CN111693631A - 一种同时测定酒中多种有害物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品质量安全检测技术领域，公开了一种同时测定酒中多种有害物的方法，包括如下步骤：(1)对待测样品进行萃取和净化，所用萃取溶剂为乙腈‑乙酸乙酯混合溶剂，将所得萃取溶液进行离心处理，得到提取液；所述混合溶剂中乙腈和乙酸乙酯的体积比为4:1～10:1；(2)对提取液进行GC‑MS/MS检测，亚硝胺以内标法定量，氨基甲酸乙酯以外标法定量。本发明检测方法的灵敏度高、重现性好、结果准确可靠，适用于同时检测啤酒、黄酒等酒类样品中氨基甲酸乙酯和亚硝胺的含量。

Description

一种同时测定酒中多种有害物的方法
技术领域
本发明涉及食品质量安全检测技术领域，具体涉及利用冰浴辅助固体氢氧化钠强碱净化结合GC-MS/MS技术同时检测酒类饮料中氨基甲酸乙酯和亚硝胺等胺(氨)类危害物的方法。
背景技术
亚硝胺(NAs)是一类具有强致癌性的化合物，在人体内可将DNA烷基化，进而诱导癌变，对人体健康造成严重危害。亚硝胺的前体物质，如亚硝酸盐和胺类化合物等，可以通过一定途径转化成亚硝胺。目前，已在腌制、烟熏、啤酒、饮用水等食品和酒精饮料中检测出亚硝胺的存在。氨基甲酸乙酯(EC)也是一种已知的致癌物和诱变剂，已被国际癌症研究机构归类为2A类可能致癌物。目前，国内外学者也已在酸奶、奶酪、豆制品、白酒、黄酒、啤酒、红酒和其他的葡萄酒等众多发酵食品和酒精饮料中检测到氨基甲酸乙酯的存在。
中国是酒精饮料消费大国，然而，食用过多含有亚硝胺和氨基甲酸乙酯的酒精饮料可能对人体健康产生危害。因此，开发酒精饮料中氨基甲酸乙酯和亚硝胺的检测方法对于酒精饮料产业的健康发展和消费者的营养健康具有非常重大的现实意义。
常用的氨基甲酸乙酯的检测方法主要有ELISA法、表面增强拉曼光谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱法、液相色谱串联质谱法。由于氨基甲酸乙酯的分子特性，GC-MS法是目前检测食品中EC含量最广泛使用的方法。国内外对于食品中亚硝胺的检测方法主要为气相色谱-热能检测器(GC-TEA)法、GC-MS法和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法，但TEA应用范围窄，价格昂贵，普适性较差，LC-MS/MS检测成本较高。此外，由于亚硝胺大多为挥发性化合物，因此，GC-MS法也是目前食品中亚硝胺测定的最主要方法。
然而，单级质谱对复杂基质中低含量的氨基甲酸乙酯和一些亚硝胺(如N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基甲乙胺)的识别和定量仍存在较大困难，原因是这些化合物的特征离子太小，容易受到其他基质的干扰。因此，亟需开发一种基质干扰小、重现性高的酒类样品中亚硝胺和氨基甲酸乙酯的检测方法。尽管目前有一些研究报道了酒类样品中亚硝胺和氨基甲酸乙酯的检测方法，但这些方法大都是单独检测亚硝胺或者单独检测氨基甲酸乙酯，并未见同时测定这两类胺(氨)类危害物的方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种不同酒精饮料中氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物(具体化合物的缩写、CAS号见表1)的同时测定方法。具体包括冰浴辅助固体氢氧化钠强碱净化得前处理方法和气相色谱-串联三重四极杆质谱(GC-MS/MS)检测技术。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种测定酒中胺(氨)类有害物的方法，包括如下步骤：
(1)对待测样品进行萃取和净化，所用萃取溶剂为乙腈-乙酸乙酯混合溶剂，将所得萃取溶液进行离心处理，得到提取液；所述混合溶剂中乙腈和乙酸乙酯的体积比为4:1～10:1；
(2)对提取液进行气相色谱串联三重四极杆质谱(GC-MS/MS)检测，其中GC-MS/MS条件为：
色谱柱：HP-INNOWAX石英毛细管气相色谱柱；猝灭气氦气流量：2.0～2.5mL/min；碰撞气氮气流量：1.2～1.8mL/min；隔垫吹扫流量：2.5～3.5mL/min；柱温程序：初始温度45～55℃保持1min，以8～12℃/min升至80～100℃保持2～8min，再以5～10℃/min升至110～150℃保持2～8min，最后以10～20℃/min的速率升至220～280℃保持5～15min；进样口温度200～250℃；进样量0.8～1.2μL，不分流进样；溶剂延迟：5～10min；
离子源：EI，60-80eV；离子源温度220～280℃；四级杆温度：130-170℃；传输线温度：220～280℃；EMV增量：500-700V；动态多反应监测扫描模式；以RT±0.3min的模式采集。
(3)标准溶液的制备
纯溶剂标准溶液：使用色谱纯的乙腈配置各胺(氨)类待测物的标准储备溶液，采用乙腈-乙酸乙酯(9/1，v/v)混合溶剂逐级稀释获取纯溶剂标准工作溶液。
基质加标溶液：取酒精饮料样品，按上述的样品前处理条件进行提取和净化，得到基质提取溶液，利用基质提取溶液为溶剂，制备不同浓度的基质加标溶液。
(4)检测分析
将基质加标溶液和待测液在上述GC-MS/MS条件下分别进样，制作基质标准曲线，亚硝胺以内标法定量，氨基甲酸乙酯以外标法定量。
优选地，所述GC-MS/MS条件为：
色谱柱：HP-INNOWAX石英毛细管气相色谱柱；猝灭气氦气流量：2.25mL/min；碰撞气氮气流量：1.5mL/min；隔垫吹扫流量：3mL/min；柱温程序：初始温度50℃保持1min，以10℃/min升至90℃保持4min，再以7℃/min升至130℃保持5min，最后以15℃/min的速率升至250℃保持10min；进样口温度220℃；进样量1.0μL，不分流进样；溶剂延迟：7min；
离子源：EI，70eV；离子源温度250℃；四级杆温度(MS1)：150℃；传输线温度：250℃；EMV增量：600V；动态多反应监测扫描模式(dMRM)；以RT±0.3min的模式采集。
优选地，步骤(1)所述净化是在冰浴条件下用氢氧化钠固体对样品进行净化除杂。
优选地，步骤(1)所述乙腈和乙酸乙酯的体积比为9:1。
优选地，步骤(1)对待测样品进行萃取和净化，具体步骤如下：
向待测样品中加入乙腈-乙酸乙酯混合溶剂和NaCl，涡旋分散，于-20℃静置；然后取出在冰浴中边振荡边缓慢加入NaOH固体，涡旋振荡，离心收集上清液，在残液中再加入乙腈-乙酸乙酯混合溶剂，在冰浴中重复萃取一次，合并两次的萃取液后，再添加乙腈-乙酸乙酯混合溶剂，离心取上清液。
优选地，前后两次离心的条件分别为：4500r/min下离心3min、13000r/min下离心3min。
优选地，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm。
本发明基于NaOH可与醇类、氨基酸等成分发生反应从而消减这些杂质的干扰，采用NaOH固体除杂，能够达到比NaOH溶液更好的除杂效果。同时，考虑到NaOH固体在溶解过程中会产生大量热量，而氨基甲酸乙酯可以与碱共热而分解放出氨，增加了氨基甲酸乙酯的损失，因此，该前处理过程选择在冰浴条件下进行，可显著减少氨基甲酸乙酯的损失。最后经过GC-MS/MS检测，亚硝胺以内标法定量，氨基甲酸乙酯以外标法定量。该方法灵敏度高、重现性好，能够弥补GC-MS检测方法中基质干扰大、重现性差的问题，可同时检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物的含量。
表1本方法中氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物的英文名称、缩写及CAS号
Figure BDA0002596380240000031
Figure BDA0002596380240000041
本发明采用冰浴辅助固体氢氧化钠强碱净化-GC-MS/MS法同时检测酒精饮料中的氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物，与现有检测技术相比，具有如下突出的实质性优势和显著进步：
(1)本发明首次提供了一种基于冰浴辅助固体氢氧化钠强碱净化的方法，可用于黄酒、啤酒等酒精饮料中氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物的同时提取和除杂，能够获得较好的提取效率和净化除杂效果。
(2)本发明利用气相色谱-串联三重四极杆质谱(GC-MS/MS)技术，首次建立了氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物的同时测定方法，与传统检测方法中检测目标物仅为其中一类化合物相比，具有明显的便捷性，一次进样可实现这两类胺(氨)类危害物的定量检测。
(3)本方法灵敏度高、准确可靠、重现性好，可克服样品基质干扰。本方法对于酒精饮料中氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物的方法检出限(MLOD)可达0.1-0.5μg/L。
(4)本方法简便快捷、可操作性强，可适用于大批量样品的检测，可为酒精饮料的质量控制、危害物检测提供重要技术支持，具有良好的经济与社会效益。
附图说明
图1为13种胺(氨)类危害物标准溶液的总离子色谱图(50.0μg/L)。
图2为13种胺(氨)类危害物及其同位素内标物的MRM色谱图(50.0μg/L)。
图3为不同比例的乙腈和乙酸乙酯作为提取溶剂对13种胺(氨)类危害物回收率的影响。
图4为酒类样品经NaOH净化前后的提取离子色谱图；1、未使用NaOH；2、加入1.2gNaOH固体；3、使用NaOH溶液(120g/L)。
图5为NaOH对13种胺(氨)类危害物回收率的影响；1.不使用NaOH；2.使用NaOH溶液(120g/L)；3.常温加入1.2g NaOH固体；4.冰水浴下缓慢加入1.2g NaOH固体。
具体实施方式
实施例1：GC-MS/MS仪器条件的确定
首先对13种目标物和2种同位素内标标准溶液(浓度为0.2-1mg/L)进行全扫描，确定每种分析物的分子离子；再在产物离子模式下对分子离子进行二级质谱扫描，选择信号强度较大的、干扰小的两个碎片离子作为特征定性定量离子，由于NDMA和EC分子量小，明显的二级碎片只有1个，质荷比太小的碎片受仪器背景噪音干扰大，故采用“分子离子/分子离子”组对的方式形成第2对定性离子，优化碰撞能等质谱参数，使各特征离子对信号达到最强，以动态多反应监测扫描模式(dMRM)测定(优化得到的质谱条件见表2)。
表2本方法中氨基甲酸乙酯和亚硝胺两类胺(氨)类危害物的质谱条件
Figure BDA0002596380240000051
亚硝胺的正辛醇-水分配系数(log Kow)为-0.64-3.90，极性范围分布较宽。据文献报道，挥发性亚硝胺可在中等、强极性毛细管色谱柱上获得良好分离。因此，本发明采用极性气相色谱柱HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25μm)对13种目标分析物进行分离检测，13种N-亚硝胺和氨基甲酸乙酯均可以有效分离且峰型尖锐、基线平稳。在上述优化后的仪器条件下参数下，各化合物的总离子色谱图见附图1，提取离子色谱图见附图2。
实施例2：提取净化条件的优化
实验采用乙腈-乙酸乙酯混合溶剂作为提取溶剂，考察了两种溶剂的体积比对提取效果的影响，分别考察了9:1、8:2、7:3、6:4的乙腈-乙酸乙酯混合溶剂的提取效果，对比各分析物的回收率，发现乙腈-乙酸乙酯的体积比为9:1时，各分析物的回收率最好(附图3)。故采用乙腈-乙酸乙酯(9/1,v/v)作为提取溶剂。
酒精饮料组分复杂，杂质组分在提取时很容易被共萃取出，在仪器检测时增加背景噪音、与目标物不能完全分离、产生基质效应等，干扰目标物的准确定性定量，因此，需要对提取溶液进行净化。参考国标和现有研究，NaOH可与醇类、氨基酸等成分发生反应从而消减这类物质的干扰，实验考察了NaOH溶液(120g/L)和NaOH固体(1.2g)的净化除杂效果，对比GC-MS采集的总离子流色谱图，NaOH净化除杂效果明显(附图4)。
但同时发现NaOH除杂会使EC的回收率大大降低，无法满足要求；此外，采用NaOH溶液除杂，由于溶液中含有水，会使部分N-亚硝胺(如NDMA、NMEA等)在提取过程中转移至水溶液中被洗去而导致回收率较低，而使用NaOH固体除杂，在NaOH固体溶解过程中会产生大量热量，而EC可以与碱共热而分解放出氨，同时产生乙醇，增加EC的损失。为了抑制EC与NaOH的反应，同时除掉醇类物质等干扰物且获得较好的回收率，本实验尝试先将样品萃取体系降温，然后在冰浴条件下缓慢加入NaOH固体，防止样品溶液体系短时间发热。实验如附图5所示，各目标分析物均可获得较好的回收率。
实施例3：黄酒和啤酒中13种胺(氨)类危害物含量的检测
(1)样品提取和净化
准确量取5.0mL黄酒或啤酒样品于50mL塑料离心管中，分别加入50μL 1.0mg/L的NDMA-d6和NDPA-d14内标溶液，再加入5mL乙腈-乙酸乙酯(9/1,v/v)混合溶剂，涡旋分散，加入3.6g NaCl，涡旋30s，于-20℃冰箱中放置约20min；取出后在冰水浴下边摇动边缓慢加入1.2g NaOH固体。涡旋振荡1min后，在4500r/min下离心3min，取上清液于10mL玻璃比色管中，在残液中再加入5mL乙腈-乙酸乙酯(9/1,v/v)混合溶剂，在冰浴中重复萃取一次，合并两次的萃取液后在室温下氮吹至约0.5mL，再用乙腈-乙酸乙酯(9/1,v/v)混合溶剂定容至1.0mL，涡旋混匀后，倒入1.5mL塑料离心管，在13000r/min下离心3min，取上清液上机测试。
(2)GC-MS/MS条件
色谱柱：HP-INNOWAX石英毛细管气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；猝灭气(He)流量：2.25mL/min；碰撞气(N2)流量：1.5mL/min；隔垫吹扫流量：3mL/min；柱温程序：初始温度50℃保持1min，以10℃/min升至90℃保持4min，再以7℃/min升至130℃保持5min，最后以15℃/min的速率升至250℃保持10min；进样口温度220℃；进样量1.0μL，不分流进样；溶剂延迟：7min。
离子源：EI，70eV；离子源温度250℃；四级杆温度(MS1)：150℃；传输线温度：250℃；EMV增量：600V；动态多反应监测扫描模式(dMRM)；以RT±0.3min的模式采集。
(3)标准溶液的制备
纯溶剂标准溶液：使用色谱纯的乙腈配置各胺(氨)类待测物的标准储备溶液，采用乙腈-乙酸乙酯(9/1，v/v)混合溶剂逐级稀释获取纯溶剂标准工作溶液。
基质加标溶液：取酒精饮料样品，按上述的样品前处理条件进行提取和净化，得到基质提取溶液，利用基质提取溶液为溶剂，制备不同浓度的基质加标溶液。
(4)检测分析
将基质加标溶液和待测液在上述GC-MS/MS条件下分别进样，制作基质标准曲线，亚硝胺以内标法定量，氨基甲酸乙酯以外标法定量。
(5)基质效应、方法的线性关系和检出限
实验用啤酒样品基质提取液配制标准溶液(浓度为20μg/L)，以纯溶剂配制的同浓度标准溶液作参照，通过二者比值来评价基质效应(ME)，即公式：ME＝(B-B0)/A，其中A、B和B0分别表示纯溶剂标准溶液、基质标准溶液和样品基质中分析物的峰面积。实验测得13种胺(氨)类目标物的基质效应在0.92-1.38之间(见表3)，其中NPYR和NDPhA的基质效应大于1.2，说明这2种化合物存在基质增强效应，但是通过同位素内标校正后，基质效应为1.06和0.93，可以满足方法学要求。
实验采用乙腈-乙酸乙酯混合溶剂(9:1，v/v)逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度，重复进样，根据测试结果的标准偏差，以大于等于3倍信噪比确定仪器检出限(ILOD，S/N≥3)，以大于等于10倍信噪比确定仪器定量限(ILOQ，S/N≥10)，通过ILOD和ILOQ，再结合目标分析物回收率(n＝6)和样品前处理稀释倍数来确定方法检出限(MLOD)和方法定量限(MLOQ)。
通过配置五个不同浓度的纯溶剂标准溶液，每个浓度均含有50μg/L NDMA-d6和NDPA-d14，N-亚硝胺以目标物定量离子对峰面积与相应内标物定量离子对峰面积的比值(y)为纵坐标，EC以目标物定量离子对峰面积(y)为纵坐标，以相应浓度(x，μg/L)为横坐标进行回归分析，得到各化合物的线性回归方程、线性范围，见表3。13种N-亚硝胺和EC在各自的质量浓度范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数R≥0.999，线性范围在2-200μg/L之间，方法检出限在0.1-0.5μg/L之间，方法定量限在0.5-1.5μg/L之间，表明方法具有较好的灵敏度。
表3本发明中建立的检测方法的基质效应、方法的线性关系和检出限
Figure BDA0002596380240000081
(6)准确度和精密度
选择一代表性啤酒样品(氨基甲酸乙酯含量0.8μg/L，亚硝胺类物质未检出)进行3个浓度的加标回收实验，亚硝胺的添加水平分别为1倍、2倍和10倍的方法定量限，氨基甲酸乙酯的添加水平分别约为1倍、2倍和10倍的样品本底值，每个浓度水平做6个平行样，计算回收率和日内精密度；以中间添加水平连续实验5天，计算回收率和日间精密度。实验结果见表4，亚硝胺和氨基甲酸乙酯的平均回收率在81.5％-121.0％之间，日内精密度RSD(n＝6)在2.2％-9.4％之间；日间精密度RSD(n＝5)在1.6％-7.9％之间，准确性和精密度均较好。
表4 13种胺(氨)类检测物的回收率和精密度
Figure BDA0002596380240000082
Figure BDA0002596380240000091
(7)实际啤酒和黄酒样品的检测
对市售的12份啤酒样品和11份黄酒样品进行检测分析，均未检出亚硝胺，但所有样品均检出氨基甲酸乙酯，含量在1.1-22.90μg/L。

Claims (8)

1.一种同时测定酒中多种有害物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对待测样品进行萃取和净化，所用萃取溶剂为乙腈-乙酸乙酯混合溶剂，将所得萃取溶液进行离心处理，得到提取液；所述混合溶剂中乙腈和乙酸乙酯的体积比为4:1～10:1；
(2)对提取液进行GC-MS/MS检测，其中GC-MS/MS条件为：
色谱柱：HP-INNOWAX石英毛细管气相色谱柱；猝灭气氦气流量：2.0～2.5mL/min；碰撞气氮气流量：1.2～1.8mL/min；隔垫吹扫流量：2.5～3.5mL/min；柱温程序：初始温度45～55℃保持1min，以8～12℃/min升至80～100℃保持2～8min，再以5～10℃/min升至110～150℃保持2～8min，最后以10～20℃/min的速率升至220～280℃保持5～15min；进样口温度200～250℃；进样量0.8～1.2μL，不分流进样；溶剂延迟：5～10min；
离子源：EI，60-80eV；离子源温度220～280℃；四级杆温度：130-170℃；传输线温度：220～280℃；EMV增量：500-700V；动态多反应监测扫描模式；以RT±0.3min的模式采集。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述GC-MS/MS条件为：
色谱柱：HP-INNOWAX石英毛细管气相色谱柱；猝灭气氦气流量：2.25mL/min；碰撞气氮气流量：1.5mL/min；隔垫吹扫流量：3mL/min；柱温程序：初始温度50℃保持1min，以10℃/min升至90℃保持4min，再以7℃/min升至130℃保持5min，最后以15℃/min的速率升至250℃保持10min；进样口温度220℃；进样量1.0μL，不分流进样；溶剂延迟：7min；
离子源：EI，70eV；离子源温度250℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：250℃；EMV增量：600V；动态多反应监测扫描模式；以RT±0.3min的模式采集。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述净化是在冰浴条件下用氢氧化钠固体对样品进行净化除杂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述乙腈和乙酸乙酯的体积比为9:1。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)对待测样品进行萃取和净化，具体步骤如下：
向待测样品中加入乙腈-乙酸乙酯混合溶剂和NaCl，涡旋分散，于-20℃静置；然后取出在冰浴中边振荡边缓慢加入NaOH固体，涡旋振荡，离心收集上清液，在残液中再加入乙腈-乙酸乙酯混合溶剂，在冰浴中重复萃取一次，合并两次的萃取液后，再添加乙腈-乙酸乙酯混合溶剂，离心取上清液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，前后两次离心的条件分别为：4500r/min下离心3min、13000r/min下离心3min。
7.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，GC-MS/MS检测后进行分析，制作标准曲线，样品中的亚硝胺以内标法定量，氨基甲酸乙酯以外标法定量。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112730663A (zh) * 2020-12-22 2021-04-30 华测检测认证集团湖北有限责任公司 一种快速准确测定食品中挥发性亚硝胺方法

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