CN112285255A

CN112285255A - 一种检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法

Info

Publication number: CN112285255A
Application number: CN202011207455.2A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 高素兰; 刘清亮; 孙艳丽
Original assignee: Shandong Baier Detection Ltd By Share Ltd
Current assignee: Shandong Baier Detection Ltd By Share Ltd
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2021-01-29

Abstract

本发明公开了一种检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，该方法特异性强、灵敏度高,稳定性好，采用酸化乙腈提取，QuEChERS技术净化，前过程无需过柱，操作简单，并且检出限更低。通过对现有检测的技术中的各种参数进行调整，尤其是对流动相以及样品前处理时所采用的溶剂、条件等进行优化，简化了检测过程，节约检测时间，更适合大批量的检测的工作。

Description

一种检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法

技术领域

本发明涉及兽药检测技术领域，具体涉及牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定。

背景技术

地塞米松是一种人工合成的皮质类固醇，简称为DEX，具有抗炎及抗过敏的效果，能抑制结缔组织的增生，降低毛细血管和细胞膜的通透性，减少炎性渗出，抑制组织胺和其他毒性物质的形成与释放，促进蛋白质转变成糖，减少糖的利用；主要应用于各种炎症、严重感冒、传染病、过敏性疾病、风湿、休克、代谢疾病及引产，但是长期使用，容易导致水肿、低血钾、肌萎缩、骨质疏松、脱钙、病理性骨折、糖尿、幼畜生产停滞等。

一些违法养殖场为了缩短养殖周期，给动物大量喂食地塞米松，这是一种肾上腺皮质激素类药物，能使动物体重增加，但是这种做法的后果就是给人们的食品带来安全隐患，地塞米松的残留将对消费者的身体健康产生危害，从长远看还会对养殖业的发展和市场的正常秩序产生影响。因此，采取有效的措施，对其残留进行积极的检测和监控，防止残留超标的动物源性食品流入市场，成为当务之急。目前各国严格禁止地塞米松作为生长激素使用，同时限制此药物用于动物源性食品中。其中，牛奶和奶粉作为大多数婴儿和成年人的必需食品，但是近年来却一直有地塞米松检出量超标事件的发生。我国及欧盟规定牛奶中的地塞米松的最大残留限量为0.3ug/kg，日本肯定列表中的牛奶中的残留限量为0.02mg/kg。

因此，我们需要及时建立牛奶和奶粉中地塞米松残留量的快速检测方法，不断寻找出检测时间短、灵敏度好、选择性好、操作性简单的样品前处理技术，以便加大监测力度，及时反映牛奶和奶粉中去地塞米松残留的必要性，满足当下人民对身体健康和食品安全的诉求。

现有的检测方法如《农业部1031号公告-2-2008动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测液相色谱-串联质谱法》、《GB/T 22978-2008牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定液相色谱-串联质谱法》等方法前处理方法相对繁琐，需要C₁₈固相萃取柱净化，前处理过程耗时过长同时检测成本较高。尤其是对于牛奶和奶粉这种需求量大的产品，检测样品多，如何能够缩短检测时间以及提高检测效率是节省成本的关键因素。因此在现有技术上的基础上改进检测条件，缩短检测时间是急需解决的问题。

发明内容

为解决现有技术中缺陷，本发明提供一种牛奶和奶粉中地塞米松残留的快速检测方法。该方法灵敏度高，稳定性高，操作简单，效率高，并且检出限更低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牛奶和奶粉中地塞米松残留的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)配制标准品溶液：首先制备标准储备液，称取适量的地塞米松标准品，用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃冰箱中保存；将标准储备液用甲醇配制成浓度为10μg/mL的标准中间液，于4℃冰箱中保存；将标准中间液用甲醇配制成浓度为1.0μg/mL和0.1μg/mL的标准工作液，于4℃冰箱中保存；

根据实验需要，吸取标准工作溶液，用空白样品基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的标准品工作曲线，现用现配。

(2)醋酸乙腈溶液：吸取10ml的醋酸用乙腈定容到1000ml的容量瓶中配制成浓度为1％的醋酸乙腈溶液。

(3)10％甲醇水(含0.1％的甲酸)溶液：10ml甲醇加水定容到100ml，加入100μl甲酸，配制成10％甲醇水含0.1％的甲酸溶液。

(4)待测样品前处理：

A.提取：称取牛奶或奶粉2.00g(精确至0.01g)试样于50mL离心管中，回收过程中另加入0.1μg/mL地塞米松标准溶液10μL，1％醋酸乙腈溶液15mL(含油脂较多的样品加10mL正己烷)。涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min，在转速为4000r/min的离心机中离心5min；

B.净化：将上清液(加正己烷的样品需将正己烷除去)全部转移到准备好的净化管(10g马弗炉烘过的无水硫酸钠、0.5g C₁₈、0.2g PSA)中，涡旋混匀5min，转速为4000r/min离心机中离心5min。吸取7.5mL上清液于10mL离心管中，于40℃水浴中氮气吹干。

C.复溶：向吹干的离心管中加入0.5mL定溶液(10％甲醇水含0.1％的甲酸)，超声30S，涡旋混匀5min，过0.22um滤膜，待上机测试。

空白基质溶液除不加标准溶液，其余操作按照A.B.C进行。

(5)将前处理好的样液用液相色谱-串联质谱仪定量分析，对待测样品进行定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中地塞米松残留的含量，具体如下：

A、将步骤(1)配制的不同浓度的地塞米松标准工作曲线，用液相色谱-串联质谱仪分析检测，进样体积为5.0μL，获得标准品溶液的总离子流图、定量离子色谱图和定性离子对色谱图；

B、取5.0μL待测样品溶液进样，用液相色谱-串联质谱仪分析检测，得到待测样品溶液的总离子流图、定量离子对色谱图和定性离子对色谱图；

C、以地塞米松的定量离子峰面积和浓度分别为横纵坐标，得到地塞米松标准工作曲线；

D、根据待测样品溶液中地塞米松残留的定量离子峰面积，结合标准曲线，计算得到待测样液中地塞米松的浓度C，并按以下公式计算得到牛奶和奶粉中地塞米松的含量X，含量计算公式为：

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

其中X为待测样品中奶粉和牛奶地塞米松的含量，单位为μg/kg；C是待测样品中地塞米松残留的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品溶解体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g；f是稀释倍数。

其中液相色谱-串联质谱仪的色谱条件为：

液相色谱条件：

a)色谱柱:Rapid Resolution HD 3.0X100mm 1.8-Micron；

b)流动相及梯度：乙腈+0.1％甲酸5mM乙酸铵水溶液；

表1流动相梯度洗脱

c)结束时间：5min；

d)流速：0.4mL/min；

e)柱温：30℃；

f)进样量：5μL。

质谱条件：见表2，表3。

表2安捷伦6460QQQ

表3地塞米松监测离子对及其相应的碰撞能量

本发明的有益效果为：

(1)整个检测样品前处理过程简单、快速，同现有方法相比，大大提高了检测效率。

(2)提取环节选择酸化乙腈，有效提高被提取物地塞米松的提取效率，提高了方法回收率。

(3)净化过程更加简便，用QuECHERS技术取代现有的固相萃取柱净化过程，既节省了操作时间，同时也节约了试验成本。

(4)适用于复杂基质样本牛奶和奶粉的检测，目前QuECHERS技术多用于蔬菜、水果、土壤等成分较简单的基质，对于奶粉等高蛋白等成分复杂的样品应用较少，本发明通过优化选择无水硫酸钠、C₁₈、PSA三种物质作为净化填料，并对净化填料比例进行优化(无水硫酸钠：C₁₈：PSA质量比为10g：0.5g：0.2g)，高纯度、高可控比表面积保证了稳定萃取效率，与传统检测方法相比，操作简便、重现性好，回收率高。

(5)传统检测方法中主要是通过C₁₈固相萃取柱净化，其过程需经活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，耗时较长，且需要通过固相萃取装置控制流速，不适合大批量样品，在发明中采用C₁₈粉末分散净化，耗时更少，更适用于大批量样品的检测。

(6)本发明能够准确检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量，回收率在80％-120％之间，检出限为0.5μg/kg，检出限更低。

(7)本发明通过对仪器条件进行优化调整，采集一针样品所需时间仅为5min，同现有方法《农业部1031号公告-2-2008动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测液相色谱-串联质谱法》一针采集时间30min相比，大大缩短了检测时限。

附图说明

图1是样液中地塞米松标准品总离子流图；

图2是标准溶液中地塞米松标准品总离子流图；

图3是检出限浓度添加回收样液中地塞米松的信噪比谱图；

图4是地塞米松的标准曲线；

图5是样液中地塞米松的定量定性离子对色谱图；

图6是标准溶液中地塞米松的定量定性离子对色谱图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

一、所选试剂

1.地塞米松标准品

2. 1％醋酸乙腈溶液

3.乙腈

4.正己烷

5.无水硫酸钠

6.甲醇

7.甲酸

8.C₁₈：50um

9.PSA：40-60um

二、所使用的仪器

1、离心管，2、氮吹仪：N-EVA p112；3、离心机:SIGMA 3K15，4、瓶口分液器(10～50mL)，5、移液枪，6、涡旋振荡器；德国Heidolph MULTI REAX，7、液相色谱/串联质谱仪(配备电喷雾离子源)：安捷伦1290+6460QQQ，8、十万分之一天平：METTER TOLEDO XS205，9、万分之一天平：METTER TOLEDO ME204E

三、试验

根据实验需要，吸取标准工作溶液，用空白样品基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的标准品工作曲线，现用现配；

(2)醋酸乙腈溶液：吸取10ml的醋酸用乙腈定容到1000ml的容量瓶中配制成浓度为1％的醋酸乙腈溶液；

(3)10％甲醇水(含0.1％的甲酸)溶液：10ml甲醇加水定容到100ml，加入100μl甲酸，配制成10％甲醇水含0.1％的甲酸溶液；

(4)待测样品前处理：

A.提取：称取牛奶或奶粉2g(精确至0.01g)试样于50mL离心管中，回收中另加入0.1μg/mL地塞米松标准溶液10μL，1％醋酸乙腈溶液15mL(含油脂较多的样品加10mL正己烷)；涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min，在转速为4000r/min的离心机中离心5min；

C.复溶：向吹干的离心管中加入0.5mL定溶液(含0.1％的甲酸的10％甲醇水)，超声30S，涡旋混匀5min，过0.22um滤膜，待上机测试。

空白基质溶液除不加标准溶液，其余操作按照A.B.C进行。

(5)将前处理好的样品用液相色谱-质谱联用仪定量分析，对待测样品定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中地塞米松残留的含量。

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

其中，液相色谱-质谱联用仪的质谱条件为：

离子化模式：电喷雾电离负离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷射电压：2000V；Delta EM：200V；雾化器压力：40psi；干燥气流量：10L/min；干燥气温度：345℃。

四、过程优化及分析

本发明实验过程对提取溶剂、净化填料的选择配比分别进行了优化测试，根据所测回收率情况，最终选择提取溶剂为：1％醋酸乙腈，填料及配比为：无水硫酸钠+C₁₈+PSA＝10g+0.5g+0.2g。

具体比对结果见表4～表7。

(1)提取溶剂选择优化

选择常规方法所用乙酸乙酯、乙腈、以及不同浓度梯度的酸化乙腈对阳性样品进行提取，测定回收率情况，由表4可见：乙酸乙酯同1％醋酸乙腈提取效率相差不大，但乙酸乙酯易挥发、危害性更大，本方法选择1％醋酸乙腈降低了对检测人员的毒性。

表4提取溶剂比例优化结果

提取溶剂	回收率/％
		乙酸乙酯	97.33
乙腈	93.37
		1％醋酸乙腈	97.56
5％醋酸乙腈	90.24
		10％醋酸乙腈	89.61

(2)净化填料选择优化

目前QuEChERS技术常用净化填料有：无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠、C₁₈、PSA、石墨化炭黑、氧化铝等。结合待测基质牛奶和奶粉成分组成，选择无水硫酸钠去除水分，PSA(N-丙基乙二胺)去除脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖。C₁₈官能团对非极性的组分有吸附作用，可以去除油脂类物质。对于所选填料配比进行优化，测定回收率，统计如表5-7，经过对比最终选择回收效果最好的配比：水硫酸钠+C₁₈+PSA＝10g+0.5g+0.2g作为最终方案。

表5净化填料无水硫酸钠用量优化表

无水硫酸钠	C<sub>18</sub>	PSA	回收率/％
				5g	0.5g	0.2g	93.56
10g	0.5g	0.2g	95.03
				15g	0.5g	0.2g	94.13
20g	0.5g	0.2g	93.45

表6净化填料C₁₈用量优化表

表7净化填料PSA用量优化表

无水硫酸钠	C<sub>18</sub>	PSA	回收率/％
				10g	0.5g	0.1g	95.43
10g	0.5g	0.2g	96.58
				10g	0.5g	0.5g	96.28
10g	0.5g	1.0g	95.19

五、检测结果及分析

(1)检出限

选择检出限水平(0.5μg/kg)进行添加回收测试，得出其的信噪比S/N为338.9，见图3，计算得出信噪比等于10时，对应浓度为即方法定量限可低至0.005μg/kg。

(2)标准曲线的线性

用空白基质配制浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL做标准工作曲线，按照上述检测方法上机测定。

从图6得出地塞米松标准曲线线性相关系数大于0.99，满足要求。

(3)回收率与准确性

选择检出、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平添加，重复测定次数为6，也就是本发明分别以0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg进行加标测定，回收率结果见表8。

表8回收率与准确性测定结果

从表中可以看出，该试验回收率均在90％以上，回收率满足要求，计算相对标准偏差，小于10％，方法重复性满足要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明内。

Claims

1.一种检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)配制标准品溶液：首先制备标准储备液，称取适量的地塞米松标准品，用甲醇配制成浓度为10μg/L的标准储备液，于-18℃冰箱中保存；然后将标准储备液用甲醇配制成浓度为1000μg/mL的混合标准工作液，于4℃冰箱中保存；

制作标准曲线时将标准工作液用空白基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的标准品溶液备用；

(2)待测样品前处理：

A.提取：称取牛奶或奶粉2.00g试样于50mL离心管中，回收过程中另加入1000ng/mL地塞米松标准溶液20μL，1％醋酸乙腈溶液15mL；涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min，在转速为4000r/min的离心机中离心5min；

B.净化：将上清液全部转移到准备好的净化管中，所述净化管中包括10g无水硫酸钠、0.5gC₁₈、0.2gPSA；涡旋混匀5min，转速为4000r/min离心机中离心5min；吸取7.5mL上清液于10mL离心管中，于40℃水浴中氮气吹干；

C.复溶：向吹干的离心管中加入0.5mL含0.1％甲酸的10％甲醇水，超声30S，涡旋混匀5min，过0.22um滤膜，待上机测试；

(3)将前处理好的样液用液相色谱-串联质谱仪定量分析，对待测样品进行定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中地塞米松残留的含量。

2.根据权利要求1所述的检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，其特征在于，步骤(3)具体如下：

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

其中X是待测样品中奶粉和牛奶地塞米松的含量，单位为μg/kg；C是待测样品中地塞米松残留的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品最终溶解体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g；f是稀释倍数。

3.根据权利要求1所述的检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，其特征在于所述液相色谱-串联质谱仪的色谱条件为：

a)色谱柱:Rapid Resolution HD 3.0X100mm1.8-Micron；

b)流动相及梯度：乙腈+0.1％甲酸5mM乙酸铵水溶液；

c)结束时间：5min；

d)流速：0.4mL/min；

e)柱温：30℃；

f)进样量：5μL。

4.根据权利要求3所述的检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，其特征在于，所述乙腈和乙酸铵水溶液的体积比为(20～90)：(10～80)。

5.根据权利要求3所述的检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体情况见下表：

6.根据权利要求3所述的检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪检测时的质谱条件为：

离子化模式：电喷雾电离负离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷射电压：4000V；Delta EM：200V；雾化器压力：40psi；干燥气流量：7L/min；干燥气温度：325℃。

7.根据权利要求1所述的检测牛奶和奶粉中地塞米松残留量的方法，其特征在于，在步骤(2)的提取过程中，对于含油脂较多的样品，除了添加1％醋酸乙腈溶液15mL外，还需要加入10mL正己烷，在步骤(2)的净化过程中，加入正己烷的样品需将正己烷除去。