CN102419354A - 一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，特点是具体包括以下步骤：将液体牛奶样品进行简便通用的提取和净化，得到上样液的步骤；配置混合标准溶液和制作基质添加标准曲线的步骤，然后通过超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定液态奶中小分子有毒有害物质，最后进行浓度计算，优点是从小分子化合物一般共性出发，充分考虑到各种物质的溶解性、热稳定性、酸碱稳定性、极性强弱、共存稳定性等，开发出通用型快速前处理技术和UPLC-MS/MS电喷雾仪器测定技术，在满足检测限量要求的前提下，能给生产过程控制和食品检测工作带来显著的提高效率和降低检测成本的效果。

Description

一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种液态奶中小分子有毒有害物质的检测方法，尤其是涉及一种液态奶中超微量小分子有毒有害物质(如兽药、环境激素、生物毒素、农药类、非法添加物等，分子量小于1500)的新型快速通用检测方法。

背景技术

液态奶((如生鲜牛奶、鲜牛奶、酸奶)是人们日常摄取营养的一种重要食品，然而液态奶中含有的小分子有毒有害物质如兽药、环境激素、生物毒素、农药杀虫剂、非法添加物等已经对其安全构成了不同程度的安全隐患，这些物质种类数量相当庞大，理化性质差异较大，加上牛奶中含有较高含量的蛋白、脂肪和乳糖等基质干扰成分，对超微含量的小分子有毒有害物质的检测构成难度。

随着质谱尤其是LC-MS/MS的问世和不断发展，已经陆续有多类别多残留检测方法报道，2006年Yamada发表第一篇同时筛选牛肉、猪肉和鸡肉中130种兽药的LC-MS/MS方法(文献1：Yamada R，Kozono M，Ohmori T，Morimatsu F，Kitayama M (2006)Biosci Biotechnol Biochem 70：54-65)，由于用到正己烷分层去脂，不适合弱极性化合物检测，通用性并不强；Ortelli等采用乙腈提取，上清液进行超滤后UPLC-MS检测牛奶中150种兽药(文献2：Ortelli D.，Cognard E.，Jan P. and Edder P.，J.Chrom.B，2009，877(23)：2363-2374.)，大环内酯类低于10％，喹诺酮类回收率范围98-807％，四环素类141-258％，部分苯逼咪唑类高于436％，回收率不理想；Hans(2008)提出来通用型提取方法(Generic ExtractionMethod)概念，采用UPLC-MS/MS同时分析饲料、牛奶、蜂蜜、肉类等基质中172种种农药、生物毒素、植物毒素和兽药，被认为是最早的通用型检测方法(文献3：Mol HG，P，Zomer P，de Rijk TC，Stolker AA，Mulder PP.Towarda generic extraction method for simultaneous determination of pesticides mycotoxins，plant toxins，and veterinary drugs in feed and food matrixes.Anal.Chem.2008，80(24)，9450-9459.)，但是该方法中样品基本上没有经过净化处理，检测限不能满足所有受试的目标物，也容易污染仪器。Stolker等分析了牛奶中101种兽药，样品采用乙腈提取，Strata-X小柱净化(文献4：Stolker A.A.M.，Rutgers P.，Oosterink E.，Lasaroms J.J.P.，Peters R.J.B.，van Rhijn J.A.，Nielen M.W.F.，Anal.Bioanal.Chem.，2008，391(6)：2309-2322.)，通过固相萃取等净化方式，部分化合物可能在该过程中损失，同时前处理时间又较长。上述文献报道多类多残留检测方法，在通用性和净化效果方面都存在问题。

目前，在我国针对奶制品中这些有毒有害物现行的国家标准和行业标准检测方法数量虽然较多，但这些方法分为多个样品制备方法，操作步骤过多，检测人员精力分散，不但费时费力，检测效率低下，可操作性不强，而且项目覆盖面尚不全面，容易带来漏检的风险，周期长，实验成本高昂。因此，目前尚未出现真正针对小分子有毒有害物的通用型检测方法。究其原因，无外乎这些方法的前处理和仪器分析过程针对不同理化性质的化合物难以兼容，缺乏通用性，因此很难在常规方法上显著提高监测效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，该方法的前处理和仪器分析过程针对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试的目标物并且降低了检测成本。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种液态奶中小分子有毒有害物质的快速通用检测方法，具体包括以下步骤：

(1)样品前处理及提取净化

将液体牛奶加入试管中，并在试管中加入保护剂和乙腈-乙醇混合液，混匀后离心得到第一上清液，将第一上清液加入离心管中，并在离心管中加入乙腈-乙醇混合液，充分混匀后离心得到第二上清液，将第二上清液转移至鸡心瓶中于40℃旋转蒸发至干，然后用乙腈-乙醇-水混合液定容得到样品液，将样品液摇匀后，通过0.22μm微孔滤膜过滤得到上样液；

(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

氯霉素和β₂-激动剂类分别为20ng/mL，三聚氰胺、双聚氰胺、纳他霉素分别为2000ng/mL，阻断剂、甲状腺抑制剂、喹恶啉类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺、咪唑类、哒唑类、咖啡因、抗寄生虫药类、阿维菌素类、性激素类、皮质激素、喹恶啉类、真菌毒素类、大环内酯类、非甾类消炎药、β-内酰胺、镇定剂、农药杀虫剂、染料类、雌激素、皮质激素、环境激素和农药类(除草剂)均为200ng/mL，-18℃冷藏；

B.基质标准曲线定量

在4.0ml空白牛奶样品中加入混合标准溶液0μL，20μL，40μL，80μL，160μL，320μL，按步骤(1)所述的样品前处理及提取净化方法进行处理，以浓度为横坐标，仪器响应值(响应值＝标准品峰面积/标准品质量)为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；

(3)超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定

A.高效液相分离

液相条件为：

a)色谱柱Acquity Waters HSS-T₃，2.1mm×100mm，1.8μm；

b)色谱柱温度：40℃；

c)如果质谱采用Run1正离子模式进行测定，进样量为将步骤(1)得到的上样液稀释4倍后取10uL；

如果质谱采用Run2正离子模式和Run3负离子模式进行测定，进样量为步骤(1)得到的上样液10uL；

d)流速：0.4mL/min

e)如果质谱采用Run3负离子模式进行测定，那么选择流动相A₁：2.5mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B₁：甲醇；梯度洗脱程序(以体积百分比记)为：0-6min，98-0％A₁；6-10min，0％A₁；10-10.5min，0-98％A₁；10.5-12min，98％A₁；各洗脱时间段中均以流动相B₁补足余下的％数；

如果质谱采用Run1正离子模式和Run2正离子模式进行测定，那么选择流动相A₂：0.1％甲酸水溶液，流动相B₂：含0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱程序(以体积百分比记)为：0-2.3min，98-80％A₂；2.3-8min，80-0％A₂；8-10min，0％A₂；10-10.5min，0-98％A₂；10.5-12min，98％A₂；各洗脱时间段中均以流动相B₂补足余下的％数；

f)流路切换：0～0.55min切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，0.56min后开始质谱采集；

B.质谱检测

质谱条件为：

a)采用电喷雾离子化电离源，毛细管电压：正离子、负离子电压分别为3.5kV和3.0kV；

b)多通道监测方式MRM；

c)离子源温度：150℃，去溶剂气温度：450℃；

d)锥孔反吹气流速：50L/h；去溶剂流速：700L/h

e)碰撞气体：氩气3.3×10^-3 mba(毫巴)；

g)分组方案：极性较强的药物选择Run1正离子模式下进行测定，Run1正离子模式定容溶剂为水、乙醇和乙腈按体积比为88∶6∶6的比例混合；极性偏弱药物选择Run2正离子模式下进行测定，Run2正离子模式定容溶剂为水、乙醇和乙腈按体积比为10∶5∶5的比例混合；极性和非极性的药物选择Run3负离子模式下进行测定，Run3负离子模式定容溶剂为水、乙醇和乙腈按体积比为10∶5∶5的比例混合；

(4)浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

$X=\frac{C\×V\×1000}{m\×1000}...\left(1\right)$

式中：

X-试样中待测物含量，单位为微克每公斤(μg/L)；

C-试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V-定容体积，单位为毫升(mL)；

m-液体牛奶试样体积，单位为毫升(mL)。

所述的液体牛奶、所述的保护剂和所述的乙腈-乙醇混合液的混合比为4.0mL∶150mg∶5mL；所述的第一上清液与乙腈-乙醇混合液的混合体积比为9∶62；采用不同有机溶剂含量的溶剂体系，分两步分别沉淀除去脂类、蛋白、糖类、盐分等干扰成分，快速简便通用，无须固相萃取等手段；所述的乙腈-乙醇混合液中乙腈与乙醇的混合体积比为9∶1，可以防止乙腈与水分层；所述的定容液乙腈-乙醇-水混合液中乙腈、乙醇与水的混合体积比为1∶1∶2。

所述的保护剂为固体EDTA-Na₂，防止四环素类和大环内酯类等药物和样品中的重金属离子结合，保障回收率。

称取4.0mL牛奶于15mL试管中，加入150mg EDTA-Na₂混匀，再加入5mL乙腈-乙醇混合液混匀30s，0℃冷冻离心10min得到第一上清液，取4.5mL第一上清液于50mL离心管中，加入31mL乙腈-乙醇混合液，充分混匀，0℃冷冻离心10min得到第二上清液，将第二上清液转移至100mL鸡心瓶，40℃旋转蒸发至干，用乙腈-乙醇-水混合液定容至1.0mL得到样品液，摇匀后样液通过0.22μm微孔滤膜过滤得到上样液。

所述的0.22μm微孔滤膜固定在多通道针式过滤装置上，该多通道针式过滤装置方便过滤，大大提高过滤效率。

步骤(1)中所述的离心条件为温度-1～1℃，转速4500转/min，时间10min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、提取技术和净化技术具有通用性，检测对象覆盖范围宽，降低漏检风险，小分子有毒有害的有机物仅通过一个前处理方法进行处理，加上前处理简便快速，与以往多个方法的检测方法相比，检测效率得到了根本性的提升，缩短了检测周期，与背景技术中文献1相比本方法没有用到液液分层净化，保障通用性强的特点。

2、不需要固相萃取等净化方式，与采用固相萃取小柱相比，不但保证极性强和极性弱的待测物的回收率，而且降低了样品处理的昂贵成本消耗。

3、流路切换设置避免样液中的盐分和糖分进入质谱仪(喷雾室)，弥补了不采用固相萃取小柱的缺陷。

4、检测分组方案：根据流动相与定容溶剂的选择，Run1正离子模式适合极性较强的药物，定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(88∶6∶6，(v/v/v))，获得窄的峰宽，改善线性，Run2适合正离子模式下的极性偏弱药物，定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(10∶5∶5，(v/v/v))，线性良好，Run3负离子模式下适合极性和非极性的药物，定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(10∶5∶5，(v/v/v))，上述方案确保充分驻留时间和良好离子化程度，能保证满足最少采集的数据点要求，改善定量的线性，可靠性强，灵敏度高。

5、本方法经过283种具体药物的验证试验，检测限范围在0.01～5μg/L之间，除了棒曲霉毒素、水杨酸、三聚氰胺、双聚氰胺、雌二醇为5μg/L外，其余检测限均低于1μg/L；回收率范围在60～130％，其中95％以上药物均在70～110％，相对标准偏差RSD均小于25％，其中95％以上种类RSD均＜10％，精密度良好，均能满足目前国内和欧盟限量要求。具体见实施例中表2-4。本方法与背景技术中文献2的方法相比，本方法回收率理想，精密度良好；与文献3的方法比较，本方法不仅包含通用型提取方法，同时还具备通用性净化方法，检测限能达到0.01～5μg/L；与文献4的方法相比，快速简捷，回收率高，精密度良好。

综上所述，本发明从小分子化合物一般共性出发，充分考虑到各种物质的溶解性、热稳定性、酸碱稳定性、极性强弱、共存稳定性等，开发出通用型快速前处理技术(Generic & Rapid sample preparation)和UPLC-MS/MS电喷雾仪器测定技术，在满足检测限量要求的前提下，能给生产过程控制和食品检测工作带来显著的提高效率和降低检测成本的效果。通过在牛奶中添加283种化合物(项目分布各大类，具有充分的广泛性)进行了方法验证，检测限、回收率和精密度均满足分析要求。

附图说明

图1为本发明液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法流程图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

下面用实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此，保护范围以权力要求为准。

1、材料

1.1主要试剂和材料

标准物质购自：Dr.Ehrenstorfer，Sigma，Witega以及EU pharmacopoeia；

先将单标配制浓度为0.5mg/mL。混合标准溶液中氯霉素和β₂-激动剂类分别为20ng/mL，三聚氰胺、纳他霉素和甲状腺抑制剂类分别为2000ng/mL，阻断剂、甲状腺抑制剂、喹恶啉类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺、咪唑类、哒唑类、咖啡因、抗寄生虫药类、阿维菌素类、性激素类、皮质激素、喹恶啉类、真菌毒素类、大环内酯类、非甾类消炎药、β-内酰胺、镇定剂、农药杀虫剂、染料类、雌激素、皮质激素、环境激素和农药类(除草剂)均为200ng/mL，-18℃冷藏；乙腈、甲醇、乙醇、乙酸铵均为色谱纯购自迪马公司，其他试剂为分析纯，水为二级水。牛奶样品采自市售鲜牛奶。

1.2主要仪器

超高效液相色谱仪：型号Acquity，美国waters公司

三重四极杆串联质谱联用仪：型号XEVO，美国waters公司

纯水仪：Milli-Q，法国Millipore公司

电子天平(感量分别为0.1mg，德国Sartorius)。

冷冻离心机，3-18k，德国sigma

真空旋转浓缩仪：R-215，瑞士Buchi

多通道针式过滤装置：superb20-40，宁波赛恩斯

2、液态奶中小分子有毒有害物质的检测方法(如图1所示)

2.1通用型快速前处理(提取与净化)

称取4.0mL牛奶于15mL试管中，加入150mg EDTA-Na₂混匀，再加入5mL乙腈-乙醇(90∶10(V/V))混匀30s，0℃冷冻离心10min得到第一上清液，取4.5mL第一上清液于50mL离心管中，加入31mL乙腈-乙醇(90∶10(V/V))，充分混匀，0℃冷冻离心10min得到第二上清液，将第二上清液转移至100mL鸡心瓶，40℃旋转蒸发至近干，用水∶乙醇∶乙腈(10∶5∶5，(v/v/v))组成的混合液定容至1.0mL得到样品液，摇匀后样液通过固定在多通道针式过滤装置的0.22μm微孔滤膜过滤得到上样液。其中，离心条件为温度-1～1℃转速4500转/min，时间10min，保护剂EDTA-Na₂用于防止四环素类和大环内酯类等药物和样品中的重金属离子结合，保障回收率，乙醇的加入防止有机相与水相分层，并增加沉淀效果。

2.2混合标准溶液组成和标准曲线

A.混合标准溶液组成

氯霉素和β₂-激动剂类20ng/mL，三聚氰胺、纳他霉素、甲状腺抑制剂类2000ng/mL，阻断剂、甲状腺抑制剂、喹恶啉类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺、咪唑类、哒唑类、咖啡因、抗寄生虫药类、阿维菌素类、性激素类、皮质激素、喹恶啉类、真菌毒素类、大环内酯类、非甾类消炎药、β-内酰胺、镇定剂、农药杀虫剂、染料类、雌激素、皮质激素、环境激素和农药类(除草剂)均为200ng/mL，-18℃冷藏。

B.基质标准曲线定量

在4.0ml空白牛奶样品中加入混合标准溶液0μL，20μL，40μL，80μL，160μL，320μL，按上述前处理方法进行样品提取和净化后，以浓度为横坐标，仪器响应值(响应值＝标准品峰面积/标准品质量)为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据。

2.3超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定(UPLC-MS/MS)

A.超高效液相分离

液相条件为：

a)色谱柱Acquity Waters HSS-T₃，2.1mm×100mm，1.8μm；

b)色谱柱温度：40℃；

c)如果质谱采用Run1正离子模式测定，进样量为将步骤(1)得到的上样液稀释4倍后的10μL；如果质谱采用Run2正离子模式和Run3负离子模式测定，进样量为步骤(1)得到的上样液10μL；

d)流速：0.4mL/min

e)如果质谱采用Run1正离子模式和Run2正离子模式测定，那么选择流动相A₂：0.1％甲酸水溶液，流动相B₂：含0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱程序(以体积百分比记)为：0-2.3min，98-80％A₂；2.3-8min，80-0％A₂；8-10min，0％A₂；10-10.5min，0-98％A₂；10.5-12min，98％A₂；各洗脱时间段中均以流动相B₂补足余下的％数；

如果质谱采用Run3负离子模式测定，那么选择流动相A₁：2.5mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B₁：甲醇；梯度洗脱程序(以体积百分比记)为：0-6min，98-0％A₁；6-10min，0％A₁；10-10.5min，0-98％A₁；10.5-12min，98％A₁；各洗脱时间段中均以流动相B₁补足余下的％数(如表1所示)；

表1.目标物的UPLC-MS/MS参数设置

f)流路切换：0～0.55min切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，0.56min后开始质谱采集；

B.质谱检测

质谱条件为：

a)采用电喷雾离子化电离源，毛细管电压：正离子、负离子电压分别为3.5kV和3.0kV；

b)MRM多通道监测方式

c)离子源温度：150℃，去溶剂气温度：450℃；

d)锥孔反吹气流速：50L/h，去溶剂流速：700L/h

e)碰撞气体：氩气3.3×10^-3 mba(毫巴)

检测分组方案：根据流动相的选择、定容溶剂的选择与化合物在色谱柱的保留行为，确立了检测分组方案。Run1正离子模式适合极性较强的药物，定容溶剂为水∶乙醇∶乙腈(88∶6∶6，(v/v/v))(见附表2)。Run2适合正离子离子模式下的极性偏弱药物，定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(10∶5∶5，(v/v/v))(见附表3)。Run3负离子模式下适合极性和非极性的药物，定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(10∶5∶5，(v/v/v))(见附表4)。

(4)浓度计算方法和检测限

样品中待测物的含量根据计算公式(1)得到计算得到，结果保留到小数点后1位： $X=\frac{C\×V\×1000}{m\×1000}...\left(1\right)$

式中：X-试样中待测物含量，单位为微克每公斤(μg/L)；

C-试样处理液中待测物浓度，根据基质添加标准曲线计算得到，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V-定容体积，单位为毫升(mL)；

m-试样体积，单位为毫升(mL)。

3.验证试验

下列表格为用于验证该方法的283种药物的分组方案

表2.Run1：上样液稀释4倍后，在正离子模式下采集包括激动剂类、阻断剂类、甲状腺抑制剂类、四环素类、喹恶啉类(除乙氧喹啉外)、磺胺类、咪唑类、哒唑类和部分内酰胺类(除阿莫西林外)、非法添加物类等极性较强的药物，定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(88∶6∶6，(v/v/v))。

表3. Run2：在正离子模式下，采集主要包括抗寄生虫药类、阿维菌素类、性激素类、皮质激素类、真菌毒素类、大环内酯类、β-内酰胺类、镇定剂类、农药杀虫剂类、染料类、非甾类消炎药类等极性中等偏弱的药物。定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(10∶5∶5，(v/v/v))。

表4. Run3：在负离子模式下，采集抗寄生虫药物类、氯霉素类、环境激素、氢化可的松、真菌毒素(棒曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮)、部分非甾药类和农药类。定容溶剂为：水∶乙醇∶乙腈(10∶5∶5，(v/v/v))。

上述小分子有毒有害物质最低检测限均满足欧盟和我国对牛奶的残留限量要求。所有上述化合物回收率范围在50-150％，精密度范围在0-33％，其中95％以上的化合物的回收率在70-120％，95％以上的化合物的精密度在0-15％，绝大部分上述化合物满足分析要求。

Claims (6)

1.一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)样品前处理及提取净化

将液体牛奶加入试管中，并在试管中加入保护剂和乙腈-乙醇混合液，混匀后离心得到第一上清液，将第一上清液加入离心管中，并在离心管中加入乙腈-乙醇混合液，充分混匀后离心得到第二上清液，将第二上清液转移至鸡心瓶中于40℃旋转蒸发至干，然后用乙腈-乙醇-水混合液定容得到样品液，将样品液摇匀后，通过0.22μm微孔滤膜过滤得到上样液；

(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

氯霉素和β₂-激动剂类分别为20ng/mL，三聚氰胺、双聚氰胺、纳他霉素分别为2000ng/mL，阻断剂、甲状腺抑制剂、喹恶啉类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺、咪唑类、哒唑类、咖啡因、抗寄生虫药类、阿维菌素类、性激素类、皮质激素、喹恶啉类、真菌毒素类、大环内酯类、非甾类消炎药、β-内酰胺、镇定剂、农药杀虫剂、染料类、雌激素、皮质激素、环境激素和农药类(除草剂)均为200ng/mL，-18℃冷藏；

B.基质标准曲线定量

在4.0ml空白牛奶样品中加入混合标准溶液0μL，20μL，40μL，80μL，160μL，320μL，按步骤(1)所述的样品前处理及提取净化方法进行处理，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据，其中，响应值＝标准品峰面积/标准品质量；

(3)超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定

A.高效液相分离

液相条件为：

a)色谱柱Acquity Waters HSS-T₃，2.1mm×100mm，1.8μm；

b)色谱柱温度：40℃；

c)如果质谱采用Run1正离子模式进行测定，进样量为将步骤(1)得到的上样液稀释4倍后取10μL；

如果质谱采用Run2正离子模式和Run3负离子模式进行测定，进样量为步骤(1)得到的上样液10μL；

d)流速：0.4mL/min

e)如果质谱采用Run3负离子模式进行测定，那么选择流动相A₁：2.5mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B₁：甲醇；梯度洗脱程序(以体积百分比记)为：0-6min，98-0％A₁；6-10min，0％A₁；10-10.5min，0-98％A₁；10.5-12min，98％A₁；各洗脱时间段中均以流动相B₁补足余下的％数；

如果质谱采用Run1正离子模式和Run2正离子模式进行测定，那么选择流动相A₂：0.1％甲酸水溶液，流动相B₂：含0.1％甲酸的甲醇；梯度洗脱程序(以体积百分比记)为：0-2.3min，98-80％A₂；2.3-8min，80-0％A₂；8-10min，0％A₂；10-10.5min，0-98％A₂；10.5-12min，98％A₂；各洗脱时间段中均以流动相B₂补足余下的％数；

f)流路切换：0～0.55min切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，0.56min后开始质谱采集；

B.质谱检测

质谱条件为：

a)采用电喷雾离子化电离源，毛细管电压：正离子、负离子电压分别为3.5kV和3.0kV；

b)多通道监测方式MRM：

c)离子源温度：150℃，去溶剂气温度：450℃；

d)锥孔反吹气流速：50L/h；去溶剂流速：700L/h

e)碰撞气体：氩气3.3×10^-3毫巴

g)分组方案：极性较强的药物选择Run1正离子模式下进行测定，Run1正离子模式定容溶剂为水、乙醇和乙腈按体积比为88∶6∶6的比例混合；极性偏弱药物选择Run2正离子模式下进行测定，Run2正离子模式定容溶剂为水、乙醇和乙腈按体积比为10∶5∶5的比例混合；极性和非极性的药物选择Run3负离子模式下进行测定，Run3负离子模式定容溶剂为水、乙醇和乙腈按体积比为10∶5∶5的比例混合；

(4)浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

$X=\frac{C\×V\×1000}{m\×1000}...\left(1\right)$

式中：

X-试样中待测物含量，单位为微克每公斤(μg/L)；

C-试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V-定容体积，单位为毫升(mL)；

m-试样体积，单位为毫升(mL)。

2.根据权利要求1所述的一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，其特征在于：所述的液体牛奶、所述的保护剂和所述的乙腈-乙醇混合液的混合比为4.0mL∶150mg∶5mL；所述的第一上清液与乙腈-乙醇混合液的混合体积比为9∶62；所述的乙腈-乙醇混合液中乙腈与乙醇的混合体积比为9∶1；所述的乙腈-乙醇-水混合液中乙腈、乙醇与水的混合体积比为1∶1∶2。

3.根据权利要求2所述的一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，其特征在于：所述的保护剂为固体EDTA-Na₂。

4.根据权利要求3所述的一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，其特征在于：称取4.0mL牛奶于15mL试管中，加入150mg EDTA-Na₂混匀，再加入5mL乙腈-乙醇混合液混匀30s，0℃冷冻离心10min得到第一上清液，取4.5mL第一上清液于50mL离心管中，加入31mL乙腈-乙醇混合液，充分混匀，0℃冷冻离心10min得到第二上清液，将第二上清液转移至100mL鸡心瓶，40℃旋转蒸发至干，用乙腈-乙醇-水混合液定容至1.0mL得到样品液，摇匀后样液通过0.22μm微孔滤膜过滤得到上样液。

5.根据权利要求4所述的一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，其特征在于：所述的0.22μm微孔滤膜固定在多通道针式过滤装置上。

6.根据权利要求1所述的一种液态奶中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的离心条件为温度-1～1℃，转速4500转/min，时间10min。