CN112684041A

CN112684041A - 一种检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法

Info

Publication number: CN112684041A
Application number: CN202011478561.4A
Authority: CN
Inventors: 高素兰
Original assignee: Shandong Continental Testing Co ltd
Current assignee: Shandong Continental Testing Co ltd
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明提供一种检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法。本发明将待测样品进行前处理后进行HPLC‑MS/MS检测；目标化合物经酸化乙腈提取、QuEChERS技术净化及复溶后直接上机测定，前处理操作简单。优化后的方法基质效应低，简化了实验步骤。本发明方法简便、灵敏适用于牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的测定，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱串联质谱法检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法。

背景技术

己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)是一种人工合成的雌酚类激素，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用。在养殖产业中，己烯雌酚曾一度作为促生长剂加入饲料中，刺激奶牛正常的生成代谢，增加奶牛体内氯停留，提高奶牛体内氨基酸合成蛋白质的速度，最终达到提高牛奶产率的目的。研究表明，残留于动物源性食品中的己烯雌酚通过食物链进入人体后，属于环境内分泌干扰物,它对垂体促性腺激素的分泌有抑制作用，破坏人体内正常激素平衡。其副作用可以破坏集体遗传物质，导致基因突变，引发机体肿瘤，且在体内滞留时间长、稳定性强、难降解。欧盟已禁止使用，美国和加拿大则限量使用。中华人民共和国农业农村部公告第250号也将其列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》。

现有的牛奶和奶粉中己烯雌酚的仪器分析检测方法有液相色谱法和液相色谱串联质谱法，液相色谱法无法准确定性，检测灵敏度低，而液相色谱串联质谱法通常前处理过程相对繁琐，耗时较长以GB/T 22992-2008《牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法》为例，前处理过程需氢氧化钠调节pH后，经阴离子固相萃取柱净化，耗时较长，耗材成本较高。因此，开发一个快速高效的检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法对于保障人民的食品安全有十分重要的意义。

发明内容

为解决现有技术中缺陷，本发明提供一种基于高效液相色谱串联质谱法检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法。该方法灵敏度高，稳定性高，操作简单，效率高，并且检出限更低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于高效液相色谱串联质谱法检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)配制标准品溶液：首先制备标准储备液，称取适量的己烯雌酚标准品，用甲醇配制成浓度为10μg/L的标准储备液，于-18℃冰箱中保存；然后将标准储备液用甲醇配制成浓度为1000μg/mL的混合标准工作液，于4℃冰箱中保存，再将标准中间液用甲醇配制成浓度为10μg/mL的混合标准工作液，于4℃冰箱中保存；

制作标准曲线时将标准工作液用空白基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的工作曲线，现用现配。

(2)醋酸乙腈溶液：吸取10ml的醋酸用乙腈定容到1000ml的容量瓶中配制成浓度为1％的醋酸乙腈溶液。

(3)10％甲醇水(含0.1％的甲酸)溶液：10ml甲醇加水定容到100ml，加入100μl甲酸，配制成10％甲醇水含0.1％的甲酸溶液。

(4)待测样品前处理：

A.提取：称取牛奶或奶粉2g(精确至0.01g)试样于50mL离心管中，回收中另加入100ng/mL己烯雌酚标准溶液10μL，1％醋酸乙腈溶液15mL(含油脂较多的样品加10mL正己烷)。涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min，在转速为4000r/min的离心机中离心5min；

B.净化：将上清液(加正己烷的样品需将正己烷除去)全部转移到准备好的净化管(10g马弗炉烘过的无水硫酸钠、0.5gC₁₈、0.2g PSA)中，涡旋混匀5min，转速为4000r/min离心机中离心5min。吸取7.5mL上清液于10mL离心管中，于40℃水浴中氮气吹干。

C.复溶：向吹干的离心管中加入0.5mL定溶液(10％甲醇水含0.1％的甲酸)，超声30S，涡旋混匀5min，过0.22um滤膜，待上机测试。

空白基质溶液除不加标准溶液，其余操作按照A.B.C进行。

(5)将前处理好的样液用液相色谱-串联质谱仪定量分析，对待测样品进行定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中己烯雌酚残留的含量，具体如下：

A、将步骤(1)配制的不同浓度的己烯雌酚标准工作曲线，用液相色谱-串联质谱仪分析检测，进样体积为5.0μL，获得标准品溶液的总离子流图、定量离子色谱图和定性离子对色谱图；

B、取5.0μL待测样品溶液进样，用液相色谱-串联质谱仪分析检测，得到待测样品溶液的总离子流图、定量离子对色谱图和定性离子对色谱图；

C、以己烯雌酚的定量离子峰面积和浓度分别为横纵坐标，得到己烯雌酚标准工作曲线；

D、根据待测样品溶液中己烯雌酚残留的定量离子峰面积，结合标准曲线，计算得到待测样液中己烯雌酚的浓度C，并按以下公式计算得到牛奶和奶粉中己烯雌酚的含量X，含量计算公式为：

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

其中X是待测样品中奶粉和牛奶己烯雌酚的含量，单位为μg/kg；C是待测样品中己烯雌酚残留的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品最终定容体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g；f是稀释倍数。

其中液相色谱-串联质谱仪的色谱条件为：

液相色谱条件

a)色谱柱:Rapid ResolutionHD 3.0X100mm 1.8-Micron

b)流动相及梯度：乙腈+0.1％甲酸5mM乙酸铵水溶液

c)结束时间：5min

d)流速：0.4mL/min

e)柱温：30℃

f)进样量：5μL

质谱条件见表2，表3

表2安捷伦6460QQQ

表3监测离子对及其相应的碰撞能量

本发明的有益效果为：

(1)整个检测样品前处理过程简单、快速，同现有方法相比，大大提高了检测效率。

(2)提取环节选择酸化乙腈，有效提高被提取物己烯雌酚的提取效率，提高了方法回收率。

(3)净化过程更加简便，用QuECHERS技术取代现有的固相萃取柱净化过程，既节省了操作时间，同时也节约了试验成本。

(4)适用于复杂基质样本牛奶和奶粉的检测，目前QuECHERS技术多用于蔬菜、水果、土壤等成分较简单的基质，对于奶粉等高蛋白等成分复杂的样品应用较少，本发明通过优化选择无水硫酸钠、C₁₈、PSA三种物质作为净化填料，并对净化填料比例进行优化(无水硫酸钠：C₁₈：PSA质量比为10g：0.5g：0.2g)，高纯度、高可控比表面积保证了稳定萃取效率，与传统检测方法相比，操作简便、重现性好，回收率高。

(5)本发明的方法能够准确测定牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量，检出限为0.5μg/kg,灵敏度更高。

附图说明

图1是样液中己烯雌酚标准品总离子流图；

图2是标准溶液中己烯雌酚标准品总离子流图；

图3是检出限浓度添加回收样液中己烯雌酚的信噪比谱图；

图4是己烯雌酚的标准曲线；

图5是样液中己烯雌酚的定量定性离子对色谱图；

图6是标准溶液中己烯雌酚的定量定性离子对色谱图；

具体实施方式

下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

一、所选试剂

1.己烯雌酚标准品

2.冰醋酸

3.乙腈

4.正己烷

5.无水硫酸钠

6.甲醇

7.甲酸

8.C₁₈：50um

9.PSA：40-60um

二、所使用的仪器

1、离心管，2、氮吹仪：N-EVA p112；3、离心机:SIGMA 3K15，4、瓶口分液器(10～50mL)，5、移液枪，6、涡旋振荡器；德国Heidolph MULTI REAX，7、液相色谱/串联质谱仪(配备电喷雾离子源)：安捷伦1290-6460QQQ，8、十万分之一天平：METTER TOLEDO XS205，9、万分之一天平：METTER TOLEDO ME204E

三、试验

(1)配制标准品溶液：首先制备标准储备液，称取适量的己烯雌酚标准品，用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃冰箱中保存；将标准储备液用甲醇配制成浓度为10μg/mL的标准中间液，于4℃冰箱中保存；将标准中间液用甲醇配制成浓度为1.0μg/mL和0.1μg/mL的标准工作液，于4℃冰箱中保存；

根据实验需要，吸取标准工作溶液，用空白样品基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的标准品工作曲线，现用现配；

(3)10％甲醇水(含0.1％的甲酸)溶液：10ml甲醇加水定容到100ml，加入100μl甲酸，配制成10％甲醇水含0.1％的甲酸溶液；

(4)待测样品前处理：

B.净化：将上清液(加正己烷的样品需将正己烷除去)全部转移到准备好的净化管(10g马弗炉烘过的无水硫酸钠、0.5gC₁₈、0.2gPSA)中，涡旋混匀5min，转速为4000r/min离心机中离心5min。吸取7.5mL上清液于10mL离心管中，于40℃水浴中氮气吹干。

空白基质溶液除不加标准溶液，其余操作按照A.B.C进行。

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

其中，液相色谱-质谱联用仪的质谱条件为：

离子化模式：电喷雾电离负离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷射电压：2000V；Delta EM：200V；雾化器压力：40psi；干燥气流量：10L/min；干燥气温度：345℃。

四、过程优化及分析

本发明过程对提取溶剂、净化填料的选择配比分别进行了优化测试，根据所测回收率情况，最终选择提取溶剂为：1％醋酸乙腈，填料及配比为：无水硫酸钠+C₁₈+PSA＝10g+0.5g+0.2g。

具体比对结果见表4～表7。

(1)提取溶剂选择优化

选择常规方法所用乙腈、以及不同浓度梯度的酸化乙腈对阳性样品进行提取，测定回收率情况，由表4可见：1％醋酸乙腈提取效果更好。

表4提取溶剂比例优化结果

提取溶剂	回收率/％
		乙腈	93.42
1％醋酸乙腈	97.51
		5％醋酸乙腈	90.76
10％醋酸乙腈	88.91

(2)净化填料选择优化

目前QuEChERS技术常用净化填料有：无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠、C18、PSA、石墨化炭黑、氧化铝等。结合待测基质牛奶和奶粉成分组成，选择无水硫酸钠去除水分，PSA(N-丙基乙二胺)去除脂肪酸，有机酸，和一些极性色素及糖。C18官能团对非极性的组分有吸附作用，可以去除油脂类物质。对于所选填料配比进行优化，测定回收率，统计如下，最终选择回收效果最好的配比：水硫酸钠+C₁₈+PSA＝10g+0.5g+0.2g作为最终方案。

表5净化填料无水硫酸钠用量优化表

无水硫酸钠	C<sub>18</sub>	PSA	回收率/％
				5g	0.5g	0.2g	90.15
10g	0.5g	0.2g	94.92
				15g	0.5g	0.2g	94.53
20g	0.5g	0.2g	93.21

表6净化填料C₁₈用量优化表

无水硫酸钠	C<sub>18</sub>	PSA	回收率/％
				10g	0.2g	0.2g	92.12
10g	0.5g	0.2g	95.24
				10g	1.0g	0.2g	94.82
10g	2.0g	0.2g	94.54

表7净化填料PSA用量优化表

无水硫酸钠	C18	PSA	回收率/％
				10g	0.5g	0.1g	89.46
10g	0.5g	0.2g	95.85
				10g	0.5g	0.5g	94.54
10g	0.5g	1.0g	94.35

五、检测结果及分析

(1)检出限

选择检出限水平(0.5μg/kg)进行添加回收测试，得出其的信噪比S/N为1555.1，见图3，计算得出信噪比等于10时，对应浓度为即方法定量限可低至0.004μg/kg。

(2)标准曲线的线性

用空白基质配制浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL做标准工作曲线，按照上述检测方法上机测定。

从图4得出己烯雌酚标准曲线线性相关系数大于0.99，满足要求。

(3)回收率与准确性

选择检出限、两倍方法检出限和十倍方法检出限进行三水平添加，重复测定次数为6，也就是本发明分别以0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg进行加标测定，回收率结果见下表。

表8三水平六平行测定结果

从表中可以看出，三个不同水平添加回收试验回收率均在90％以上，回收率满足要求，同一水平，进行6次平行测定，计算相对标准偏差，均小于10％，方法重复性满足要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

制作标准曲线时将标准工作液用空白基质溶液配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的标准品溶液备用；

(2)待测样品前处理：

A.提取：称取牛奶或奶粉2.00g试样于50mL离心管中，回收中另加入100ng/mL己烯雌酚标准溶液10μL，1％醋酸乙腈溶液15mL；涡旋混匀5min，超声提取15min，再涡旋混匀5min，在转速为4000r/min的离心机中离心5min；

B.净化：将上清液全部转移到准备好的净化管中，所述净化管中包括10g马弗炉烘过的无水硫酸钠、0.5g C₁₈、0.2g PSA，涡旋混匀5min，转速为4000r/min离心机中离心5min，吸取7.5mL上清液于10mL离心管中，于40℃水浴中氮气吹干；

C.复溶：向吹干的离心管中加入0.5mL含0.1％甲酸的10％甲醇水，超声30S，涡旋混匀5min，过0.22um有机相滤膜，待上机测试。

(3)将前处理好的样液用液相色谱-串联质谱仪定量分析，对待测样品进行定性和定量检测，得到牛奶和奶粉中己烯雌酚残留的含量。

2.根据权利要求1所述的检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于，步骤(3)具体如下：

X＝C*V*1000*f/(m*1000)

其中X是待测样品中奶粉和牛奶己烯雌酚的含量，单位为μg/kg；C是待测样液中己烯雌酚残留的浓度，单位为ng/mL；V是待测样品最终定容体积，单位为mL；m是待测样品质量，单位为g；f是稀释倍数。

3.根据权利要求1所述的检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于其中液相色谱-串联质谱仪的色谱条件为：

a)色谱柱:Rapid Resolution HD 3.0X100mm 1.8-Micron

b)流动相及梯度：乙腈+0.1％甲酸5mM乙酸铵水溶液

c)结束时间：5min

d)流速：0.4mL/min

e)柱温：30℃

f)进样量：5μL。

4.根据权利要求3所述的检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于，所述乙腈和乙酸铵溶液的体积比为(20～90)：(10～80)。

5.根据权利要求3所述的检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体情况见下表：

表1 流动相梯度洗脱

6.根据权利要求3所述的检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪检测时的质谱条件为：

离子化模式：电喷雾电离负离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷射电压：4000V；Delta EM：200V；雾化器压力：40psi；干燥气流量：7L/min；干燥气温度：325℃。

7.根据权利要求1所述的检测牛奶和奶粉中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于，在步骤(2)的提取过程中，对于含油脂较多的样品，除了添加1％醋酸乙腈溶液15mL外，还需要加入10mL正己烷。