CN107991407A - 一种同时检测肉制品中35种兽药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种同时检测肉制品中35种兽药残留的方法。该方法可用于检测猪肉等肉类制品的兽药残留情况，不同国标方法只检验同一类别的兽药本方法可以同时检验35种不同类兽药。经过测定，35种兽药在20ng/mL‑200ng/mL之间的线性良好，相关系数在0.99以上；猪肉样品在10μg/kg的低浓度回收率在70％‑120％之间，相对标准偏差小于0.2；检出限≤10μg/kg，满足常规检验要求。本方法选择性好、灵敏度高，简单易操作，节约试剂。

Description

一种同时检测肉制品中35种兽药残留的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体地，涉及一种用液相色谱-串联四级杆质谱同时检测肉制品中35种兽药残留的方法。

背景技术

兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。农药的使用在提高农作物产量的同时也带来了很多负面作用。

肉制品，是指用畜禽肉为主要原料，经调味制作的熟肉制成品或半成品，如酱卤肉、烧烤肉等。也就是说所有用畜禽肉为主要原料，经添加调味料的所有肉的制品，不因加工工艺不同而异，均称为肉制品，包括：酱卤肉、肉丸、腌腊肉等。肉制品为我们人体提供了大量的碳水化合物、蛋白质、维生素、无机盐等营养物质。近年来随着我国生活水平迅速提高，人们对肉制品的需求也大大增加，农牧业也随之蓬勃发展，但是面对动物疾病问题还是采用投喂兽药的方式，这样广大民众在食用肉制品时也同时食用兽药，因此肉制品中兽药残留的问题不容忽视。

兽药残留检测方法主要分为前处理和检测两部分。目前，肉制品中兽药残留的前处理方法大多采用传统的提取和净化方法，容剂消耗量大，操作过程繁琐，分析周期长，且易造成环境污染。肉制品相对于其他作物而言，其成分的特殊性和复杂性对前处理的要求更为严格，其它领域较为先进的前处理技术不能直接引用进来，这无疑又增加了实验的工作量和成本，与兽药残留分析的发展趋势背道而驰。迄今为止，在肉制品兽药残留检测领域，液相色谱-质谱联用技术在兽药残留分析中的应用较广，研究范围主要包括单个或单一类兽药残留分析，多类兽药残留同时分析的方法研究较少。因此，存在分析时间长，不能同时分析检测多种类兽药残留，分析过程繁琐，成本高等问题。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷，本发明研发出了一种同时检测肉制品中35种不同种类兽药残留的方法。该方法选择性好、灵敏度高，节约试剂，极大地缩短了分析时间。

本发明的技术目是通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种同时检测肉制品中35种兽药残留的的方法，包括以下步骤：

S1：混合标准品溶液的制备：制备兽药标准品储备液，然后将兽药标准品储备液混匀，定容，配置成浓度范围为20～200ng/mL混合标准品的标准溶液，待用；

S2：标准曲线绘制：吸取步骤S1所制备的标准溶液进样检测，分别记录其色谱峰面积，以标准溶液的浓度值为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，回归分析做成线性回归方程；

S3：样品前处理：取肉制品样品捣碎，加入水震荡后加入乙腈震荡提取，再加入无水硫酸钠、氯化钠震荡后离心，取上清液蒸发至干，定容过滤后得肉制品待测液；

S4：肉制品待测液的检测：将步骤S3所得肉制品待测液用液相色谱-三重四级杆质谱在质谱ESI源下正离子MRM模式下测定，外标法定量。

本发明优选地，所述步骤S4中的液相色谱-三重四级杆联质谱的检测条件为：

液相色谱检测条件：岛津LC20A，色谱柱Shim-pack XR-ODS，75mm×3.0mm,2.7um；流速：0.3mL/min；进样量：10uL；色谱柱温度：40℃；流动相A:乙腈，B：0.1％的甲酸水溶液；梯度：t＝7min，B＝75％；t＝10min，B＝10％；t＝11min，B＝10％；t＝11.1min，B＝95％；t＝15min，B＝100％。

质谱检测条件如下：气帘气:30.00L/min；碰撞电压:10.00V；喷雾电压:5500.00V；源温度:600.00℃；雾化气:60.00L/min；辅助加热气:60.00L/min。

本发明进一步地，所述步骤S1中兽药标准品储备液的制备方法如下：分别取35种兽药标准品用甲醇定容至1mg/mL，置于-20℃～-18℃中保存待用。

本发明进一步地，所述步骤S1中混合标准品的标准溶液的制备方法如下：分别吸取兽药标准品储备液并混合，用甲醇定容，所述兽药标准品在混合标准品溶液中的浓度均为1μg/mL，再将所述混合标准品溶液分别配制成标准浓度为20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准溶液。

本发明优选地，所述步骤S3中肉制品样品与无水硫酸钠、氯化钠的重量比范围为2:(4～8):(0.5～2.5)。

本发明更进一步地，所述步骤S3中肉制品样品与无水硫酸钠、氯化钠的重量比范围为2:(5～7):(1～2)。

本发明更优选地，所述步骤S3中过滤采用0.22微米滤膜。

本发明具体地，所述兽药标准品包括磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺醋酰、磺胺脒、磺胺苯吡唑、磺胺二甲异噁唑、甲氧苄氨嘧啶、磺胺苯甲酰、磺胺地索辛、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基噁唑、磺胺多辛、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、噁喹酸、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、双氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺。

本发明更进一步地，所述35种兽药在20ng/mL-200ng/mL之间的线性相关系数在0.99以上。

本发明更进一步地，所述肉制品为卤猪肉，其在浓度10μg/kg的回收率在70％-120％之间，相对标准偏差小于0.2。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

1、该方法建立一种简单、廉价、有效的肉制品兽药残留的前处理方法。本方法的核心是使用加入水先将兽药溶解后加入乙腈提取，通过加入无水硫酸钠吸收部分水再加入氯化钠产生盐析作用使兽药充分被乙腈提取。与过去的肉制品兽药残留前处理方法相比，具有简便、易操作、低成本(不需要昂贵的仪器设备，所有操作步骤手动即可)、溶剂使用少、低污染、对环境友好(每个样品只需10mL有机溶剂)等特点。

2、建立了一种可同时检测35种不同种类兽药残留的分析方法。本方法将液相色谱与串联质谱相结合，不但达到了高分辨率、高灵敏度、高选择性的要求，而且极大地缩短分析时间(整个分析过程可在15分钟内完成)，显著提高工作效率。

附图说明

图1为本发明中50ng/mL的混合标准品溶液的液相色谱三重四级杆质谱联用的多反应监测总离子流图。

图2为喹诺酮类恩诺沙星标准曲线。

图3为喹诺酮类双氟沙星标准曲线。

图4是磺胺噻唑标准曲线。

图5是磺胺二甲异噁唑标准曲线。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。

一、试剂和材料

1.1乙腈色谱纯；

1.2去离子水；

1.3无水硫酸钠分析纯(500℃烘干4小时)；

1.4氯化钠分析纯；

1.5甲酸色谱纯；

1.6甲醇色谱纯；

1.7兽药残留标准品均为纯度≥95％用甲醇溶解定容后配制成35种混合标准溶液1.0ug/mL。

二、仪器

2.1岛津LC20A-API3200三重四级杆质谱；

2.2分析天平感量0.1mg；

2.3涡旋混合器；

2.4冷冻离心机；

2.5组织均质机；

2.6旋转蒸发仪；

2.7一次性针筒；

2.8水性0.22微米滤膜。

三、兽药残留检测方法

以卤猪肉作为肉制品的代表

3.1、兽药标准品储备液的制备

分别称取35种兽药标准品各10mg置于10mL容量瓶中，选择甲醇分别溶解兽药标准品并定容至刻度，使35种兽药标准品储备液的浓度均为1mg/mL，标准品储备液-18℃保存。

3.2、混合标准品溶液的制备

将步骤1中的35种兽药标准品储备液分别取出，然后混合到一起，用甲醇定容，兽药标准品在混合标准品溶液中的浓度均为1μg/mL，然后分别配制成标准浓度为20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准溶液。

3.3、标准曲线绘制：吸取混合标准溶液，分别制成20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的浓度点，进样20μL检测，记录色谱峰面积，已浓度点为横坐标，面积为纵坐标回归分析做成线性回归方程，兽药的标准曲线由仪器软件自动给出，兽药标准品的标准曲线见表1，其中磺胺和喹诺酮类代表性兽药的标准曲线如图2～5所示。

表1 兽药标准品的标准曲线

3.4、卤猪肉前处理液的制备

(1)、将待检测的卤猪肉粉碎，得到待检测的卤猪肉；

(2)、取2.00g待检测的卤猪肉于50mL离心管，加入5mL水涡旋震荡2min，加入10mL乙腈震荡提取10min。

(3)、往离心管中加入6g无水硫酸钠，1.5g氯化钠剧烈震荡5min。

(4)、将离心管放入冷冻离心机中，在温度为2℃，8000r/min转速下离心5min。

(5)、将上清液用吸管吸取出来于100mL梨形瓶中，在旋转蒸发仪上45℃蒸发至干。

(6)、加入1mL的乙腈水溶液(按v：v计乙腈：水＝1:9)稀释，将梨形瓶震荡1min后，用2.5mL一次性针筒吸出液体过0.22微米滤膜于1.5mL进样瓶中待测。

3.5、肉制品待测液的检测：将步骤3.4所得肉制品待测液用液相色谱-三重四级杆质谱在质谱ESI源下正离子MRM模式下测定，外标法定量。其中多种兽药项目质谱参数如表2所示，图1为本发明中50ng/mL的混合标准品溶液的液相色谱三重四级杆质谱联用的多反应监测总离子流图。

表2 检测多种兽药项目质谱参数

(1)、液相色谱检测条件如下：岛津LC20A，色谱柱Shim-pack XR-ODS，75mm×3.0mm,2.7um；流速：1mL/min；进样量：20uL；色谱柱温度：40℃；流动相A:乙腈，B为0.1％的甲酸水溶液；梯度见表3：

表3 液相色谱检测条件中流动相与甲酸水溶液梯度表

Time(min)	B泵比例％
		7.00	75
10.00	10
		11.00	10
11.10	95
		15.00	Stop

(2)、质谱检测条件如下

气帘气：30.00L/min；碰撞电压:10.00V；喷雾电压:5500.00V；源温度:600.00℃；雾化气:60.00L/min；辅助加热气:60.00L/min。

3.6、仪器的灵敏度试验

仪器的灵敏度即是仪器的检出限，将10ng/mL的浓度点检测的信噪比最为参照点，计算信噪比为3的时候浓度为仪器的检出限。

3.7、准确性和重复性试验

取不含兽药残留的卤猪肉2份，每份为2.00g，每份加入浓度为1μg/mL的混合标准品溶液100μL和200μL；按照上述步骤3.4～3.5制备肉制品前处理液，并进样分析，计算回收率及相对标准偏差；所述的准确性用回收率来表示，重复性用相对标准偏差来表示见表4。

表4 准确性和重复性试验

35种兽药在20ng/mL-200ng/mL之间的线性良好，相关系数在0.99以上；猪肉样品在10μg/kg的低浓度回收率在70％-120％之间，相对标准偏差小于0.2；检出限≤10μg/kg，满足常规检验要求。本方法选择性好、灵敏度高，简单易操作，节约试剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测肉制品中35种兽药残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：混合标准品溶液的制备：制备兽药标准品储备液，然后将兽药标准品储备液混匀，定容，配置成浓度范围为20～200ng/mL混合标准品的标准溶液，待用；

S2：标准曲线绘制：吸取步骤S1所制备的标准溶液进样检测，分别记录其色谱峰面积，以标准溶液的浓度值为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，回归分析做成线性回归方程；

S3：样品前处理：取肉制品样品捣碎，加入水震荡后加入乙腈震荡提取，再加入无水硫酸钠、氯化钠震荡后离心，取上清液蒸发至干，定容过滤后得肉制品待测液；

S4：肉制品待测液的检测：将步骤S3所得肉制品待测液用液相色谱-三重四级杆质谱在质谱ESI源下正离子MRM模式下测定，外标法定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中的液相色谱-三重四级杆联质谱的检测条件为：

液相色谱检测条件：岛津LC20A，色谱柱Shim-pack XR-ODS，75mm×3.0mm,2.7um；流速：0.3mL/min；进样量：10uL；色谱柱温度：40℃；流动相A:乙腈，B：0.1％的甲酸水溶液；梯度：t＝7min，B＝75％；t＝10min，B＝10％；t＝11min，B＝10％；t＝11.1min，B＝95％；t＝15min，B＝100％。

质谱检测条件如下：气帘气:30.00L/min；碰撞电压:10.00V；喷雾电压:5500.00V；源温度:600.00℃；雾化气:60.00L/min；辅助加热气:60.00L/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中兽药标准品储备液的制备方法如下：分别取35种兽药标准品用甲醇定容至1mg/mL，置于-20℃～-18℃中保存待用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中混合标准品的标准溶液的制备方法如下：分别吸取兽药标准品储备液并混合，用甲醇定容，所述兽药标准品在混合标准品溶液中的浓度均为1μg/mL，再将所述混合标准品溶液分别配制成标准浓度为20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中肉制品样品与无水硫酸钠、氯化钠的重量比范围为2:(4～8):(0.5～2.5)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中肉制品样品与无水硫酸钠、氯化钠的重量比范围为2:(5～7):(1～2)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中过滤采用0.22微米滤膜。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，所述兽药标准品包括磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺醋酰、磺胺脒、磺胺苯吡唑、磺胺二甲异噁唑、甲氧苄氨嘧啶、磺胺苯甲酰、磺胺地索辛、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基噁唑、磺胺多辛、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、噁喹酸、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、双氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述35种兽药在20ng/mL-200ng/mL之间的线性相关系数在0.99以上。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肉制品为卤猪肉，其在浓度10μg/kg的回收率在70％-120％之间，相对标准偏差小于0.2。