CN112684040A

CN112684040A - 一种牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法

Info

Publication number: CN112684040A
Application number: CN202011478549.3A
Authority: CN
Inventors: 高素兰
Original assignee: Shandong Continental Testing Co ltd
Current assignee: Shandong Continental Testing Co ltd
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明公开了一种牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，该方法采用酸化乙腈提取，QuEChERS技术净化，前处理过程无需过柱，前处理耗时短，回收率高，检测灵敏度高，适用于牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的测定。通过对现有检测技术中的各种参数进行调整，尤其是对流动相以及样品前处理时对其处理所采用的溶剂、条件等进行优化，简化了检测过程，节约检测时间，更适合大批量的检测的工作。

Description

一种牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法

技术领域

本发明涉及兽药检测技术领域，具体涉及一种牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法。

背景技术

近年来，食品安全事件频发，人们对食品中激素类残留尤为关注。孕激素类药物在畜禽养殖中可以提高饲料转化率，促进动物生长等作用，畜牧业中非法滥用孕激素类药物问题十分严重。我国农业部176号公告明确规定，禁止饲料和动物饮用水中添加炔诺醇，左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，并在235号公告规定了甲羟孕酮等在动物源性食品中不得检出。甲基炔酮(又名左炔诺孕酮)作为应用较广的一种口服避孕药，检测方法存在缺失。我们需要及时建立牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的快速检测方法，不断寻找出检测时间短、灵敏度好、选择性好、操作性简单的样品前处理技术，以便加大监测力度，及时反应牛奶和奶粉中去甲基炔酮残留的必要性，满足当下人民对身体健康和食品安全的诉求。

现有的检测方法如《GB/T 21981-2008动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱-质谱法》前处理过程相对繁琐，需要酶解过夜提取，后经固相萃取柱净化，耗时较长，检测成本较高。

发明内容

为解决现有技术中缺陷，本发明提供一种牛奶和奶粉中甲基炔酮残留的快速检测方法，该方法灵敏度高，稳定性高，操作简单，并且检出限更低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)配制标准品溶液：首先制备标准储备溶液，称取适量的甲基炔酮标准品，用甲醇配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液，于-18℃冰箱中保存；然后将标准储备液用甲醇配制成浓度为10μg/mL的中间浓度混合标准溶液，于4℃冰箱中保存；然后将中间标准液用甲醇配制成浓度为1μg/mL的混合标准工作液，于4℃冰箱中保存；

制作标准曲线时将标准储备液用空白基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的标准品溶液备用。

(2)醋酸乙腈溶液：吸取10ml的醋酸用乙腈定容到1000ml的容量瓶中配制成浓度为1％的醋酸乙腈溶液。

(3)10％甲醇水(含0.1％的甲酸)溶液：10ml甲醇加水定容到100ml，加入100μl甲酸，配制成10％甲醇水含0.1％的甲酸溶液。

(4)待测样品前处理：

A.提取：称取牛奶或奶粉2g(精确至0.01g)试样于50mL离心管中，回收中另加入1μg/mL甲基炔酮标准溶液10μL，加入1％醋酸乙腈溶液15mL。涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min，在转速为4000r/min的离心机中离心5min；

B.净化：将上清液全部转移到准备好的净化管中，所述净化管中包括10g无水硫酸钠、0.5g C₁₈、0.2g PSA；涡旋混匀5min，4000r/min离心5min。吸取7.5mL上清液于10mL离心管中，于40℃水浴中氮气吹干。

C.复溶：向吹干的离心管中加入0.5mL含0.1％甲酸的10％甲醇水，超声30S，涡旋混匀5min，过0.22um滤膜，待上机测试。

空白基质溶液除不加标准溶液，其余操作按照A.B.C进行。

(5)将前处理好的样液用液相色谱-串联质谱仪定量分析，对待测样品进行定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中地塞米松残留的含量，具体如下：

A、将步骤(1)配制的不同浓度的甲基炔酮残留标准工作曲线，用液相色谱-质谱联用仪分析检测，进样体积为5.0μL，获得标准品溶液的总离子流图、定量离子色谱图和定性离子对色谱图；

B、取5.0μL待测样品溶液进样，用液相色谱-质谱联用仪分析检测，得到待测样品溶液的总离子流色谱图、定量离子对色谱图和定性离子对色谱图；

C、以甲基炔酮的定量离子峰面积和浓度分别为横纵坐标，得到地塞米松标准工作曲线；

D、根据待测样品溶液中甲基炔酮残留的定量离子峰面积，结合标准曲线，计算得到待测样液中地塞米松的浓度C，并按以下公式计算得到牛奶和奶粉中甲基炔酮残留的含量X，含量计算公式为：

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

其中X是待测样品中奶粉和牛奶甲基炔酮的含量，单位为μg/kg；C是待测样品中地塞米松残留的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品最终溶解体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g；f是稀释倍数。

其中液相色谱-串联质谱仪的色谱条件为：

液相色谱条件：

a)色谱柱：Rapid Resolution HD 3.0X100mm 1.8-Micron

b)流动相及梯度：乙腈+0.1％甲酸5mM乙酸铵水溶液

表1流动相梯度洗脱

c)结束时间：5min

d)流速：0.4mL/min

e)柱温：30℃

f)进样量：5μL

质谱条件：见表2，表3。

表2安捷伦6460QQQ

表3甲基炔酮监测离子对及其相应的碰撞能量

本发明的有益效果为：

(1)整个检测样品前处理过程简单、快速，同现有方法相比，大大提高了检测效率。

(2)提取环节选择酸化乙腈，无需酶解过夜，即可有效对目标物进行提取，有效提高被提取物地塞米松的提取效率，缩短样品前处理时间，提高了检测效率。

(3)净化过程更加简便，用QuECHERS技术取代现有的固相萃取柱净化过程，既节省了操作时间，同时也节约了试验成本。

(4)适用于复杂基质样本牛奶和奶粉的检测，目前QuECHERS技术多用于蔬菜、水果、土壤等成分较简单的基质，对于奶粉等高蛋白等成分复杂的样品应用较少，本发明通过优化选择无水硫酸钠、C₁₈、PSA三种物质作为净化填料，并对净化填料比例进行优化(无水硫酸钠：C₁₈：PSA质量比为10g：0.5g：0.2g)，高纯度、高可控比表面积保证了稳定萃取效率，与传统检测方法相比，操作简便、重现性好，回收率高。

(5)传统检测方法中主要是通过C₁₈固相萃取柱净化，其过程需经活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，耗时较长，且需要通过固相萃取装置控制流速，不适合大批量样品，在发明中采用C₁₈粉末分散净化，耗时更少，更适用于大批量样品的检测。

(6)本发明能够准确检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量，回收率在80％-120％之间，检出限为0.5μg/kg，检出限更低。

(7)本发明通过对仪器条件进行优化调整，采集一针样品所需时间仅为5min，同现有方法《GB/T 21981-2008动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱-质谱法》一针采集时间17min相比，大大缩短了检测时限。

附图说明

图1是样液中甲基炔酮标准品总离子流图；

图2是标准对照溶液中甲基炔酮标准品总离子流图；

图3是检出限浓度添加回收样液中甲基炔酮的信噪比谱图；

图4是甲基炔酮的标准曲线；

图5是样液中甲基炔酮的定量离子对色谱图；

图6是标准对照溶液中甲基炔酮的定量定性离子对色谱图；

具体实施方式

下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

一、所选试剂

1.甲基炔酮标准品

2.冰醋酸

3.乙腈

4.正己烷

5.无水硫酸钠

6.甲醇

7.甲酸

8.C18：50um

9.PSA：40-60um

二、所使用的仪器

1、离心管，2、氮吹仪：N-EVA p112；3、离心机：SIGMA 3K15，4、瓶口分液器(10～50mL)，5、移液枪，6、涡旋振荡器；德国Heidolph MULTI REAX，7、液相色谱/串联质谱仪(配备电喷雾离子源)：安捷伦1290+6460QQQ，8、十万分之一天平：METTER TOLEDO XS205，9、万分之一天平：METTER TOLEDO ME204E

三、试验

(4)待测样品前处理：

空白基质溶液除不加标准溶液，其余操作按照A.B.C进行。

(5)将前处理好的样品用液相色谱-质谱联用仪定量分析，对待测样品定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中甲基炔酮残留的含量。

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

具体地，液相色谱-质谱联用仪的质谱条件为：

离子化模式：电喷雾电离负离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷射电压：2000V；Delta EM：200V；雾化器压力：40psi；干燥气流量：10L/min；干燥气温度：345℃。

四、过程优化及分析

本发明实验过程对提取溶剂、净化填料的选择配比分别进行了优化测试，根据所测回收率情况，最终选择提取溶剂为：1％醋酸乙腈，填料及配比为：无水硫酸钠+C₁₈+PSA＝10g+0.5g+0.2g。

具体比对结果见表4～表7。

(1)提取溶剂选择优化

选择常规方法所用甲醇、乙腈、以及不同浓度梯度的酸化乙腈对阳性样品进行提取，测定回收率情况，由表4可见：甲醇提取效果不如乙腈，本方法选择1％醋酸乙腈提取效果更高。

表4提取溶剂比例优化结果

(2)净化填料选择优化

目前QuEChERS技术常用净化填料有：无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠、C₁₈、PSA、石墨化炭黑、氧化铝等。结合待测基质牛奶和奶粉成分组成，选择无水硫酸钠去除水分，PSA(N-丙基乙二胺)去除脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖。C₁₈官能团对非极性的组分有吸附作用，可以去除油脂类物质。对于所选填料配比进行优化，测定回收率，统计如表5-7，经过对比最终选择回收效果最好的配比：水硫酸钠+C₁₈+PSA＝10g+0.5g+0.2g作为最终方案。

表5净化填料无水硫酸钠用量优化表

无水硫酸钠	C<sub>18</sub>	PSA	回收率/％
				5g	0.5g	0.2g	91.26
10g	0.5g	0.2g	94.21
				15g	0.5g	0.2g	92.65
20g	0.5g	0.2g	93.33

表6净化填料C₁₈用量优化表

无水硫酸钠	C18	PSA	回收率/％
				10g	0.2g	0.2g	92.63
10g	0.5g	0.2g	95.16
				10g	1.0g	0.2g	93.86
10g	2.0g	0.2g	94.13

表7净化填料PSA用量优化表

无水硫酸钠	C<sub>18</sub>	PSA	回收率/％
				10g	0.5g	0.1g	93.51
10g	0.5g	0.2g	95.67
				10g	0.5g	0.5g	94.62
10g	0.5g	1.0g	93.56

五、检测结果及分析

(1)检出限

选择检出限水平(0.5μg/kg)进行添加回收测试，得出其的信噪比S/N为88.9，见图3，计算得出信噪比等于10时，对应浓度为即方法定量限可低至0.06μg/kg。

(2)标准曲线的线性

用空白基质配制浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL标准工作曲线，按照上述检测方法进行测定。

从图4得出：标准曲线线性相关系数大于0.99，满足要求。

(3)回收率与检出限

选择检出、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平添加，重复测定次数为6，也就是本发明分别以0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg进行加标测定，回收率结果见表8。

表8回收率与准确性测定结果

从表中可以看出，该试验回收率均在90％以上，回收率满足要求，计算相对标准偏差，小于10％，方法重复性满足要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明内。

Claims

1.一种牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，所述方法包括如下步骤：

制作标准曲线时将标准储备液用空白基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的标准品溶液备用；

(2)待测样品前处理：

A.提取：称取牛奶或奶粉2.00g试样于50mL离心管中，回收中另加入1μg/mL甲基炔酮标准溶液10μL，加入1％醋酸乙腈溶液15mL。涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min，在转速为4000r/min的离心机中离心5min；

B.净化：将上清液全部转移到准备好的净化管中，所述净化管中包括10g无水硫酸钠、0.5g C₁₈、0.2g PSA；涡旋混匀5min，4000r/min离心5min；吸取7.5mL上清液于10mL离心管中，于40℃水浴中氮气吹干；

C.复溶：向吹干的离心管中加入0.5mL含0.1％甲酸的10％甲醇水，超声30S，涡旋混匀5min，过0.22um滤膜，待上机测试；

(3)将前处理好的样品用液相色谱-质谱联用仪定量分析，对待测样品进行定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中甲基炔酮残留的含量。

2.根据权利要求1所述的牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，其特征在于，步骤(3)具体如下：

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

3.根据权利要求1所述的牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，其特征在于其中液相色谱-质谱联用仪的色谱条件为：

a)色谱柱:Rapid Resolution HD 3.0X100mm 1.8-Micron；

b)流动相及梯度：乙腈+0.1％甲酸5mM乙酸铵水溶液；

c)结束时间：5min；

d)流速：0.4mL/min；

e)柱温：30℃；

f)进样量：5μL。

4.根据权利要求3所述的牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，其特征在于，所述乙腈和乙酸铵的体积比为(20～90):(10～80)。

5.根据权利要求3所述的牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体情况见下表：

表1 流动相梯度洗脱

6.根据权利要求2所述的牛奶和奶粉中甲基炔酮残留量的检测方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪检测时的质谱条件为：

离子化模式：电喷雾电离负离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷射电压：4000V；Delta EM：200V；雾化器压力：40psi；干燥气流量：7L/min；干燥气温度：325℃。

7.根据权利要求1所述的牛奶和奶粉中地塞米松残留量的检测方法，其特征在于，在步骤(2)的提取过程中，对于含油脂较多的样品，除了添加1％醋酸乙腈溶液15mL外，还需要加入10mL正己烷，在步骤(2)的净化过程中，加入正己烷的样品需将正己烷除去。