，指导临床个体化用药，可提高万古霉素的临床有效性和安全性，但由于万古霉素有效浓度范围较窄，若TDM浓度检测不准确，则影响患者的个体化剂量调整，从而无法达到精准治疗的目的。
目前，临床上用于万古霉素TDM的检测方法包括，微生物法、免疫法、高效液相法(HPLC)和LC-MS/MS法等；其中，免疫法操作简便、自动化程度高，是目前万古霉素TDM常用的方法，但有文献报道免疫法相较于HPLC法和LC-MS/MS法，测定结果可能偏高，甚至偏高40％左右，究其原因可能是由于降解产物CDP-1的交互作用。万古霉素主要经肾脏排泄，CDP-1是其在肾脏的晶状降解产物，由一对异构体CDP-1-m和CDP-1-M组成，在透析等肾功能异常的患者中尤为多见。由于TDM血样来源广泛，本申请的前期免疫法和HPLC的TDM检测中，发现HPLC法容易受杂峰等影响色谱峰的积分，导致测定结果偏差大；以及在前期的实验中，发现目前市售的CDP-1的标准品含有一定量的万古霉素，由于CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M均为亲水性化合物且极性接近，难以分离到纯的标准品，尚需定量CDP-1标准品中三个化合物各自的含量。
目前，有文献报道采用高效液相色谱法(HPLC)测定万古霉素和降解产物CDP-1的浓度，但是该方法存在血清用量大，200μL，检测时间长，35min，特异性差等缺点，且该方法仅是测定CDP-1-m和CDP-1-M的总浓度，无法分别定量其中的2个降解产物，难以满足目前TDM的要求。
鉴于现有方法存在的问题，本申请的发明人拟提供一种同时测定人血清中万古霉素和2个降解产物CDP-1-m和CDP-1-M的液质联用法。建立该方法后进行了一系列方法验证，满足2015版药典的相关要求，并用于临床TDM血样的检测，特别是血液透析患者。
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发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供基于液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定人血清中万古霉素和晶状降解产物CDP-1浓度的方法；本方法快速、简便、可同时测定人血清样本中万古霉素和2个主要降解产物CDP-1-m和CDP-1-M的浓度，本方法无需昂贵的试剂，操作简单、血清用量少、快速、成本低、准确度高，可用于常规血药浓度监测。
本方法通过以下技术方案实现：采用高效液相色谱-紫外法测定标准品中CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M的含量，配制相应比例的万古霉素和降解产物标准曲线及质控样品，待测样品经预处理后，经酸性流动相在色谱柱上分离，用串联质谱检测，包括以下步骤：
1)CDP-1标准品中CDP-1-m、CDP-1-M和万古霉素的含量测定
称取一定量的标准品于容量瓶中，用纯水溶解并定容，配制成一定浓度的贮备液。吸取适量贮备液，用5％的乙腈水溶液稀释进样；
采用通用型的C18液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵、进样器和紫外检测器，采用乙腈和磷酸二氢钾缓冲液作为流动相，等度洗脱；
本发明的一个实施例中，流动相优选为乙腈∶磷酸二氢钾缓冲液(5mM，含0.023％磷酸)为9∶91，v/v；
2)血清样品预处理
取待测样品于离心管中，加入内标工作液、一定浓度的甲酸水溶液，混匀，加入定量的有机试剂沉淀蛋白，13000rpm离心后，吸取定量上清液，加入5％的乙腈水溶液，混匀待测；
3)样品分离
采用Waters通用型超高效液相色谱柱，填料为亚乙基桥杂化颗粒C18柱，液相色谱系统为超高压高分辨率计量泵、控温柱温箱和自动进样器，采用乙腈和0.1％甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱；
本发明的一个实施例中，优选乙腈∶0.1％甲酸溶液起始比例为5∶95，v/v；
4)样品检测
采用通用型串联质谱检测器检测样品中万古霉素、CDP-1和内标的峰面积；
质谱电离源：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测(MRM)正离子模式；离子通道：m/z 726.2→m/z 144.2(万古霉素，CDP-1)和m/z 718.2→m/z 144.2(内标)；
本发明的一个实施例中，仪器参数优选为气帘气30Arb；碰撞活化解离(CAD)8；电喷雾电压5500V；离子源温度500℃；离子源气体1和2均为50psi；万古霉素、内标的碰撞能量均为18V，CDP-1碰撞能量为23V；去簇电压为100V；射入电压为10V；扫描时间为80ms；
5)浓度计算
以样品浓度为X轴，待测物峰面积(As)与内标峰面积(Ai)比值为Y轴，进行加权回归分析，标准曲线回归方程以及样品的浓度使用含量分析软件进行计算。
本方法中，待测样品为人血清。
本发明的测定人血清中万古霉素和CDP-1浓度的方法中，对待测样品进行简单的预处理后，在酸性流动相下，经色谱柱分离，串联质谱检测，万古霉素和CDP-1的线性均良好，CDP-1-m线性范围为0.1437～14.37μg/mL，万古霉素线性范围为1.057～105.7μg/mL，CDP-1-M线性范围为0.2540～25.40μg/mL；方法回收率良好，基质不影响待测物和内标的检测，批内批间准确度精密度均符合接受标准。本发明方法快速准确、操作简便、血清用量少、成本低，适合临床常规血药浓度监测。
本方法具有以下优点：
1)同时测定：仅需一种方法可同时测定CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M浓度，提高了临床血药浓度检测的效率。
2)血清用量少：测定一份样品仅需50μL血清样品。
3)预处理简单：采用乙腈沉淀蛋白法，上清液稀释后进样，操作简便，成本较低，适于常规检测。
4)特异性好：采用色谱分离和质谱检测器，内源性物质等对测定无干扰。
5)分析时间短：一份样品整个分析时间仅为5min。
附图说明
图1：LC-UV法检测CDP-1标准品中CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M的含量的典型色谱图。
图2：LC-MS/MS法测定CDP-1-m(I)、万古霉素(II)、CDP-1-M(III)和内标去甲万古霉素(IV)的典型MRM色谱图，其中，A：空白血清样品；B：定量下限样品；C：典型的血液透析患者血清样品。
具体实施方式
实施例1
仪器、材料与试剂：
仪器：Waters液相色谱仪，配备Waters 2487紫外检测器和Empower数据采集与处理软件，美国Waters公司；
材料与试剂：CDP-1标准品，批号1-TMH-108-1，购自加拿大TRC公司；万古霉素，规格1007u/mg，批号130360-201302，购自中国药品生物制品检定所；磷酸二氢钾和磷酸，分析纯，均购自凌峰试剂有限公司；乙腈，色谱纯，购自Sigma-Aldrich公司；超纯水，Milli-Q每日新鲜配制；
实验部分：
溶液配制：精密称取适量CDP-1标准品于5mL容量瓶中，加入超纯水配制成1053μg/mL的贮备液。采用5％乙腈水稀释成20μg/mL的工作溶液进样分析，平行6样本，获得相应的色谱峰面积；精密称取适量万古霉素标准品于5mL容量瓶中，加入超纯水配制成1000μg/mL的贮备液；采用5％乙腈水稀释成0.5μg/mL的工作溶液进样分析；
检测条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(150×4.6mm，5μm)，柱温：室温，流速：0.65mL/min，流动相为乙腈-5mM磷酸二氢钾(含0.023％磷酸)为9∶91，v/v；进样体积：20μL；分析时间：30min；紫外吸收波长：230nm；
结果分析：与万古霉素纯品进样结果对比后发现CDP-1标准品为含4个化合物的混合物，3.195min为一杂质峰，6.535min为CDP-1-m，13.593min为万古霉素，16.142min为CDP-1-M；以各自的色谱峰面积/总峰面积计算含量，取其平均值，CDP-1标准品中的含量分析结果如表1所示。
表1 CDP-1标准品含量测定
实施例2
仪器、材料与试剂：
仪器：岛津LC-30AD超高效液相色谱仪(Shimadzu，日本)串联API5500三重四级杆质谱仪(AB SCIEX，美国)，配备电喷雾电离源(ESI)；数据采集及处理软件为Analyst1.6.2；控温高速离心机(Thermo Fisher，德国)；电子分析天平(Mettler，瑞士)；
材料与试剂：CDP-1标准品，批号1-TMH-108-1，购自加拿大TRC公司；万古霉素，规格1007u/mg，批号130360-201302，内标去甲万古霉素，纯度83.4％，批号130338-200303，均购自中国药品生物制品检定所；乙腈，甲酸(色谱纯)，购自Sigma-Aldrich公司；超纯水，Milli-Q每日新鲜配制；空白血清来源于健康志愿者；
实验：
UPLC-MS/MS条件：Waters Acquity BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，柱温30℃，流动相为乙腈：0.1％甲酸水，梯度洗脱，0.01～3.5min，5～15％乙腈，3.5～3.6min，15～90％乙腈，3.6～4.1min，90％乙腈，4.1～4.4min，90～5％乙腈，4.4～5.0min，5％乙腈，流速为0.3mL/min。进样体积为5μL，自动进样器温度设置为10℃；
ESI正离子多反应监测(MRM)模式；气帘气30Arb；碰撞活化解离(CAD)8；电喷雾电压5500V；离子源温度500℃；离子源气体1和2均为50psi。万古霉素、内标的碰撞能量均为18V，CDP-1碰撞能量为23V；去簇电压为100V；射入电压为10V；扫描时间为80ms。万古霉素、CDP-1和内标的碰撞室射出电压分别为15，10和12V；用于定量的离子反应分别为m/z 726.2→m/z 144.2(万古霉素，CDP-1)和m/z 718.2→m/z 144.2(内标)；
预处理条件：取血清50.0μL，分别加入25μg/mL的内标去甲万古霉素10.0μL、10％甲酸溶液，涡流混匀，再加入200μL乙腈，涡流混匀，离心15min(13000rpm)；取上清液20μL和180μL5％乙腈水混匀，涡流1min，5μL进样；
贮备液和工作溶液配制：分别精密称取适量万古霉素纯品和CDP-1标准品于5mL容量瓶中，加入纯水配制成1000μg/mL的标准曲线贮备液，用超纯水稀释，标准系列溶液浓度为CDP-1-m/万古霉素/CDP-1-M 1.437/10.57/2.54，2.874/21.14/5.08，7.185/52.85/12.70，14.37/105.7/25.40，28.74/211.4/50.80，71.85/528.5/127和143.7/1057/254μg/mL；另分别精密称取适量万古霉素纯品和CDP-1标准品于5mL容量瓶中，加入纯水配制成1000μg/mL和1053μg/mL的质控贮备液；称取适量内标去甲万古霉素标准品于5mL容量瓶中，加入纯水配制成1000μg/mL的内标贮备液。用超纯水稀释获得浓度为25μg/mL的内标工作溶液；
方法验证：
专属性：分别取空白血清50.0μL，除不加内标溶液外，按“预处理条件”项下操作，取5μL进样分析，得色谱图2A；将一定浓度的标准溶液和内标溶液加入空白血清中，依同法操作，得色谱图2B；取放置后的血清降解稳定性样品50.0μL，依“预处理条件”项下操作，得色谱图2C；
线性范围：取空白血清，精密加入万古霉素和CDP-1的标准系列溶液，配制出含CDP-1-m/万古霉素/CDP-1-M分别为0.1437/1.057/0.2540，0.2874/2.114/0.5080，0.7185/5.285/1.270，1.437/10.57/2.540，2.874/21.14/5.080，7.185/52.85/12.7和14.37/105.7/25.4μg/mL血清样品，按“预处理条件”处理后进样分析，建立标准曲线，以血清中待测物浓度X为横坐标，待测物与内标的峰面积Y为纵坐标，用加权最小二乘法(W＝1/x2)进行回归运算，求得回归方程，即标准曲线；CDP-1-m典型的直线回归方程为y＝0.182x+0.00237，r＝0.9970；万古霉素典型的直线回归方程为y＝0.133x+-0.00823，r＝0.9980；CDP-1-M典型的直线回归方程为y＝0.233x+0.00466，r＝0.9985；
精密度和准确度：取空白血清，精密加入万古霉素和CDP-1的质控(QC)溶液，配制出含CDP-1-m/万古霉素/CDP-1-M分别为0.1437/1.057/0.2540(QCLL)，0.4311/3.171/0.7620(QCL)，2.16/15.86/3.810(QCM)和12.21/89.85/21.59μg·mL-1(QCH)血清质控样品，按“预处理条件”项下操作，按每一浓度进行6样本分析，至少2天连续测定3个批次，结果如表2表3所示。
表2 待测物批内精密度和准确度
表3 待测物批内精密度和准确度
提取回收率和基质效应：
取QCL、QCM和QCH血清质控样品，按“预处理条件”项下操作，按每一浓度进行6样本分析，记录峰面积Ax，在同样条件下进样相应浓度的CDP-1-m/万古霉素/CDP-1-M质控溶液，并记录峰面积As，以相应的峰面积比值Ax/As计算提取回收率；CDP-1-m、万古霉素和CDP-1-M三浓度的回收率分别在87.0～96.3％、85.3～89.9％和81.6～84.6％范围之内(表4)，内标回收率为82.2％；
分别用来自5个健康志愿者、1个患者空白血清沉淀后的基质上清液配制4浓度质控溶液，每一浓度1样本；溶血血清、脂血血清沉淀后的基质上清液配制4浓度质控溶液，每一浓度3样本；采用空白溶剂配制相应浓度的质控溶液，每一浓度6样本；基质效应因子(％)＝沉淀后基质上清液配制的样品峰面积/空白溶剂配制的样品峰面积×100％，结果显示，三个待测物和内标基质效应因子在94.3～109.2％之间，CV均小于7.5％(如表4～表6所示)，结果表明，本方法的LC-MS/MS条件可有效地避免人血清样品的基质效应。
表4 正常血清中待测物和内标提取回收率和基质效应
表5 溶血血清待测物和内标基质效应
表6 脂血血清待测物和内标基质效应
残留效应：在高质控样品进样完成后进空白血清样品，反复6次，未见空白血清样品中在CDP-1-m，万古霉素和CDP-1-M及内标处出峰时间有干扰，空白样品信号均低于定量下限的20％和内标的5％；
稳定性：配制4浓度质控样品，考察自动进样器(10℃)放置30小时和-70℃冰箱中放置518天的稳定性，结果显示，自动进样器放置30小时各浓度的质控样品回收率均在88.9～113.4％之间，-70℃冰箱中放置518天质控样品回收率除CDP-1-m QCL为120.5％和万古霉素QCM为117.6％以外，其余浓度均在92，2～110.3％之间，表明CDP-1-m，万古霉素和CDP-1-M在自动进样器(10℃)放置30小时和-70℃冰箱中放置518天稳定。
表7 待测物血清样品自动稳定性结果(n＝3)
表8 待测物血清样品-70℃长期放置稳定性(n＝3)
实施例3 临床施用
入选12例血液透析患者(6男6女)，因革兰阳性菌感染治疗需要使用万古霉素和进行TDM，不早于第2剂给药前采集谷浓度标本，静脉滴注结束后0.5-1小时采集峰浓度标本，全血样品经3000rpm离心10分钟，取上清冷冻存放于-70℃冰箱待测，患者的人口学特征及浓度数据如表9所示，血清谷、峰浓度标本中，CDP-1(CDP-1-m+CDP-1-M)与万古霉素浓度的比值分别为5.9％-22.9％和5.1％-12.2％，若检测方法存在CDP-1的交互作用，或未对万古霉素和CDP-1进行分离，则可能导致2例(16.7％)患者剂量调整不准确，从而影响患者的个体化精准给药。
表9 透析患者人口学特征和万古霉素及CDP-1血药浓度
*表示为平均值±标准差[最小值-最大值]。
Claims (5)
1.测定人血清中万古霉素和降解产物CDP-1浓度的方法，其特征在于，采用高效液相色谱-紫外法测定CDP-1标准品中CDP-1-m，万古霉素和CDP-1-M的含量；采用万古霉素纯品和降解产物CDP-1标准品，配制相应比例的万古霉素和降解产物标准曲线及质控样品；待测样品经预处理后，经酸性流动相在色谱柱上分离，用三重四级杆质谱仪检测，包括以下步骤：
1）CDP-1标准品中CDP-1-m、CDP-1-M和万古霉素的含量测定
采用CDP-1的标准品，采用通用型的C18液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵、进样器和紫外检测器，采用乙腈：含0.023%磷酸的5mM磷酸二氢钾缓冲液为9:91作为流动相，等度洗脱，进样体积20μL，分析时间30min，平行6样本，紫外吸收波长230nm，获得相应的色谱峰面积，与万古霉素纯品进样结果对比后，以各自的色谱峰面积/总峰面积计算含量，取其平均值作为CDP-1标准品中CDP-1-m、CDP-1-M和万古霉素的含量；
2）血清样品预处理
取待测样品于离心管中，加入内标工作液、10%甲酸水溶液，混匀，加入定量的乙腈沉淀蛋白，13000 rpm离心分钟后，吸取定量上清液，加入5%的乙腈水溶液，混匀待测；
3）样品分离
采用Waters Acquity BEH C18色谱柱，2.1×100mm，1.7μm，液相色谱系统为超高压高分辨率计量泵、控温柱温箱和自动进样器，采用乙腈和0.1%甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱；
4）样品检测
采用通用型串联质谱检测器检测样品中万古霉素、CDP-1和内标的峰面积；
质谱电离方式：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测正离子模式；CDP-1采用与万古霉素相同的离子通道：m/z 726.2→ m/z 144.2，内标采用的离子通道：m/z 718.2→m/z144.2；
5）浓度计算
以样品浓度为X轴，待测物峰面积与内标峰面积比值为Y轴，进行加权回归分析，标准曲线回归方程以及样品的浓度使用含量分析软件进行计算。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中色谱柱为Phenomenex LunaC18柱，150×4.6mm，5μm。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中采用去甲万古霉素内标工作液，浓度为25 μg/mL。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3）中梯度为0.01~3.5min，5~15%乙腈，3.5~3.6 min，15~90%乙腈，3.6~4.1 min，90%乙腈，4.1~4.4 min，90~5%乙腈，4.4~5.0 min，5%乙腈。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤4）中质谱设定参数为：气帘气30 Arb；碰撞活化解离8；电喷雾电压5500 V；离子源温度500℃；离子源气体1和2均为50psi，万古霉素、内标的碰撞能量均为18 V，CDP-1的碰撞能量为23 V；去簇电压为100 V；射入电压为10 V；扫描时间为80 ms。
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