CN107727769A - 一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛查牛奶中兽药残留的方法，样品经5%甲酸乙腈提取，QuEChERS EMR‑Lipid技术净化，LC‑QTOF筛查与确证。建立了134种药物的一级筛查谱库，对其中40中常用兽药进行了方法学验证，方法的灵敏度、准确性和重复性良好。对实际样品进行一级谱库扫描，对发现的兽药残留通过二级质谱解析进一步确证，最终采用标准物质进行验证。该法能发现日常检测难以发现的问题，满足评估和监管牛奶中的药物残留的要求。

Description

一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地说，涉及一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法。
背景技术
兽药已广泛应用于奶牛养殖业中，一定量的兽药使用可以预防和治疗奶牛疾病，减少奶牛养殖企业的损失，但是若违法添加、使用不当或过量使用会引起牛奶药物过度残留，并通过食物链进入人体，导致人体产生抗药性、过敏反应等，严重的可诱导疾病的发生，从而危害消费者健康，尤其是婴幼儿、老年人、患有疾病的特殊人群，可能会造成更大的危害。更有甚者，部分不法分子将人用抗生素用到奶牛上，导致了牛奶兽药残留问题愈加复杂。因此，评估和监管兽药在牛奶中的药物残留对保护消费者的权益和食品安全具有积极意义。
目前，兽药残留广泛采用的检测仪器设备为三重四级杆质谱，具备检出限低和灵敏度高等优势，可同时定量测定几类药物，但不能对化合物进行精确相对分子质量和断裂途径的测定。对未知的化合物不能进行筛查。牛奶中富含脂肪、磷脂、蛋白等基质干扰物质，样品前处理直接影响检测结果。目前兽药残留检测的净化方法主要采用固相萃取法，操作步骤复杂，成本较高。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，旨在提供了一种采用QuEChERS EMR-Lipid技术结合LC-QTOF快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法，发现日常检测难以发现的问题，满足评估和监管牛奶中的药物残留的要求。
有别于现有方法，本发明采用的QuEChERS EMR-Lipid技术进行前处理，特殊聚合物基质EMR专门吸附脂质中C5及以上的碳链，对脂质具有非常强的选择吸附性，这样在除掉基质干扰物的同时也不会吸附分析物。以往的样品前处理吸附剂以硅胶基质为主，上面键合C18或者是其它一些固定相，针对性差，对样品的回收率也较低，不但处理时间长而且也是误差的一个较大来源。检测仪器采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱，四级杆-飞行时间质谱属于高分辨质谱，能测定得到精确质量数（精确到小数点后4位），还可通过数据库进行一级和二级质量数匹配以确证化合物的存在。不仅能检测规定的兽药检测项目，而且还能在没有标准品的情况下筛查未知化合物。
本发明通过如下技术方案实现：
一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1 一级筛查库建立
根据农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》、国内外兽药使用和残留限量的相关标准。确定了134种常用药物进行筛查，分别为：乙酸丙嗪、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、阿苯达唑氨砜、四烯雌酮、金刚烷胺、羟氨苄青霉素、羟氨苄青霉噻唑酸、去羟基氨苄青霉噻唑酸、氨苄青霉素、氨苄青霉噻唑酸、去羟氨苄青霉噻唑酸、去甲雄三烯醇酮、阿托品、阿扎哌隆、阿奇霉素、坎苯达唑、咔唑心安、头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢洛宁、金霉素、氯丙嗪、西诺沙星、环丙沙星、克仑特罗、克仑塞罗、克仑潘特、克林霉素、邻氯青霉素、氯唑西林、邻氯青霉噻唑酸、去羟邻氯青霉噻唑酸、达氟沙星、地美环素、地塞米松、地西泮、双氯西林、二氟沙星、强力霉素、氟哌利多、红霉素、泛昔洛韦、非班太尔、芬苯哒唑、氟罗沙星、氟苯达唑氨基代谢产物、氟甲哇、氟轻松、依诺沙星、恩诺沙星、氟哌啶醇、异丙硝唑、交沙霉素、洛美沙星、马普特罗、马喷特罗、麻保沙星、甲苯哒唑、甲苯哒唑羟基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲硝唑、甲基强的松龙、萘夫西林、诺氟沙星、奥比沙星、奥芬达唑、奥苯达唑、氧氟沙星、苯唑西林、土霉素、喷布洛尔、苄青霉素、苄青霉噻唑酸、去羟苄青霉噻唑酸、奋乃静、培氟沙星、青霉素、毗呱酸、哌拉西林、泼尼松龙、孕酮、莱克多巴胺、班布特罗、倍氯米松、倍他米松、利巴韦林、罗红霉素、溴布特罗、沙拉沙星、司帕沙星、螺旋霉素、康力龙、苯甲酸磺胺、磺胺醋酸、磺胺喹恶琳、磺胺氯哒嗪、磺胺氯毗嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嗪、周效磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、左旋咪唑、特硝唑、睾酮、四环素、噻苯咪唑、5-羟基噻苯咪唑、泰妙菌素、替硝唑、群勃龙乙酸酯、甲氧苄啶、妥布特罗、泰乐菌素、甲苯噻嗪、赛拉嗪。
样品前处理
精确称取牛奶样品5g（精确至0.01g）,于50mL具盖离心管中,加入10.0毫升5%甲酸乙腈提取液及两粒陶瓷均质子，涡旋（2000rpm）混匀5分钟，离心5min(4000rpm)，移取5.0毫升醋酸铵水溶液（5mM)到15毫升EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm），移取5.0毫升离心后上层提取液到经过活化的EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm），离心5min(4000rpm)，将上层液完全倾倒入50.0mL离心管中，加入两粒陶瓷均质子及EMR polish粉包，快速剧烈振摇并涡旋2分钟（2000rpm）。离心5min(4000rpm)，移取上层乙腈液，待分析。
S3色谱分离
色谱仪:Agilent 1290 Infinity LC；色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100mm，1.8μm)；柱温:30℃；流速:0.4mL/min；进样体积:5μL；流动相:A:0.1%甲酸水，5mmol乙酸铵(ESI+)，B:甲醇。洗脱条件:0～1min，95%A，1～8min，95%～50%A，8～14min，50%～5%A，14～18min，5%～2%A，18～19.5min，2%～95%A，保持95%A 0.5min，等待下一次进样。
质谱检测
质谱仪:Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF；离子源:双喷射离子源Dual AJS ESI；雾化气:40psi；干燥气温度:325℃；干燥速率:7L/min；鞘气温度:350℃；鞘气流速:11L/min；毛细管电压:3500V；喷嘴电压:0V（ESI+）；碰撞解离电压:135V；扫描范围:100～1000m/z，二级质谱扫描范围和碰撞电压分别根据待测目标化合物设定；采集速率:一级1.5spectra/s，二级5spectra/s。
S5方法学确证
取空白纯牛奶样品，选取40种不同性质兽药进行方法学验证，按步骤S2所述的样品预处理方法进行处理净化，按步骤S3、S4所述的测定目标分析物相应强度。以分子离子峰面积Y对含量X(μg/L)作标准曲线。用基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，直到获得每种兽药的信噪比等于10(S/N=10)的浓度，确定其为该化合物的定量限(LOQ)。在20、40和80μg/kg 3个添加水平下，在空白基质中添加40种常见兽药，进行筛查确证，每个浓度水平取6份样品进行试验，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。
S6样品测定
S6.1 一级谱库扫描
按步骤S2-S4所述的上机测定目标分析物。利用建立的一级谱库，进行134种兽药残留的筛查，对样品中的化合物通过准分子离子的精确质量数、同位素分布和丰度等特征与数据库中的理论数据进行比对，筛查出可能存在的兽药残留。
S6.2 二级质谱解析
在安捷伦Mass Hunter Qualitative Analysis软件 Targeted MS/MS采集界面输入筛查出的兽药残留的母离子和保留时间，优化碰撞能量，得到丰富的二级离子和少量的母离子，通过分子结构解析软件Mass Hunter MSC进行结构分析，进一步确证化合物。
S6.3 标准物质确证
将1mg/L标准物质溶液注入液相色谱四级杆飞行时间质谱仪，采集一级质谱图，与样品进行比对，查看样品中的化合物与标准溶液中的化合物保留时间是否一致，准分子离子峰是否一致。进一步，以标准物质建立二级谱图，将样品中化合物的二级谱图与谱图库中标准物质的碎片离子谱图进行匹配，从而可以确定该物质。
S6.4 定量测定
取空白纯牛奶样品为基质，配置标准曲线，通过外标法，进行定量。
有益效果
本发明的技术方案具有如下优点：
本发明建立了QuEChERS EMR-Lipid技术结合LC-QTOF筛查牛奶中兽药残留的方法，样品经5%甲酸乙腈提取，QuEChERS EMR-Lipid技术净化，LC-QTOF筛查与确证。建立了134种药物的一级筛查谱库，对其中40中常用兽药进行了方法学验证，方法的灵敏度、准确性和重复性良好。对实际样品进行一级谱库扫描，对发现的兽药残留通过二级质谱解析进一步确证，最终采用标准物质进行验证。该法能发现日常检测难以发现的问题，满足评估和监管牛奶中的药物残留的要求。
1. 本发明采用QuEChERS EMR-Lipid技术净化，操作简单，节省时间，便于推广。
2. 只对其中40中常用兽药进行了方法学验证，无需购买齐备所有的标准品，节省成本。
3. 利用高分辨质谱，通过通过准分子离子的精确质量数、同位素分布和丰度等特征，在没有标准品的情况下，可以对未知化合物进行筛查，发现日常检测难以发现的问题。
4. 对发现的疑似化合物通过二级质谱解析和标准品确证，去除假阳性。
本方法快速、简便、灵敏，适用于牛奶中多兽药残留的快速定性确证。
附图说明
图1 方法建立流程图;
图2 样品筛查与确证流程图;
图3样品一级总离子流图;
图4 样品中阿奇霉素的提取离子色谱图及质谱图;
图5 样品中阿奇霉素的解析结果;
图6 样品中阿奇霉素二级谱图比对。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。
本方法共分为两大部分，一是方法建立，如图1所示包括，包括S1-S5.二是实际样品测定包括S6.具体过程是，先对样品进行全扫描，使用一级谱库检索，对检索出的化合物进行二级解析，并进一步通过标准品进行确证，然后进行定量，报出检测结果。
实施例：
1 实验部分
1.1 仪器及设备
Agilent 1290超高效液相色谱仪、G6530A Q-TOF四极杆飞行时间质谱仪，配有DualAgilent Jet Stream Electrospray Ionization(Dual AJS ESI)源(美国Agilent公司)；MultiReax漩涡振荡器(德国Heidolph公司)，3-30KS冷冻离心机（德国Sigma公司），Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)，XS205Du电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。
1.2 试剂、药品及材料
兽药标准品:纯度≥95%(Dr. Ehrenstorfer GmbH)；乙腈、甲醇均为色谱纯(德国默克公司)；除脂分散净化包（安捷伦Bond Elut dSPE Enhanced Matrix Removal (EMR) -Lipid，产品号：5982-1010）；除脂萃取盐包（Bond Elut EMR-Lipid Polish Pouch,anhydrous MgSO4 only，产品号：5982-0102）；陶瓷均质子（适合于50 mL离心管，安捷伦，产品号：5982-9313）。
1.3 样品前处理
精确称取牛奶样品5g（精确至0.01g）,于50mL具盖离心管中,加入10.0毫升5%甲酸乙腈提取液及两粒陶瓷均质子，涡旋（2000rpm）混匀5分钟，离心5min(4000rpm)。移取5.0毫升醋酸铵水溶液（5mM)到15毫升EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm）。移取5.0毫升离心后上层提取液到经过活化的EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm），离心5min(4000rpm)。将上层液完全倾倒入50.0mL离心管中，加入两粒陶瓷均质子及EMR polish粉包，快速剧烈振摇并涡旋2分钟（2000rpm）。离心5min(4000rpm)，移取上层乙腈液，待分析。
1.4 色谱条件
色谱仪:Agilent 1290 Infinity LC；色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100mm，1.8μm)；柱温:30℃；流速:0.4mL/min；进样体积:5μL；流动相:A:0.1%甲酸水，5mmol乙酸铵(ESI+)，B:甲醇。洗脱条件:0～1min，95%A，1～8min，95%～50%A，8～14min，50%～5%A，14～18min，5%～2%A，18～19.5min，2%～95%A，保持95%A 0.5min，等待下一次进样。
1.5 质谱条件
质谱仪:Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF；离子源:双喷射离子源Dual AJS ESI；雾化气:40psi；干燥气温度:325℃；干燥速率:7L/min；鞘气温度:350℃；鞘气流速:11L/min；毛细管电压:3500V；喷嘴电压:0V（ESI+）；碰撞解离电压:135V；扫描范围:100～1000m/z，二级质谱扫描范围和碰撞电压分别根据待测目标化合物设定；采集速率:一级1.5spectra/s，二级5spectra/s。
2 数据分析
2.1 数据分析软件
数据分析软件Mass Hunter Qualitative Analysis B06.0.633.0，分子结构解析软件Mass Hunter MSC B05.00，数据库建立通过Agilent Mass Hunter PCDL Manager(B.04.00)软件完成。
2.2一级筛查库建立
本发明根据农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》、国内外兽药使用和残留限量的相关标准。最终确定了134种常用药物进行筛查，分别为：乙酸丙嗪、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、阿苯达唑氨砜、四烯雌酮、金刚烷胺、羟氨苄青霉素、羟氨苄青霉噻唑酸、去羟基氨苄青霉噻唑酸、氨苄青霉素、氨苄青霉噻唑酸、去羟氨苄青霉噻唑酸、去甲雄三烯醇酮、阿托品、阿扎哌隆、阿奇霉素、坎苯达唑、咔唑心安、头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢洛宁、金霉素、氯丙嗪、西诺沙星、环丙沙星、克仑特罗、克仑塞罗、克仑潘特、克林霉素、邻氯青霉素、氯唑西林、邻氯青霉噻唑酸、去羟邻氯青霉噻唑酸、达氟沙星、地美环素、地塞米松、地西泮、双氯西林、二氟沙星、强力霉素、氟哌利多、红霉素、泛昔洛韦、非班太尔、芬苯哒唑、氟罗沙星、氟苯达唑氨基代谢产物、氟甲哇、氟轻松、依诺沙星、恩诺沙星、氟哌啶醇、异丙硝唑、交沙霉素、洛美沙星、马普特罗、马喷特罗、麻保沙星、甲苯哒唑、甲苯哒唑羟基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲硝唑、甲基强的松龙、萘夫西林、诺氟沙星、奥比沙星、奥芬达唑、奥苯达唑、氧氟沙星、苯唑西林、土霉素、喷布洛尔、苄青霉素、苄青霉噻唑酸、去羟苄青霉噻唑酸、奋乃静、培氟沙星、青霉素、毗呱酸、哌拉西林、泼尼松龙、孕酮、莱克多巴胺、班布特罗、倍氯米松、倍他米松、利巴韦林、罗红霉素、溴布特罗、沙拉沙星、司帕沙星、螺旋霉素、康力龙、苯甲酸磺胺、磺胺醋酸、磺胺喹恶琳、磺胺氯哒嗪、磺胺氯毗嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嗪、周效磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、左旋咪唑、特硝唑、睾酮、四环素、噻苯咪唑、5-羟基噻苯咪唑、泰妙菌素、替硝唑、群勃龙乙酸酯、甲氧苄啶、妥布特罗、泰乐菌素、甲苯噻嗪、赛拉嗪。建立了134种兽药一级质谱扫描筛查库，见表1。通过库检索，以目标化合物的一级质谱精确分子量、同位素丰度匹配、特征离子等信息进行定性分析。
表1 134种常用兽药信息表
中文名称 英文名称 分子式 精确质量数
乙酸丙嗪 Acepromazine C19H22N2OS 326.1453
阿苯达唑砜 Albendazole sulfone C12H15N3O4S 297.0783
阿苯达唑亚砜 Albendazole sulfoxide C12H15N3O3S 281.0834
阿苯达唑 Albendazole C12H15N3O2S 265.0885
阿苯达唑氨砜 Albendazole-2-aminosulfone C10H13N3O2S 239.0728
四烯雌酮 Altrenogest C21H26O2 310.1933
金刚烷胺 amantadine C10H17N 151.1361
羟氨苄青霉素 amoxicillin C16H19N3O5S 365.1045
羟氨苄青霉噻唑酸 amoxicilloic acid C16H21N3O6S 383.1151
去羟基氨苄青霉噻唑酸 amoxilloic acid C15H21N3O4S 339.1253
氨苄青霉素 ampicillin C16H19N3O4S 349.1096
氨苄青霉噻唑酸 ampicilloic acid C16H21N3O5S 367.1202
去羟氨苄青霉噻唑酸 ampilloic acid C15H21N3O3S 323.1304
去甲雄三烯醇酮 a-trenholone a C18H22O2 270.1620
阿托品 atropine C17H23NO3 289.1678
阿扎哌隆 azaperone C19H22FN3O 327.1747
阿奇霉素 Azithromycin C38H72N2O12 748.5085
坎苯达唑 Cambendazole C14H14N4O2S 302.0837
咔唑心安 Carazolol C18H22N2O2 298.1681
头孢氨苄 Cefalexin C16H17N3O4S 347.0940
头孢匹林 Cefapirin C17H17N3O6S2 423.0559
头孢唑啉 Cefazolin C14H14N8O4S3 454.0300
头孢匹罗 Cefpirome C22H22N6O5S2 514.1093
头孢喹肟 Cefquinome C23H24N6O5S2 528.1250
头孢洛宁 Cephalonium C20H18N4O5S2 458.0719
金霉素 Chlorotetracycline C22H23ClN2O8 478.1143
氯丙嗪 Chlorpromazine C17H19ClN2S 318.0957
西诺沙星 Cinoxacin C12H10N2O5 262.0590
环丙沙星 Ciprofloxacin C17H18FN3O3 331.1332
克仑特罗 Clenbuterol C12H18Cl2N2O 276.0796
克仑塞罗 Clencyclohexerol C14H20Cl2N2O2 318.0902
克仑潘特 Clenpenterol C13H20Cl2N2O 290.0953
克林霉素 Clindamycin C18H33ClN2O5S 424.1799
邻氯青霉素 cloxacillin C19H18Cl2N3NaO6S 509.0191
氯唑西林 cloxacillin C19H18ClN3O5S 435.0656
邻氯青霉噻唑酸 cloxacilloic acid C19H20ClN3O6S 453.0761
去羟邻氯青霉噻唑酸 cloxalloic acid C18H20ClN3O4S 409.0863
达氟沙星 Danofloxacin C19H20FN3O3 357.1489
地美环素 Demeclocycline C21H21ClN2O8 464.0986
地塞米松 Dexamethasone C22H29FO5 392.1999
地西泮 Diazepam C16H13ClN2O 284.0716
双氯西林 Dicloxacillin C19H17Cl2N3O5S 469.0266
二氟沙星 Ditloxacin C21H19F2N3O3 399.1394
强力霉素 Doxycycline C22H24N2O8 444.1533
氟哌利多 Droperidol C22H22FN3O2 379.1696
红霉素 Erythromycin C37H67NO13 733.4612
泛昔洛韦 Famciclovir C14H19N5O4 321.1437
非班太尔 Febantel C20H22N4O6S 446.1260
芬苯哒唑 Fenbendazole C15H13N3O2S 299.0728
氟罗沙星 Fleroxacin C17H18F3N3O3 369.1300
氟苯达唑氨基代谢产物 Flubendazole-amine C14H10FN3O 255.0808
氟甲哇 Flumequine C14H12FNO3 261.0801
氟轻松 Fluocinolone acetonide C24H30F2O6 452.2010
依诺沙星 Fnoxacm C15H17FN4O3 320.1285
恩诺沙星 Fnrotloxacin C19H22FN3O3 359.1645
氟哌啶醇 Haloperidol C21H23ClFNO2 375.1401
异丙硝唑 Ipronidazole C7H11N3O2 169.0851
交沙霉素 Josamycin C42H69NO15 827.4667
洛美沙星 Lomefloxacin C17H19F2N3O3 351.1394
马普特罗 Mabuterol C13H18ClF3N2O 310.1060
马喷特罗 Mapenterol C14H20ClF3N2O 324.1216
麻保沙星 Marbofloxacin C17H19FN4O4 362.1390
甲苯哒唑 Mebendazole C16H13N3O3 295.2927
甲苯哒唑羟基代谢产物 Mebendazole-5-droxy C16H15N3O3 297.3086
甲苯哒唑氨基代谢产物 Mebendazole-amine C14H11N3O 237.0902
甲地孕酮 Megestrol acetate C24H32O4 384.2301
美仑孕酮乙酸酯 Melengestrol acetate C25H32O4 396.2300
甲硝唑 Metlprednisolone C22H30O5 374.2093
甲基强的松龙 Metronidazole C6H9N3O3 171.0644
萘夫西林 NafcillinSodium C21H21N2O5S 413.1171
诺氟沙星 Nortloxacin C16H18FN3O3 319.1332
奥比沙星 Nrbitloxacin C19H20F3N3O3 395.1457
奥芬达唑 Nxfendazole C15H13N3O3S 315.0678
奥苯达唑 Nxibendazole C12H15N3O3S 281.0834
氧氟沙星 Otloxacin C18H20FN3O4 361.1438
苯唑西林 Oxacillin C19H18N3NaO5S 423.0865
土霉素 Oxytetracycline C22H24N2O9 460.1482
喷布洛尔 Penhutolol C18H29NO2 291.2198
苄青霉素 penicillin G C16H18N2O4S 334.0987
苄青霉噻唑酸 penicilloic acid G C16H20N2O5S 352.1093
去羟苄青霉噻唑酸 penilloic acid G C15H20N2O3S 308.1195
奋乃静 Perphenazine C21H26ClN3OS 403.1485
培氟沙星 Petloxacin C17H20FN3O3 333.1489
青霉素 Phenoxymethylpenicillin V C16H17KN2O5S 388.0495
毗呱酸 Pipemidic acid C14H17N5O3 303.1331
哌拉西林 Piperacillin C23H27N5O7S 517.1631
泼尼松龙 Prednisolone C21H28O5 360.1937
孕酮 Progesterone C21H30O2 314.2246
莱克多巴胺 Ractopamine C18H23NO3 301.1678
班布特罗 Rambuterol C18H29N3O5 367.2107
倍氯米松 Reclomethasone C28H37ClO7 520.2228
倍他米松 Retamethasone C22H29FO5 392.1999
利巴韦林 ribavirin C8H12N4O5 244.0808
罗红霉素 Roxithromycin C41H76N2O15 836.5246
溴布特罗 Rrombuterol C12H18Br2N2O 363.9786
沙拉沙星 Sarafloxacin C20H17F2N3O3 385.1238
司帕沙星 Sparfloxacin C19H22F2N4O8 472.1406
螺旋霉素 Spiramycin C43H74N2O14 842.5140
康力龙 stanozolol C21H32N2O 328.2515
苯甲酸磺胺 Sulfabenzamide C13H12N2O3S 276.0569
磺胺醋酸 Sulfacetamide C8H10N2O3S 214.0412
磺胺喹恶琳 Sulfachinoxaline C14H12N4O2S 300.0681
磺胺氯哒嗪 Sulfachloropyridazine C10H9ClN4O2S 284.0135
磺胺氯毗嗪 Sulfaclozine C10H9ClN4O2S 284.0135
磺胺嘧啶 Sulfadiazine C10H10N4O2S 250.0524
磺胺二甲氧嗪 Sulfadimethoxine C12H14N4O4S 310.0736
周效磺胺 Sulfadoxine C12H14N4O4S 310.0736
磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine C11H12N4O2S 264.0681
磺胺对甲氧嘧啶 Sulfameter C11H12N4O2S 264.0681
磺胺二甲嘧啶 Sulfamethazine C12H14N4O2S 278.0837
磺胺甲二唑 Sulfamethizole C9H10N4O2S2 270.0245
磺胺甲恶唑 Sulfamethoxazole C10H11N3O3S 253.0521
磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyridazine C11H12N4O3S 280.0630
磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine C11H12N4O3S 280.0630
磺胺苯吡唑 Sulfaphenazole C15H14N4O2S 314.0837
磺胺吡啶 Sulfapyridine C11H11N3O2S 249.0572
柳氮磺胺吡啶 Sulfasalazine C18H14N4O5S 398.0685
磺胺噻唑 Sulfathiazole C9H9N3O2S2 255.0136
磺胺二甲异嘧啶 Sultisomidin C12H14N4O2S 278.0837
磺胺二甲异唑 Sultisoxazole C11H13N3O3S 267.0678
左旋咪唑 levamisole C11H12N2S 204.0721
特硝唑 Ternidazole C7H11N3O3 185.0800
睾酮 Testosterone C19H28O2 288.2089
四环素 Tetracycline C22H24N2O8 444.1533
噻苯咪唑 Thiabendazole C10H7N3S 201.0361
5-羟基噻苯咪唑 Thiabendazole-5-hydroxy C10H7N3OS 217.0310
泰妙菌素 Tiamulin C28H47NO4S 493.3226
替硝唑 Tinidazole C8H13N3O4S 247.0627
群勃龙乙酸酯 Trenbolone acetate C20H24O3 312.1725
甲氧苄啶 Trimethoprim C14H18N4O3 290.1379
妥布特罗 Tulohuterol C12H18ClNO 227.1077
泰乐菌素 Tylosin C46H77NO17 915.5192
甲苯噻嗪 Xvlazine C12H16N2S 220.1034
赛拉嗪 Xylazine C12H16N2S 220.1034
2.2 二级谱库建立
将实验室已有的标准品配制成1mg/L的混合标准溶液，进行一级采集，通过一级数据库进行检索，确定母离子和保留时间，重复测定，在Targeted MS/MS采集界面输入兽药的母离子，保留时间，优化碰撞能量，得到母离子不消失，子离子丰富的二级谱图，再将其导入PCDL软件中，建立二级离子碎片特征谱图谱库。
3 结果与分析
3.1 流动相的选择
多兽药残留的筛查，需要一个相对平缓的液相洗脱梯度，使所需要检测的各种兽药在色谱柱中有所保留并与基质极性化合物分开，减小基质对分析物以及各分析物之间的干扰。本发明采用起始为95%水相，在18min内缓慢变化到2%水相的大梯度的洗脱方式，尽可能使各种目标兽药分析物具有较好的分离度。本发明比较了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）-乙腈和0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）-甲醇４种流动相体系对分离效果的影响。经过实验，最终确定了0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）-甲醇作为流动相，添加5mmol/L乙酸铵可以有效抑制兽药在离子源中生成[M+Na］+峰，显著增强［M＋H］+信号，从而提高了检测的灵敏度和稳定性，也有利于使用MSC软件进行结构解析。一级总离子流图见图3。
3.2净化条件的优化
通常QuEChERS方法，采用纯乙腈作为提取液，本发明对比了5%甲酸乙腈和纯乙腈提取效果。结果表明5%甲酸乙腈提取液的提取效果较好，回收率较高。同时，对EMR粉末的活化条件也进行了优化，分别考察了5mM醋酸铵水溶液、水、5%甲酸、5%醋酸等四种活化溶液的效果，结果表明，5mM醋酸铵水溶液回收率较高。
3.3 方法学确证
取空白纯牛奶样品，选取40种不同性质兽药进行方法学验证，按1.3节样品预处理方法进行处理净化，测定目标分析物相应强度。以分子离子峰面积Y对含量X(μg/L)作标准曲线。用基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，直到获得每种兽药的信噪比等于10(S/N=10)的浓度，确定其为该化合物的定量限(LOQ)。在20、40和80μg/kg 3个添加水平下，在空白基质中添加40种常见兽药，进行筛查确证，每个浓度水平取6份样品进行试验，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。经验证，各兽药相关系数大于0.99，LOQ为2.5～10μg/kg;回收率为66%～124%，RSD为1.02%～19.7%。详见表2.结果表明，本发明建立的方法灵敏度、准确性和重复性良好，能够满足牛奶中兽药残留的日常筛查与检测。
表2 40种兽药的线性范围、相关系数、加标回收率、RSD和定量限
3.4 实际样品测定
通过本发明建立的QuEChERS EMR-Lipid技术结合LC-QTOF筛查牛奶中兽药残留的方法，对45批次牛奶进行了筛查与确证。
3.4.1 一级谱库检索
按1.3节样品预处理方法进行处理净化，上机测定目标分析物。利用建立的一级谱库，进行133种兽药残留的筛查，发现有一批样品种含有阿奇霉素（Azithromycin，CAS：83905-01-5，分子式：C38H72N2O12），其理论精确准分子离子质量数为749.5158（[C38H72N2O12]+H）+，实际检测值为749.5152，分子量相差6mDA，偏差0.8ppm，同时还有发现具有明显的（[C38H72N2O12]+NH4）+和（[C38H72N2O12]+Na）+峰，综合检索得分99.03。提取离子色谱图及质谱图见图4。
3.4.2 二级质谱确证
在Targeted MS/MS采集界面输入阿奇霉素的母离子和保留时间，优化碰撞能量，得到丰富的二级离子，通过MSC解析软件进行结构分析，通过解析可以进一步确定其为阿奇霉素，解析结果见图5。
3.4.3 以标准物质确证
将1mg/L标准物质阿奇霉素溶液注入液相色谱四级杆飞行时间质谱仪，采集一级质谱图，与样品进行比对，从比对情况看，样品中的阿奇霉素与标准溶液中的阿奇霉素保留时间一致，准分子离子峰一致。进一步，以阿奇霉素标准物质建立二级谱图，将样品的二级谱图与谱图库中碎片离子谱图进行匹配，见图6。从而可以确定该物质就是阿奇霉素。
使用基质标准曲线，外标法定量，测得其含量为12.7μg/kg。
4 结论
本发明利用QuEChERS EMR-Lipid技术提取、净化，结合LC-QTOF高分辨的液相色谱-质谱技术，建立了牛奶中兽药的残留的快速筛查与确证方法。本方法快速、简便、灵敏，适用于牛奶中多兽药残留的快速定性确证。

Claims (1)

1.一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1 一级筛查库建立
根据农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》、国内外兽药使用和残留限量的相关标准，确定了134种常用药物进行筛查，分别为：乙酸丙嗪、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、阿苯达唑氨砜、四烯雌酮、金刚烷胺、羟氨苄青霉素、羟氨苄青霉噻唑酸、去羟基氨苄青霉噻唑酸、氨苄青霉素、氨苄青霉噻唑酸、去羟氨苄青霉噻唑酸、去甲雄三烯醇酮、阿托品、阿扎哌隆、阿奇霉素、坎苯达唑、咔唑心安、头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢洛宁、金霉素、氯丙嗪、西诺沙星、环丙沙星、克仑特罗、克仑塞罗、克仑潘特、克林霉素、邻氯青霉素、氯唑西林、邻氯青霉噻唑酸、去羟邻氯青霉噻唑酸、达氟沙星、地美环素、地塞米松、地西泮、双氯西林、二氟沙星、强力霉素、氟哌利多、红霉素、泛昔洛韦、非班太尔、芬苯哒唑、氟罗沙星、氟苯达唑氨基代谢产物、氟甲哇、氟轻松、依诺沙星、恩诺沙星、氟哌啶醇、异丙硝唑、交沙霉素、洛美沙星、马普特罗、马喷特罗、麻保沙星、甲苯哒唑、甲苯哒唑羟基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲硝唑、甲基强的松龙、萘夫西林、诺氟沙星、奥比沙星、奥芬达唑、奥苯达唑、氧氟沙星、苯唑西林、土霉素、喷布洛尔、苄青霉素、苄青霉噻唑酸、去羟苄青霉噻唑酸、奋乃静、培氟沙星、青霉素、毗呱酸、哌拉西林、泼尼松龙、孕酮、莱克多巴胺、班布特罗、倍氯米松、倍他米松、利巴韦林、罗红霉素、溴布特罗、沙拉沙星、司帕沙星、螺旋霉素、康力龙、苯甲酸磺胺、磺胺醋酸、磺胺喹恶琳、磺胺氯哒嗪、磺胺氯毗嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嗪、周效磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、左旋咪唑、特硝唑、睾酮、四环素、噻苯咪唑、5-羟基噻苯咪唑、泰妙菌素、替硝唑、群勃龙乙酸酯、甲氧苄啶、妥布特罗、泰乐菌素、甲苯噻嗪、赛拉嗪；
S2 样品前处理
精确称取牛奶样品5g（精确至0.01g）,于50mL具盖离心管中,加入10.0毫升5%甲酸乙腈提取液及两粒陶瓷均质子，涡旋（2000rpm）混匀5分钟，离心5min(4000rpm)，移取5.0毫升醋酸铵水溶液（5mM)到15毫升EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm），移取5.0毫升离心后上层提取液到经过活化的EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm），离心5min(4000rpm)，将上层液完全倾倒入50.0mL离心管中，加入两粒陶瓷均质子及EMR polish粉包，快速剧烈振摇并涡旋2分钟（2000rpm），离心5min(4000rpm)，移取上层乙腈液，待分析；
S3色谱分离
色谱仪:Agilent 1290 Infinity LC；色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100mm，1.8μm)；柱温:30℃；流速:0.4mL/min；进样体积:5μL；流动相:A:0.1%甲酸水，5mmol乙酸铵(ESI+)，B:甲醇，洗脱条件:0～1min，95%A，1～8min，95%～50%A，8～14min，50%～5%A，14～18min，5%～2%A，18～19.5min，2%～95%A，保持95%A 0.5min，等待下一次进样；
S4 质谱检测
质谱仪:Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF；离子源:双喷射离子源Dual AJS ESI；雾化气:40psi；干燥气温度:325℃；干燥速率:7L/min；鞘气温度:350℃；鞘气流速:11L/min；毛细管电压:3500V；喷嘴电压:0V（ESI+）；碰撞解离电压:135V；扫描范围:100～1000m/z，二级质谱扫描范围和碰撞电压分别根据待测目标化合物设定；采集速率:一级1.5spectra/s，二级5spectra/s；
S5方法学确证
取空白纯牛奶样品，选取40种不同性质兽药进行方法学验证，按步骤S2所述的样品预处理方法进行处理净化，按步骤S3、S4所述的测定目标分析物相应强度，以分子离子峰面积Y对含量X(μg/L)作标准曲线，用基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，直到获得每种兽药的信噪比等于10(S/N=10)的浓度，确定其为该化合物的定量限(LOQ)，在20、40和80μg/kg 3个添加水平下，在空白基质中添加40种常见兽药，进行筛查确证，每个浓度水平取6份样品进行试验，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)；
S6样品测定
S6.1 一级谱库扫描
按步骤S2-S4所述的上机测定目标分析物，利用建立的一级谱库，进行134种兽药残留的筛查，对样品中的化合物通过准分子离子的精确质量数、同位素分布和丰度等特征与数据库中的理论数据进行比对，筛查出可能存在的兽药残留；
S6.2 二级质谱解析
在安捷伦Mass Hunter Qualitative Analysis软件 Targeted MS/MS采集界面输入筛查出的兽药残留的母离子和保留时间，优化碰撞能量，得到丰富的二级离子和少量的母离子，通过分子结构解析软件Mass Hunter MSC进行结构分析，进一步确证化合物；
S6.3 标准物质确证
将1mg/L标准物质溶液注入液相色谱四级杆飞行时间质谱仪，采集一级质谱图，与样品进行比对，查看样品中的化合物与标准溶液中的化合物保留时间是否一致，准分子离子峰是否一致，进一步，以标准物质建立二级谱图，将样品中化合物的二级谱图与谱图库中标准物质的碎片离子谱图进行匹配，从而可以确定该物质；
S6.4 定量测定
取空白纯牛奶样品为基质，配置标准曲线，通过外标法，进行定量。
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