CN114740122B - 一种检测动物性食品中林可霉素的方法 - Google Patents

一种检测动物性食品中林可霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测动物性食品中林可霉素的方法，涉及食品安全检测技术领域，包括以下步骤：取样品，粉碎，加入乙腈涡旋提取，取上清液；向样品残渣中再加入乙腈重复上述操作，取上清液；合并两次上清液，离心，取上清液，即为提取液；氮吹至近干，然后加入超纯水复溶，再加入饱和乙腈的正己烷溶液和C18粉除脂，保留水层；上C18固相萃取小柱过柱，用水淋洗，甲醇洗脱，收集洗脱液；氮吹至干，采用对甲苯磺酰异氰酸酯衍生化处理，用流动相复溶，过0.22μm滤膜，采用高效液相色谱‑紫外检测器进行测定。本发明实现对猪脂肪、鸡脂肪、鸡肌肉、牛肌肉、猪肾、牛肾、羊肾中林可霉素残留的快速、准确的定性和定量分析。

Description

一种检测动物性食品中林可霉素的方法
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其涉及一种检测动物性食品中林可霉素的方法。
背景技术
林可霉素(Lincomycin)又名洁霉素、林肯霉素，是由林可链霉菌产生的林可酰胺类抗生素，分子式为：C18H34N2O6S，分子量为406.54。在常温下为白色结晶性粉末，有微臭或特殊臭，味苦，易溶于水和甲醇，略溶于乙醇。林可霉素属于一种生长期抑菌剂，但在高浓度下，对高度敏感细菌也具有杀菌作用，其抗菌谱较窄，与红霉素、青霉素相似，对革兰氏阳性菌如肺炎链球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌作用较强。林可霉素作用机理是与病原菌的核蛋白体50S亚基结合，通过抑制肽酰基转移酶，而抑制肽链延长，使得细菌蛋白质合成受阻，从而抑制细菌生长。然而正因为林可霉素的应用范围广，效果好，养殖过程中不乏出现一些不恰当地使用情况，导致林可霉素通过食物链最终传给人类。中华人民共和国农业部制定的国标GB31650-2019规定了猪脂肪、鸡脂肪、牛肌肉中林可霉素的最大残留限量为100μg/kg，鸡肌肉中林可霉素的最大残留限量为200μg/kg，猪肾、牛肾、羊肾中林可霉素的最大残留限量为1500μg/kg。因此，建立一种前处理简单、灵敏度高、重现性好的鸡、猪脂肪，鸡、牛肌肉，猪、牛、羊肾中林可霉素的检测方法，以便能够对其进行准确定性和定量，从而保证动物性食品的产品质量。
目前，我国已经指定的林可霉素残留量检测方法的相关标准有(GB29685-2013)《动物性食品中林可霉素残留量的测定-气相色谱-质谱法》、(农业部1163号公告-2-2009)《动物性食品中林可霉素的残留检测-气相色谱法》等，气相色谱-质谱法和高效液相色谱-质谱法虽特异性强，能够对目标化合物进行确证，但仪器价格昂贵、对前处理要求更高。据相关文献报道化学发光免疫分析法(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、胶体金免疫层析法(Colloidal gold immunochromatography，GICA)、酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、分子印迹膜法(Molecularly imprinted membrane，MIMs)也能够对林可霉素进行检测，但只适用大量样本的筛查，不能准确进行定性和定量分析。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种检测动物性食品中林可霉素的方法，通过对7种动物性食品的处理液进行对甲苯磺酰异氰酸酯衍生化处理，进而利用高效液相色谱-紫外检测器能够快速、准确的进行定性和定量分析。
本发明提出的一种检测动物性食品中林可霉素的方法，包括以下步骤：
S1、取样品，粉碎，向其中加入乙腈，涡旋提取、超声、振荡，离心，取上清液；向样品残渣中再加入乙腈重复上述操作，取上清液；合并两次上清液，离心，取上清液，即为提取液；
S2、将提取液用氮吹至近干，然后加入超纯水复溶，再加入饱和乙腈的正己烷溶液和C18粉除脂，保留水层，即为复溶液；
S3、将复溶液上C18固相萃取小柱过柱，用水淋洗，甲醇洗脱，收集洗脱液；
S4、将洗脱液氮吹至干，经对甲苯磺酰异氰酸酯衍生化；用甲醇终止反应后，氮吹至干；
S5、将林可霉素衍生物用流动相复溶，过0.22μm滤膜，采用高效液相色谱-紫外检测器进行测定；
检测条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18柱，250mm×4.6mm、5μm；柱温25℃；流动相A为含0.1vt％甲酸的4.5mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈；等度洗脱，流动相A：流动相B＝40：60；流速1mL/min；进样体积10μL；检测波长为227nm。
优选地，所述动物性食品包括猪脂肪、鸡脂肪、鸡肌肉、牛肌肉、猪肾、牛肾、羊肾中的任意一种。
优选地，S1中，向样品中加入磁珠震荡进行粉碎。
优选地，S2中，在45℃下将洗脱液氮吹至近干。
优选地，S2中，饱和乙腈的正己烷溶液的配制是将乙腈和正己烷按照5：100的体积比充分混匀得到的。
优选地，S2中，猪脂肪、鸡脂肪、牛肌肉、鸡肌肉中，C18粉和饱和乙腈的正己烷溶液的质量体积比mg/mL为100：5；猪肾、牛肾、羊肾中，C18粉和饱和乙腈的正己烷溶液的质量体积比mg/mL为300：5。
在本发明中，C18粉有去除部分杂质和色素的作用。
优选地，S4中，对甲苯磺酰异氰酸酯衍生化处理是将对甲苯磺酰异氰酸酯和样品中含有的林可霉素在无水乙腈溶剂中避光反应，用甲醇终止反应。
有益效果：向本发明样品中加入磁珠能将组织震荡的更碎，使得组织中的林可霉素便于提取出来，然后经乙腈沉淀蛋白并提取，饱和乙腈正己烷和C18粉除脂，C18固相萃取柱净化，对甲苯磺酰异氰酸酯衍生，高效液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量，从而实现对动物性食品脂肪(猪脂肪、鸡脂肪)、肌肉(鸡肌肉、牛肌肉)和肾脏(猪肾、牛肾、羊肾)中的林可霉素残留快速、准确的定性和定量分析。本发明方法简便、快速、灵敏，前处理简单且重现性好，为我国动物性食品中林可霉素残留分析检测提供新思路、新手段和新的科学方法。
附图说明
图1为本发明鸡脂肪中林可霉素图的高效液相色谱图；
图2为本发明猪脂肪中林可霉素图的高效液相色谱图；
图3为本发明鸡肌肉中林可霉素图的高效液相色谱图；
图4为本发明牛肌肉中林可霉素图的高效液相色谱图；
图5为本发明猪肾中林可霉素图的高效液相色谱图；
图6为本发明牛肾中林可霉素图的高效液相色谱图；
图7为本发明羊肾中林可霉素图的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明实施例中所使用试剂及仪器设备的来源为：
(一)试剂
乙腈(色谱级)：赛默飞科技有限公司；甲醇(色谱级)：赛默飞科技有限公司；正己烷(色谱级)：赛默飞科技有限公司；甲酸(色谱级)：赛默飞科技有限公司；十二烷基磺酸钠(分析级)：美国Secoma公司；醋酸铵(色谱级)：麦克林有限公司；C18粉：上海安谱有限公司；C18固相萃取小柱：60mg，上海安谱有限公司；林可霉素标准品CAS编号：154-21-2，纯度98.2％，北京普博欣仪器有限公司。
(二)仪器和设备
高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；高速冷冻离心机：德国Thermo FisherScientific公司；固相萃取装置：24位固相萃取型，美国Supelco公司；氮吹仪：MD200-2型，杭州奥盛仪器有限公司；纯水仪：Academic A10型，美国Millipore公司；高速组织匀浆器：PY790型，汉佳欧斯牌；电子分析天平：感量0.00001g，AUW120D型，日本岛津公司；感量0.001g，BSA224S型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；涡旋混合器：MIX-2500型，上海精胜科学仪器有限公司；有机滤膜：0.22μm，天津津腾实验设备有限公司。
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
1、高效液相色谱-紫外检测器测定条件
色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18柱，250mm×4.6mm、5μm；
柱温：25℃；
流动相：A相为含0.1vt％甲酸的4.5mmol/L醋酸铵水溶液，B相：乙腈；等度洗脱，流动相A：流动相B＝40：60；
流速：1mL/min；
进样体积：10μL。
检测波长：227nm。
2、试剂配制
十二烷基磺酸钠缓冲液：称取2.78g十二烷基磺酸钠，用纯水定容至500mL(0.02mol/L)，并加入1mL乙酸，充分混匀，静置备用；
30vt％对甲苯磺酰异氰酸酯：取300uL对甲苯磺酰异氰酸酯，加入700uL无水乙腈，混匀，现用现配；
饱和乙腈的正己烷溶液：取5mL乙腈，加入100mL正己烷，充分混匀，备用；
含0.1vt％甲酸的4.5mmol/L醋酸铵水溶液：取192.5mg乙酸铵，用水定容至550mL，加0.5mL甲酸。
3、样品前处理
a.对于牛肌肉、鸡肌肉、鸡脂肪、猪脂肪、猪肾、牛肾和羊肾样品，称取5g样品置于聚乙烯离心管中，加入磁珠，加入10mL乙腈溶液涡旋2min，超声10min，4℃下以7000r/min的转速离心10min，4℃，取上清液；向样品残渣中再加入10mL乙腈重复上述操作，取上清液；合并两次上清液，离心，取上清液，即为提取液。
b.对于鸡脂肪、猪脂肪、鸡肌肉、牛肌肉样品的提取液，于氮气下吹约至1mL左右，加入5mL纯水复溶，再加入5mL饱和乙腈的正己烷溶液，加入100mg C18粉，充分涡旋除脂2次，26℃下以13000r/min转速离心10min，弃去正己烷层，保留水层，即为复溶液；
对于牛肾、羊肾、猪肾样品的提取液，于氮气下吹约至1mL左右，加入5mL纯水复溶，加入5mL饱和乙腈正己烷，加入300mg C18粉，充分涡旋除脂3次，26℃下以13000r/min转速离心10min，弃去正己烷层，保留水层，即为复溶液；
c.将复溶液上C18固相萃取柱进行净化，先用3mL甲醇、3mL水和3mL十二烷基磺酸钠缓冲液活化，将复溶液全部过柱，6mL水淋洗，3mL甲醇对其进行洗脱，收集洗脱液；
d.将洗脱液氮吹干，使用100μL30vt％对甲苯磺酰异氰酸酯无水乙腈溶液和100μL无水乙腈与洗脱液中所含有的林可霉素避光反应30min进行衍生，用色谱甲醇终止反应，氮吹至干，然后用流动相复溶，过膜，上机。
4、标准工作液的配制
林可霉素标准工作液：准确称取适量的林可霉素的标准品，用色谱级甲醇定容，配制成1mg/mL的标准工作液，于4℃冰箱内避光保存一周。
5、样品检测
采用外标法检测样品。
分别取空白基质(鸡脂肪、猪脂肪、鸡肌肉、牛肌肉、猪肾、牛肾、羊肾)，向其中加入林可霉素标液，按照样品前处理方法进行处理，其高效液相色谱图如图1-7所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种检测动物性食品中林可霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取样品，粉碎，向其中加入乙腈，并进行以下操作：涡旋提取、超声、振荡、离心，取上清液；向样品残渣中再加入乙腈重复上述操作，取上清液；合并两次上清液，离心，取上清液，即为提取液；
S2、将提取液用氮吹至近干，然后加入超纯水复溶，再加入饱和乙腈的正己烷溶液和C18粉除脂，保留水层，即为复溶液；
S3、将复溶液上C18固相萃取小柱过柱，用水淋洗，甲醇洗脱，收集洗脱液；
S4、将洗脱液氮吹至干，经对甲苯磺酰异氰酸酯衍生化；用甲醇终止反应后，氮吹至干；
S5、将林可霉素衍生物用流动相复溶，过0.22μm滤膜，采用高效液相色谱-紫外检测器进行测定；
检测条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18柱，250mm×4.6mm、5μm；柱温25℃；流动相A为含0.1vt％甲酸的4.5mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈；等度洗脱，流动相A：流动相B＝40：60；流速1mL/min；进样体积10μL；检测波长为227nm；
其中，所述动物性食品包括猪脂肪、鸡脂肪、鸡肌肉、牛肌肉、猪肾、牛肾、羊肾中的任意一种；
S1中，向样品中加入磁珠震荡进行粉碎；
S2中，在45℃下将洗脱液氮吹至近干；
S2中，饱和乙腈的正己烷溶液的配制是将乙腈和正己烷按照5：100的体积比充分混匀得到的；
S2中，猪脂肪、鸡脂肪、牛肌肉、鸡肌肉中，C18粉和饱和乙腈的正己烷溶液的质量体积比mg/mL为100：5；猪肾、牛肾、羊肾中，C18粉和饱和乙腈的正己烷溶液的质量体积比mg/mL为300：5；
S4中，对甲苯磺酰异氰酸酯衍生化处理是将对甲苯磺酰异氰酸酯和样品中含有的林可霉素在无水乙腈溶剂中避光反应，用甲醇终止反应。
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GR01 Patent grant
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