CN115248276B - 一种猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及痕量有害物质分析检测方法，具体涉及到一种测定猪可食组织中苯巴比妥残留量的测定方法，即：1)向猪肉可食性组织中加入苯巴比妥‑D5、乙酸乙酯，混匀后离心，取上清吹干后复溶、除脂；2)取步骤1)产物过亲水‑亲酯固相萃取柱，然后以甲醇洗脱、离心、过滤；3)取步骤2)产物进行液相色谱‑串联质谱法测定；该方法联合液液净化和固相萃取分离技术，降低脂类、蛋白对猪肝、猪肾等脏器复杂的基质干扰的干扰，提升了仪器灵敏度和回收率，避免了气相‑色谱串联质谱法操作的繁复性，本申请测定低限为1μg/kg,苯巴比妥在1μg/kg～10μg/kg添加浓度的回收率为70％～110％,批内相对标准偏差≤15％，批间相对标准偏差≤20％。

Description

一种猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的测定方法

技术领域

本发明属于动物源食品中兽药残留的检测技术领域，具体涉及一种猪可食性组织(肌肉、肝脏、肾脏和脂肪)中苯巴比妥药物残留量的测定方法。

背景技术

苯巴比妥属于安眠镇静药物，兽药临床用作镇静剂，可引起近似生理性睡眠，常被非法用作饲料添加剂，尤其在生猪生产中应用，促进生猪生长许多国家禁止其作为饲料添加剂，防止动物体内该类药物蓄积而影响食用者安全。农业部公告176号《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》规定，苯巴比妥禁止在动物饲料和饮水中使用，但可通过注射用于猪等动物。人类在食用含有苯巴比妥残留的猪肉或者其他组织后，可能危害人体健康。

由于苯巴比妥对人体健康存在危害，针对动物源食品中苯巴比妥残留量的检测与分析，开发了多种方法，例如高效液相色谱法、气相色谱串联质谱法、气相法及液相色谱串联质谱法等，涉及水产品、血液、饲料和畜禽肉等。高效液相色谱法和气相色谱法专属性较差，难以满足复杂基质，如肝、肾和脂肪等杂质的分离和测定，特异性较差；气相色谱-串联质谱法检测苯巴比妥类药物需要衍生化，且灵敏度较低。液相色谱串联质谱法灵敏度高、分析范围广、准确度高，已经广泛应用。目前，国内现行有效的《进出口动物源性食品中巴比妥类药物残留量的检测方法高效液相色谱-质谱/质谱法》(SN/T 2217-2008)，适用于猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉中苯巴比妥等残留量的测定，该标准不包括猪肾和猪脂肪，存在动物靶组织覆盖不全的问题，而其他现行有效的方法标准均不包括猪可食组织。这主要是因为现有苯巴比妥的前处理方法主要有固相萃取法、液液萃取法和衍生化法等，基于猪肝、猪肾等脏器复杂的基质干扰，而高效液相色谱-质谱法对样品处理要求较高，现有前处理方法无法满足高精度检测的要求。因此提供一种灵敏、准确的测定猪可食组织(特别是猪肝、猪肾等脏器)中苯巴比妥药物的方法已成为本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

针对上述现有苯巴比妥检测前处理中存在的去脂等杂质不充分、回收率低、干扰大等问题，本申请提供一种适用于猪可食组织中苯巴比妥液相色谱-串联质谱法测定的方法，以填补目前猪可食性组织检测的空白。

本申请是通过如下技术方案实现的：

一种猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的的测定方法,具体步骤为：

1)样品提取

称取猪肉可食性组织2g(精确至±0.02g)于50mL塑料离心管中，添加200ng/mL苯巴比妥-D5标准工作液(内标工作液)50μL。加入乙酸乙酯溶液30mL，振荡混匀5min，4℃5000r/min离心5min，转移上清液至另一离心管中，45℃氮气吹干；加0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.0)10mL溶解残渣，加再正己烷10mL除脂，涡旋振荡2min，4℃5000r/min离心5min，去除正己烷层，取下层溶液再次加入正己烷10mL，涡旋振荡2min，4℃5000r/min离心5min(即重复以上除脂过程一次)，取下层样液，备用。

上述猪肉可食性组织包括猪可食性组织包括猪肌肉、猪肝、猪肾和猪脂肪。本步骤提取液采用乙酸乙酯，避免了乙腈和甲醇在提取中样品易结块、含水量和水溶性杂质高的问题，以缩短提取液氮吹的时间。

2)样品净化

分别用甲醇、水和0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.0)各5mL活化亲水-亲酯固相萃取柱(Oasis HLB，优选200mg，6mL)；取步骤1)获得的下层样液上柱，依次用水、2％甲醇溶液、正己烷-乙酸乙酯(95+5，V+V)各5mL淋洗，抽干；取甲醇溶液5mL洗脱，洗脱液于45℃氮气吹干，取残余物用浓度为10％的甲醇溶液1.0mL复溶，于4℃13000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜；获得净化后的样品，备用。

本步骤针对肝、肾和脂肪复杂的基质，该方法中淋洗步骤中除了常规的水和甲醇溶液，增加正己烷-乙酸乙酯淋洗液，去除结合在固相萃取柱上非极性较强的杂质，如脂类和色素等。

同时，洗脱采用5mL的甲醇，试剂方便易得，甲醇5mL的体积能够最大限度将目标物从柱子上洗脱下来，体积用量较少。

3)样品检测分析

检测采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定猪可食组织中苯巴比妥药物的浓度，梯度洗脱；

色谱条件如下：C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)或相当者；流动相：A：水，B：甲醇，梯度洗脱程序见表1；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；具体洗脱程序见表1。

质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压：-4500V；雾化温度：500℃；气帘气：40psi；雾化气：45psi；具体质谱参数见表2。

本步骤检测中，样品处理通过固相萃取小柱净化富集后，再用液相色谱-质谱法(LC-MS)进行检测，可准确快速测定猪可食性组织中所残留苯巴比妥的含量，尤其适合猪肝、猪肾和脂肪等基质含量复杂的组织样品。另外，通过添加内标，提高方法的准确度，减少基质干扰，检测限低、灵敏度高、操作简便、定量准确。

本申请的实施例中，通过液相色谱-串联质谱法对猪可食性组织(包括猪肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织)中苯巴比妥的残留量进行定性和定量分析，使用内标法进行定量，结果准确可靠，苯巴比妥的检测限为0.5μg/kg(S/N>3)，定量限为1.0μg/kg(S/N>10)，线性范围在1.0-50.0ng/mL，线性相关系数r2值均大于0.99。苯巴比妥在四种基质中平均回收率为94.6％～107.1％，批内相对标准偏差为1.1％～9.4％，批间相对标准偏差为3.3％～7.0％，显著提高了现有技术的检测灵敏度和准确性。

与现有液相色谱-质谱前处理方法相比，本申请技术具有以下有益效果：

1)本申请采用液相色谱-串联质谱法，适用于猪肝、猪肾和猪脂肪中苯巴比妥的定性和定量方法，弥补了现有检测文献和标准中的空白。避免了气相-色谱串联质谱法衍生化等操作的繁复性、不完全衍生化导致的准确性降低等缺点。

2)本方法在提取时采用乙酸乙酯进行一次提取，该方式一方面不易造成样品结块，提高提取效率；另一方面利于节省提取时间，缩短氮吹时间，提取过程简单、快速，经济，对操作人员的身体危害较小，对环境污染相对较少；改善了现有标准中《SN/T2217-2008进出口动物源性食品中巴比妥药物残留量的检测方法高效液相色谱-质谱/质谱法》中采用酸化乙腈进行两次提取，造成提取和氮吹时间增加，操作繁复的问题。

3)本申请净化与浓缩方式的选择采用正己烷净化法和固相萃取法相结合。由于肌肉、肝脏等组织中基质复杂，传统的液液萃取即正己烷净化法不能满足样品净化要求，处理后杂质仍比较多，溶液浑浊，通过固相萃取柱的反相净化，回收率达到标准，减少脂类对分析结果的干扰。因此对提取液经正己烷去脂，再经固相萃取净化富集，降低脂类、蛋白等干扰，提升了仪器灵敏度，同时又达到净化的效果。

4)本发明样品的前处理技术中采用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.0)复溶样品后通过固相萃取小柱进行净化，确保目标物与小柱填料结合，提高了固相萃取小柱的回收率。

5)本申请方法的检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg，方法的灵敏度、准确度和精密度优于其他现有方法。

附图说明

图1是苯巴比妥标准品的离子色谱图，从上至下分别为：苯巴比妥、内标苯巴比妥-D5。

图2不同提取液对苯巴比妥回收率的影响示意图。

图3为不同淋洗液淋洗对苯巴比妥回收率的影响示意图。

图4为不同洗脱液对苯巴比妥在HLB柱回收率影响示意图。

图5为苯巴比妥溶剂标准溶液工作曲线示意图。

具体实施方式

为了更清楚说明本发明的技术方案，下面将结合具体实施例和附图对本发明进行详细的说明，其中提到的附图仅仅适用下述实施例，对于本领域普通技术员,还可以根据本发明中提到的方法获得其他附图。但是本发明的保护范围并不限于下述实施例。

本发明所涉及到的试剂和材料及实验仪器如下：

A.试剂和材料

以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。标准品:苯巴比妥(Phenobarbital,C12H12N2O3,CAS:50-06-6)、苯巴比妥-D5(Phenobarbital-D5,C12H7D5N2O3,CAS:72793-46-5)，含量均≥98.0％。

甲醇:色谱纯；正己烷；乙酸乙酯；氢氧化钠；磷酸二氢钾。

2％甲醇溶液：取甲醇2mL至100mL容量瓶，加水稀释至刻度。

10％甲醇溶液：取甲醇10mL至100mL容量瓶，加水稀释至刻度。

10mol/L氢氧化钠溶液：称取100g氢氧化钠至250mL容量瓶，加水溶解并稀释至刻度。

0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.0)：称取磷酸二氢钾13.6g至500mL容量瓶，加水480mL使溶解，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0，加水稀释至刻度，临用现配。

正己烷-乙酸乙酯溶液(95:5，V+V)：取正己烷190mL和乙酸乙酯10mL，混匀。

亲水-亲脂固相萃取柱(Oasis HLB)：200mg/6mL，或相当者。

尼龙微孔滤膜：0.22μm

标准储备液的配制：取苯巴比妥标准品、苯巴比妥-D5标准品各约10mg，精密称定，分别于10mL棕色容量瓶中，用甲醇适量使溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的苯巴比妥和苯巴比妥-D5标准储备液。

标准工作液的配制：分别精密量取上述标准储备液0.1mL，分别于100mL容量瓶中，用10％甲醇溶液稀释至刻度，配制成苯巴比妥、苯巴比妥-D5浓度为1μg/mL的标准工作液。

B.设备和仪器

液相色谱串联质谱仪(API 6500+，SCIEX公司)、分析天平(ME104E，METTLER公司)、高速冷冻离心机(5810R，Epppedorf公司)；涡旋混匀器(VORTEX 3，IKA公司)；氮吹仪(N-EVAP-24,Organomation公司)；20通道固相萃取装置(Waters公司)

实施例1猪可食性组织中苯巴比妥残留量检测前处理

具体检测步骤如下：

1)样品提取：

取适量新鲜或解冻的猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪样品，充分绞碎，混匀，作为试料，备用。

分别称取四种试料2g(精确至±0.02g)于50mL聚丙烯塑料离心管，添加苯巴比妥-D5标准工作液10μL。加乙酸乙酯20mL，振荡混匀5min，4℃下5000r/min离心5min，转移上清液至另一离心管中，于45℃氮气吹干。加0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液10mL溶解残渣，正己烷10mL除脂，涡旋振荡2min，4℃下5000r/min离心5min；离心后液体分层，取下层溶液(即去除上层正己烷层)再次加入正己烷10mL，重复上述除脂步骤，获得下层样液，备用。

2)净化

依次用甲醇、水和0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液各5mL活化亲水-亲脂固相萃取柱(Waters Oasis HLB,200mg，6cc)，取备用液过柱，依次用水、2％甲醇溶液、正己烷-乙酸乙酯溶液各5mL淋洗，抽干。取甲醇5mL洗脱，洗脱液于45℃氮气吹干，用10％甲醇溶液1.0mL复溶残余物，4℃下13000r/min离心10min，上清液过0.22μm滤膜，分别获得经过前处理得到的猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪样液，供后续液相色谱-串联质谱仪测定。

实施例2色谱条件的选择

1、流动相的选择

本实施例以实施例1经过前处理获得的猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪样液为检测对象，试验了不同流动相对苯巴比妥药物色谱分离的影响，主要对3种流动相进行了试验(乙腈-水、乙腈-乙酸盐缓冲液、甲醇-水，试剂均为色谱级)。结果表明：甲醇和水梯度洗脱时目标化合物响应值较高，无杂峰，峰形较好，且出峰时间合适，效果更佳，结合综合情况选择甲醇和水作为流动相，最终筛选获得的洗脱程序液相色谱条件如下，色谱图如图1所示。

色谱柱：C18色谱柱(Waters，BEH C18,100mm×2.1mm，1.7μm)或者相当；

流动相：A：水，B：甲醇，梯度洗脱程序见表1，梯度均为线性变化；

流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；

表1梯度洗脱程序

2、质谱条件的选择

本实施例试验了将1μg/mL苯巴比妥标准溶液注入到质谱仪中，在质谱扫描模式下获得各物质的一级和二级质谱图，选择响应值高、干扰小且具有代表性的离子作为定量离子和定性离子，结果与上述研究报道相一致，优化后的质谱参数见下表2：

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；定量检测方式：多反应监测模式(MRM)；气帘气压力：40psi；碰撞气压力：8psi；雾化气压力：45psi；碰撞能量：-15eV；碰撞室出口电压：-10V；离子喷雾电压：-4500V；离子源温度：500℃；定性离子、定量离子和碰撞电压见下表2。

表2定性离子、定量离子和碰撞电压

实施例3样品前处理条件的选择

1、提取溶剂的选择

本实施例试验了不同提取液对苯巴比妥的提取情况，主要对以下7种提取液行选择：甲醇、乙腈、1％氨化甲醇、1％氨化乙腈、1％酸化甲醇、1％酸化乙腈和乙酸乙酯。

具体步骤如下：

1)取适量新鲜或解冻的猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪样品，充分绞碎，混匀，作为试料，备用。分别称取四种试料2g(精确至±0.02g)于50mL聚丙烯塑料离心管，添加苯巴比妥-D5标准工作液10μL，获得四种猪可食性组织待提取试样；

2)分别取30mL上述7种提取液对步骤1)获得的猪可食性组织待提取试样进行提取，将7种提取液分别加入猪可食性组织待提取试样，混匀振荡5min，4℃5000r/min，离心5min，得到上清液氮吹干获得待净化液，进行后续净化。由于实验中用甲醇、1％氨化甲醇、1％酸化甲醇提取时杂质多不宜除去，后续净化困难，未能获得回收率的结果，其他提取剂的药物回收率结果见图2，图2中加标水平为5μg/kg。

以上检测结果表明：乙酸乙酯溶剂对于目标物的提取效果最好，回收率较高，且明显减少其他杂质的干扰。结合综合情况选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

2、净化方式的选择

本实施例对比研究正己烷净化法(本领域常规检测方法，具体步骤参见文献“赵海香,邱月明,汪丽萍,邱静,仲维科,唐英章,王大宁,周志强.气相色谱-质谱同时测定猪肉中3种巴比妥药物残留[J].分析化学,2005(06):777-780.”)、分散基质净化法(EMR方法为本领域常规检测方法，具体步骤参见文献“渠岩,路勇,冯楠,赵俊平,金伟伟,王贵双.基质固相分散-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽肉中残留的13种镇静药物[J].食品科学,2012,33(08):252-255.”)和固相萃取法(本领域常规检测方法，具体步骤参见文献“戴晓欣,朱新平,吴仕辉,尹怡,马丽莎,陈昆慈,郑光明,潘德博.固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中的苯巴比妥[J].食品科学,2012,33(18):232-235.”)。

检测对象为步骤1中乙酸乙酯提取获得的四种待净化液。

由于肌肉、肝脏等组织中基质复杂，传统的液液萃取即正己烷净化法不能满足样品净化要求，杂质仍比较多，溶液浑浊；而分散基质净化法(EMR方法)能较好吸附杂质和色素，得到的溶液透亮，但平均回收率较低；而固相萃取法的平均回收率达到标准，结合正己烷去脂，可以减少脂类对分析结果的干扰，结合综合情况选择对提取液经正己烷去脂，再经固相萃取净化富集。

3、固相萃取柱的选择

固相萃取柱(SPE)可去除基质中的蛋白、脂类和离子，同时浓缩样液体积，提高检测灵敏度。根据苯巴比妥的结构特征，对比了C18、Oasis HLB、Oasis MAX、Oasis MCX等四种规格的固相萃取柱，净化步骤按各柱最优净化的方法进行，结果见表3。

表3不同SPE小柱测试结果(加标水平为5μg/kg)

结果表明：Oasis HLB柱净化富集效果最好。

4、过样溶液pH的选择

本实施例测试了不同pH值对过样液在柱上的保留的影响，进一步研究了磷酸盐缓冲溶液pH为5、6、7、8、9、10时的样液对HLB柱回收率的影响，结果见表4。

表4不同pH的过柱样液对HLB保留苯巴比妥的影响(加标水平为5μg/kg)

结果表明：当复溶液0.2mol/L磷酸盐缓冲液的pH为6时，苯巴比妥在四种基质的回收率最佳。

5、SPE柱淋洗溶液的选择

本实施例比较了不同浓度淋洗液对过样液在柱上的保留的影响，实验发现只采用5mL水淋洗，非极性杂质无法洗脱，接着分别选择浓度为2％、10％的甲醇水溶液5mL进行淋洗，结果表明浓度为2％的甲醇水淋洗液既能充分洗脱杂质也能较好保留住苯巴比妥，但收集的溶液存在一定浑浊现象。接着进一步用正己烷-乙酸乙酯(正己烷与乙酸乙酯的体积比为95：5)5mL淋洗，可洗掉杂质与色素，且平均回收率较高，结果见图3，图3中加标水平为5μg/kg。因此确定SPE柱淋洗方式为：依次用水、2％甲醇溶液、正己烷-乙酸乙酯(95+5，V+V)各5mL淋洗，效果最佳。

6、SPE柱洗脱溶液的选择

本实施例比较了不同溶液的洗脱效果，即甲醇、3％酸化甲醇、3％氨化甲醇和5％氨化甲醇四种溶液对苯巴比妥在HLB柱洗脱效果，结果见图4，图4中加标水平为5μg/kg。

结果表明甲醇溶液对苯巴比妥的洗脱效果最好。

实施例4基质效应影响

本实施例试验了不同基质对目标物测定的影响，称取空白猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪2g，在不添加内标的情况下按照“实施例1猪可食性组织中苯巴比妥残留量检测前处理”分别配制成浓度为10ng/mL的苯巴比妥与苯巴比妥-D5基质混合标准液，基质效应结果见表5。

表5不同基质中苯巴比妥的基质效应

可见，猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪对苯巴比妥的ME为86％～115％，表明基质效应不显著，用溶剂标准曲线或者基质匹配标准曲线定量均可。

实施例5方法的线性方法、相关系数

精密量取适量标准工作液，用10％甲醇溶液稀释配制成苯巴比妥浓度为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、35ng/mL和50ng/mL，苯巴比妥-D5浓度均为10ng/mL的系列工作溶液。对工作液从低浓度到高浓度进行分析，每个浓度重复测定3次，以特征离子质量色谱峰面积平均值Y为纵坐标，标准工作溶液浓度为横坐标X(ng/mL)，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数，结果见表6，该方法线性良好，相关系数(r)均大于0.999。苯巴比妥溶剂标准溶液工作曲线如图5所示。

表6溶剂标准溶液中苯巴比妥的线性关系

实施例6检测限(LOD)和定量限(LOQ)

1、检测限：

分别添加一定浓度的标准溶液于2g空白猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪试样中，制备苯巴比妥添加浓度为0.5μg/kg样品，经提取后测定药物的信噪比S/N＞3(按峰对峰计)，表明实施例2筛选后方法的检测限可至0.5μg/kg。

2、定量限：

添加一定浓度的标准溶液于2g空白基质，制备苯巴比妥添加浓度为1μg/kg样品，经提取后测定药物的信噪比S/N＞10(按峰对峰计)，表明实施例2筛选后方法的定量限可至1μg/kg。

证明实施例1前处理方法和实施例2液相色谱-质谱检测方法确保了肝脏、肾脏和脂肪样品中苯巴比妥的检出限和定量限达到猪肉中苯巴比妥的检出限和定量限。

实施例7方法的准确度、精确度

分别准确称取2.0g空白猪肉、猪肝、猪肾和猪脂肪试样于50mL离心管中，添加苯巴比妥与苯巴比妥-D5(内标)标准溶液，配制目标物定量限、2倍定量限、10倍定量限浓度的试样，即苯巴比妥添加水平为1μg/kg、2μg/kg和10μg/kg，苯巴比妥-D5(内标)添加水平均为5μg/kg，每批次内同一浓度做6次平行实验，重复3批次，按样品前处理过程处理后测定，计算加标回收率。

结果表明：本方法苯巴比妥在1μg/kg～10μg/kg添加浓度的回收率为94.6％～107.1％，批内相对标准偏差≤10％，批间相对标准偏差≤10％。方法的灵敏度、准确度和精密度优于现有方法。

以上实施例证明本发明建立了猪可食性组织中苯巴比妥残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。综合上述实施例，最终确定苯巴比妥试样以Oasis HLB固相萃取柱，乙酸乙酯为提取溶剂，提取液经正己烷去脂，再经固相萃取净化富集，pH为6的过样液，2％甲醇水淋洗液，甲醇洗脱液，在C18色谱柱上，以甲醇和水梯度洗脱为流动相分离，电喷雾负离子模式下多反应监测模式(MRM)定量测定。

本发明建立的方法快速简便，稳定性好，回收率高，同时，添加了内标进行校正计算，保证样品测定的准确度。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的测定方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）样品提取

取猪肉可食性组织2±0.02g，加入200 ng/mL的苯巴比妥-D5 50 µL、乙酸乙酯30 mL，振荡混匀，4℃ 5000 r/min离心5 min，取上清液5℃氮气吹干，获得残渣；

向残渣中加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液10 mL、正己烷10 mL，涡旋振荡后，4℃离心5min，取下层溶液加入正己烷10 mL，再次涡旋振荡后，4℃离心5 min，获得下层样液，备用；

2）样品净化

分别用甲醇、水、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液各5 mL活化亲水-亲酯固相萃取柱；然后取步骤1）获得的下层样液上柱，依次用水、甲醇溶液、正己烷-乙酸乙酯各5mL淋洗，抽干；然后取甲醇溶液5 mL洗脱，洗脱液于45℃氮气吹干，获得残余物；

取残余物加入甲醇溶液1.0 mL复溶，于4℃ 离心10 min，取上清液过0.22 µm滤膜；获得净化后的样品，备用；

所述正己烷-乙酸乙酯是由正己烷与乙酸乙酯按体积比95：5混合后获得；

3）样品检测分析

以液相色谱-串联质谱法测定步骤2）获得的净化后的样品，即实现对猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的测定；

所述以液相色谱-串联质谱法测定步骤2）获得的净化后的样品是指，色谱条件：C18色谱柱，流动相：A：水，B：甲醇，流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：5 µL；质谱条件：负离子扫描，喷雾电压：-4500 V；雾化温度：500℃。

2.根据权利要求1所述猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的测定方法，其特征在于，所述猪肉可食性组织包括猪肌肉、猪肝、猪肾和猪脂肪。

3.根据权利要求2所述猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.0。

4.根据权利要求2所述猪可食性组织中苯巴比妥药物残留量的测定方法，其特征在于，所述甲醇溶液的浓度为2%。