CN117147715A - 一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生产技术领域，公开了一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法，包括以下步骤：1)鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的乙腈提取；2)无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分；3)使用液相色谱串联质谱联用仪检测；4)结果分析。本发明方法用乙腈提取鸡蛋中聚醚类抗生素残留，用无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分；用液相色谱串联质谱联用仪对鸡蛋中聚醚类抗生素残留量进行的定性和定量分析，建立更简便、快速、高效检测鸡蛋中聚醚类抗生素药物残留的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于农业生产技术领域，尤其是一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法和应用。
背景技术
鸡蛋是人民群众喜爱的大众营养消费食品。聚醚类抗生素是目前使用最广泛的鸡用抗球虫药，在国内普遍用于治疗鸡球虫病。历史上鸡球虫病曾对集约化养禽业构成极大威胁。有关研究表明，1株球虫与抗球虫药接触几十代后即能产生稳定的抗药性。目前，养禽生产中使用抗球虫药有加大剂量的倾向。大部分聚醚类抗生素在毒理学上属高毒或剧毒物质，具有较强的细胞毒性，安全范围小。莫能菌素和盐霉素均属于聚醚类离子载体型抗生素。不合理用药可使动物产生急性中毒，并会导致所产蛋中相当水平的药物残留，因此消费者可能因一次摄入相当或更高剂量的药物残留，而对身体造成危害。
食品中聚醚类抗生素残留的测定一般使用液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、分光光度法、微生物检测法及免疫学方法。薄海波等用乙腈提取牛奶和奶粉样品中莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素、沙拉洛菌素、尼日利亚菌素马杜霉素铵等6种聚醚类抗生素，提取液通过HLB固相萃取柱净化，UPLC分离，以电喷雾MRM进行质谱分离。曹亚青等用液相色谱-质谱联用技术TurboFIow在线净化的方法有效的分离出了莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素，现有技术的前处理方法多采用固相萃取柱净化，另外，大部分使用无水硫酸钠吸收样品中的水分、0.5％甲酸水作为流动相、TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中的聚醚类抗生素。其中莫能菌素的样品平均加标回收率为83.17％，盐霉素的样品平均为80.6％，甲基盐霉素的样品平均加标回收率为81.5％，该实验的标准偏差在1.5％-8.1％之间，提取时间在17min左右，加标回收率一般，灵敏度和精密度不够高，存在操作繁琐和时间长等问题。因此，亟需一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法和应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法，包括以下步骤：
1)鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的乙腈提取
称取样品，精确至0.05g，于50mL的离心管中，加入乙腈迅速摇匀，2500r/min涡旋10min，提取上清液；再加入乙腈进行第二次提取，涡旋离心条件均与前面的参数相同；合并提取液，摇匀，得到样品提取液；
其中，样品：第一次乙腈：第二次乙腈的比例g：mL：mL为5：15：10；
2)无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分
加入无水碳酸钠吸收步骤1)得到的样品提取液中的水分，2500r/min涡旋5min，涡旋完成后高速离心；移取上清液，不加热氮吹，等样品提取液无流动时，用甲醇水溶液定容，过滤至进样小瓶中，制得样品溶液，低温避光保存备用；
其中，所述无水碳酸钠与样品的质量比为1：1，无水碳酸钠：用甲醇水溶液定容后体积的比例g：mL为5：4；
3)使用液相色谱串联质谱联用仪检测
a)标准工作溶液的制备：分别准确称取莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉标准品，用甲醇定容，配制成10μg/mL的标准溶液，再用甲醇稀释成100ng/mL的标准工作溶液；
b)基质标准工作曲线：鸡蛋空白样品按上述步骤1)和步骤2)的前处理方式提取和净化后的空白基质液，与步骤a)制备的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的标准工作溶液配制成浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、6ng/mL混合基质标准工作溶液；
c)将步骤b)制备的系列浓度的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的基质标准工作溶液和步骤2)制备的待检测莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素含量的样品溶液注入液相色谱仪，经串联质谱仪检测后得到鸡蛋样品中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的含量；
4)结果分析
定性和定量：以化合物的准分子离子峰的精确质量数为定性离子和定量离子；以标准工作液的浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行外标法定量；用样品溶液出现的色谱峰保留时间和定性离子进行定性。
进一步地，所述液相色谱的条件：ACQOITYC18色谱柱；流速：0.300mL/min；进样量：5μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水；流动相洗脱梯度：
其中，％A示流动相A体积分数，％B示流动相B体积分数。
进一步地，所述质谱条件：液相色谱/三重四级杆串联质谱联用仪；MassLynx4.1SN950系统软件；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：0.8kV；离子源温度：500℃；MRM分析质谱参数：
。
进一步地，所述三类聚醚类抗生素的检出限规定为1μg/kg，所述方法的加标回收率在83.2％到98.0％之间，标准偏差在1.16％到7.50％之间。
进一步地，所述步骤2)中甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为8：2。
进一步地，所述步骤2)中高速离心的条件为：在高速冷冻离心机上，4℃情况下10000r/min离心5min。
进一步地，所述步骤2)中过滤为采用0.22μm有机滤膜。
进一步地，采用多管涡旋混合仪进行涡旋。
如上所述的方法在测定聚醚类抗生素残留量方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、针对现有技术对鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的测定方法太复杂、工作量大、时间长的问题，本发明方法用乙腈提取鸡蛋中聚醚类抗生素残留，用无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分；用液相色谱串联质谱联用仪对鸡蛋中聚醚类抗生素残留量进行的定性和定量分析，建立更简便、快速、高效检测鸡蛋中聚醚类抗生素药物残留的检测方法。同时，本发明方法采用的试剂较少，大大节约了检测成本；样品前处理方法简单，不需要固相萃取净化，极大地节约了前处理时间。
2、本发明方法中三类聚醚类抗生素的检出限规定为1μg/kg，本发明的加标回收率在83.2％到98.0％之间，标准偏差在1.16％到7.50％之间，不仅使实验加标回收率得到提高，实验的灵敏度和精密度更高，而且还做到节约资源，爱护环境的实验室的安全实验原则。另外，本实验在检测时所用时间不到5min，大大节省了在样品检测分析时所花费的时间；减少了机器的磨损，使得检测仪器的使用寿命更长，节约在研究时不必要的经费开支，满足了国内外对该类物质的检测要求；并且该分析结果稳定、可靠，符合残留检测要求，可以满足对鸡蛋中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素3种聚醚类抗生素同时测定的要求。
3、本发明采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，建立更简便、快速、高效检测鸡蛋中聚醚类抗生素药物残留的检测方法，优化物质提取条件及色谱条件，在保证检测鸡蛋中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素等三类聚醚类抗生素结果准确性的同时，还可以使工作量和试剂耗用量大大减少，更能节约研究经费。
4、本发明方法采用乙腈两次提取，无水碳酸钠吸收样品中的水分，UPLC快速分离，串联质谱检测，成功建立鸡蛋中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素等3种聚醚类抗生素的快速检测方法。该方法简单快速、不需要衍生、不需要固相萃取净化、具有良好的回收率和重现性。实行此方法极大地节约了前处理时间，并且自动化程度高，可以进行大批量样品处理，保证了该方法在检测时的准确性及稳定性。
附图说明
图1为本发明中聚醚类抗生素溶液(6.0ppb)的质量色谱图；
图2为本发明中聚醚类抗生素溶液(6.0ppb)的子离子扫描质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法，包括以下步骤：
1)鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的乙腈提取
称取样品，精确至0.05g，于50mL的离心管中，加入乙腈迅速摇匀，2500r/min涡旋10min，提取上清液；再加入乙腈进行第二次提取，涡旋离心条件均与前面的参数相同；合并提取液，摇匀，得到样品提取液；
其中，样品：第一次乙腈：第二次乙腈的比例g：mL：mL为5:15:10；
2)无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分
加入无水碳酸钠吸收步骤1)得到的样品提取液中的水分，2500r/min涡旋5min，涡旋完成后高速离心；移取上清液，不加热氮吹，等样品提取液无流动时，用甲醇水溶液定容，过滤至进样小瓶中，制得样品溶液，低温避光保存备用；
其中，所述无水碳酸钠与样品的质量比为1：1，无水碳酸钠：用甲醇水溶液定容后体积的比例g：mL为5：4；
3)使用液相色谱串联质谱联用仪检测
a)标准工作溶液的制备：分别准确称取莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉标准品，用甲醇定容，配制成10μg/mL的标准溶液，再用甲醇稀释成100ng/mL的标准工作溶液；
b)基质标准工作曲线：鸡蛋空白样品按上述步骤1)和步骤2)的前处理方式提取和净化后的空白基质液，与步骤a)制备的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的标准工作溶液配制成浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、6ng/mL混合基质标准工作溶液；
c)将步骤b)制备的系列浓度的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的基质标准工作溶液和步骤2)制备的待检测莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素含量的样品溶液注入液相色谱仪，经串联质谱仪检测后得到鸡蛋样品中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的含量；
4)结果分析
定性和定量：以化合物的准分子离子峰的精确质量数为定性离子和定量离子；以标准工作液的浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行外标法定量；用样品溶液出现的色谱峰保留时间和定性离子进行定性。
较优地，所述液相色谱的条件：ACQOITYC18色谱柱；流速：0.300mL/min；进样量：5μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水；流动相洗脱梯度：
其中，％A示流动相A体积分数，％B示流动相B体积分数。
较优地，所述质谱条件：液相色谱/三重四级杆串联质谱联用仪；MassLynx4.1SN950系统软件；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：0.8kV；离子源温度：500℃；MRM分析质谱参数：
。
较优地，所述三类聚醚类抗生素的检出限规定为1μg/kg，所述方法的加标回收率在83.2％到98.0％之间，标准偏差在1.16％到7.50％之间。
较优地，所述步骤2)中甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为8：2。
较优地，所述步骤2)中高速离心的条件为：在高速冷冻离心机上，4℃情况下10000r/min离心5min。
较优地，所述步骤2)中过滤为采用0.22μm有机滤膜。
较优地，采用多管涡旋混合仪进行涡旋。
如上所述的方法在测定聚醚类抗生素残留量方面中的应用。
具体的，相关制备及检测如下：
购买周边超市的鸡蛋，制成实验用均质样品，采样液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量，包括以下步骤：
1)鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的乙腈提取
称取5.0g样品(精确至0.05g)于50mL的离心管A中，加入15mL乙腈迅速摇匀，在多管涡旋混合仪上2500r/min涡旋10min。移出上清液至离心管B中。再加入10mL的乙腈进行第二次提取，涡旋离心条件均与前面的参数相同。第二次提取完成后将上清液移到离心B中，合并提取液，摇匀。
2)无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分
加入5g的无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分，2500r/min涡旋5min，涡旋完成后在高速冷冻离心机上，4℃情况下10000r/min离心5min。用规格为5.0mL的移液器移取5mL上清液至试管中，放在氮吹浓缩仪中不加热氮吹，等到装提取液的玻璃管无流动液体时，用甲醇水溶液(甲醇：水的体积比为8：2，v/v)定容至4mL，过0.22μm有机滤膜至进样小瓶中，低温避光保存备用。
3)使用液相色谱串联质谱联用仪检测
a)标准工作溶液的制备：分别准确称取适量的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉标准品于10mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10μg/mL的标准溶液，再用甲醇稀释成100ng/mL的标准工作溶液；
b)基质标准工作曲线：鸡蛋空白样品按上述步骤1)和步骤2)的前处理方式提取和净化后的空白基质液，与步骤a)制备的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的标准工作溶液配制成浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、6ng/mL混合基质标准工作溶液；
c)将步骤b)制备的系列浓度的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的基质标准工作溶液和步骤1)和2)制备的待检测莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素含量的样品溶液注入液相色谱仪，经串联质谱仪检测后得到鸡蛋样品中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的含量。
4)结果分析
定性和定量：用样品溶液出现的色谱峰保留时间和定性离子进行定性；以标准工作液的浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行外标法定量；
所述液相色谱的条件：ACQOITYC18(21mm×50mm，1.5μm)色谱柱；流速：0.300mL/min；进样量：5μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水；流动相洗脱梯度见表1：
表1流动相洗脱梯度
其中，％A示流动相A的体积分数，％B示流动相B的体积分数。
质谱条件：液相色谱/三重四级杆串联质谱联用仪(美国Waters公司，型号：WATERSXEVO TQ-S)；MassLynx4.1 SN950系统软件；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：0.8kV；离子源温度：500℃；MRM分析质谱参数见表2：
表2分析物在保留时间内MRM分析质谱参数
本发明方法的准确度和精密度试验：
根据步骤1)在样品中加入莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素标准溶液，设置3个加标浓度，分别为1μg/kg、5μg/kg和10μg/kg，并且每个浓度做6次重复实验，通过超高效液相-串联质谱仪检测出样品中所加入的聚醚类抗生素标准样品浓度，最后通过计算得出最终样品加标回收率，如表3所示。数据以6次平均试验表示。
表3鸡蛋样品莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)
由表3中可以得出，使用超高效液相-串联质谱法测定鸡蛋中三类常见的聚醚类抗生素莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的平均加标回收率均不低于83.2％，RSD在1.16％-7.50％之间。最终得到的聚醚类抗生素溶液(6.0ppb)的质量色谱图如图1所示，聚醚类抗生素溶液(6.0ppb)的子离子扫描质谱图如图2所示。
在优化实验之前，实验使用无水硫酸钠吸收样品中的水分、0.5％甲酸水作为流动相、TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中的聚醚类抗生素。其中莫能菌素的样品平均加标回收率为83.17％，盐霉素的样品平均加标回收率为80.6％，甲基盐霉素的样品平均加标回收率为81.5％，该实验的标准偏差在1.5％-8.1％之间。本方法采用乙腈两次提取，无水碳酸钠吸收样品中的水分，UPLC快速分离，串联质谱检测，成功建立鸡蛋中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素等3种聚醚类抗生素的快速检测方法。由上述可得出，本方法的建立不仅使实验加标回收率得到提高，实验的灵敏度和精密度更高，而且还做到节约资源，爱护环境的实验室的安全实验原则。本实验在检测时所用时间不到5min，而该实验优化之前提取时间在17min左右，大大节省了在样品检测分析时所花费的时间。并且减少了机器的磨损，使得检测仪器的使用寿命更长，节约在研究时不必要的经费开支，满足了国内外对该类物质的检测要求。该方法简单快速、不需要衍生、不需要固相萃取净化、具有良好的回收率和重现性。实行此方法极大地节约了前处理时间，并且自动化程度高，可以进行大批量样品处理，保证了该方法在检测时的准确性及稳定性。该分析结果稳定、可靠，符合残留检测要求，可以满足对鸡蛋中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素3种聚醚类抗生素同时测定的要求。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (9)
1.一种液相色谱串联质谱联用仪测定鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)鸡蛋中聚醚类抗生素残留量的乙腈提取
称取样品，加入乙腈迅速摇匀，2500r/min涡旋10min，提取上清液；再加入乙腈进行第二次提取，涡旋离心条件均与前面的参数相同；合并提取液，摇匀，得到样品提取液；
其中，样品：第一次乙腈：第二次乙腈的比例g：mL：mL为5:15:10；
2)无水碳酸钠吸收样品提取液中的水分
加入无水碳酸钠吸收步骤1)得到的样品提取液中的水分，2500r/min涡旋5min，涡旋完成后高速离心；移取上清液，不加热氮吹，等样品提取液无流动时，用甲醇水溶液定容，过滤至进样小瓶中，制得样品溶液，低温避光保存备用；
其中，所述无水碳酸钠与样品的质量比为1：1，无水碳酸钠：用甲醇水溶液定容后体积的比例g：mL为5：4；
3)使用液相色谱串联质谱联用仪检测
a)标准工作溶液的制备：分别准确称取莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉标准品，用甲醇定容，配制成10μg/mL的标准溶液，再用甲醇稀释成100ng/mL的标准工作溶液；
b)基质标准工作曲线：鸡蛋空白样品按上述步骤1)和步骤2)的前处理方式提取和净化后的空白基质液，与步骤a)制备的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的标准工作溶液配制成浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、6ng/mL混合基质标准工作溶液；
c)将步骤b)制备的系列浓度的莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的基质标准工作溶液和步骤2)制备的待检测莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素含量的样品溶液注入液相色谱仪，经串联质谱仪检测后得到鸡蛋样品中莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的含量；
4)结果分析
定性和定量：以化合物的准分子离子峰的精确质量数为定性离子和定量离子；以标准工作液的浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行外标法定量；用样品溶液出现的色谱峰保留时间和定性离子进行定性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱的条件：ACQOITYC18色谱柱；流速：0.300mL/min；进样量：5μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水；流动相洗脱梯度：
其中，％A示流动相A体积分数，％B示流动相B体积分数。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述质谱条件：液相色谱/三重四级杆串联质谱联用仪；MassLynx4.1 SN950系统软件；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：0.8kV；离子源温度：500℃；MRM分析质谱参数：
。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述三类聚醚类抗生素的检出限规定为1μg/kg，所述方法的加标回收率在83.2％到98.0％之间，标准偏差在1.16％到7.50％之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为8：2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中高速离心的条件为：在高速冷冻离心机上，4℃情况下10000r/min离心5min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中过滤为采用0.22μm有机滤膜。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用多管涡旋混合仪进行涡旋。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法在测定聚醚类抗生素残留量方面中的应用。
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