CN113804790B - 一种同时检测添加剂、l-肉碱和d-肉碱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时检测添加剂、L‑肉碱和D‑肉碱的方法，所述方法包括以下步骤：制备标准试剂，并采用高效液相色谱仪按照以下色谱条件进行检测分析，建立回归方程；所述标准试剂包括左卡尼汀标准溶液和L‑肉碱标准溶液；所述色谱条件如下：色谱柱为手性色谱柱；流动相为乙腈‑高氯酸钠溶液，柱温25摄氏度，流速0.5mL/min；样品前处理及检测：称取饲料添加剂样品或预混料，加入超纯水超声提取5‑30min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22µm水相滤膜过滤，上机检测；将检测得到的结果带入回归方程，计算得到添加剂浓度。本发明检测方法L‑肉碱检测分析效率更高，可以做到15min完成整个检测，提高了检测效率。

Description

一种同时检测添加剂、L-肉碱和D-肉碱的方法
技术领域
本发明涉及色谱检测方法，特别是一种高效液相色谱检测方法，能够实现包括L-肉碱和D-肉碱等多种添加剂的同时检测分析，属于光电分析技术领域。
背景技术
左旋肉碱，又称左卡尼汀，是一种促使脂肪转化的类氨基酸，在生物体的脂肪代谢过程中起着重要作用。国内为研究表明，猪饲料中添加左旋肉碱能够提高仔猪抗应激能力，提高育肥猪的胴体品质，提高母猪的繁殖性能；水产饲料中添加左旋肉碱能够提高水生动物的生长性能；肉鸡饲料中添加左旋肉碱能够降低肉鸡腹水的发生率，改善肉鸡出壳时间和受精蛋孵化率。
近年来左旋肉碱越来越多地应用于动物饲料中，对于饲料企业来说，饲料添加剂左旋肉碱含量的精准测定不仅有利于精准营养配方，还能节约生产成本，意义重大。
国内外有关食品中左旋肉碱的检测方法较多，研究样品多数为血浆、乳制品、尿液、食品、保健品、减肥产品等。采用的仪器设备主要有：离子色谱法、分光光度法、液相色谱法以及液相色谱－串联质谱法等，每种方法都有各自的优缺点。
赵淑娟，建立了乳粉中左旋肉碱含量的液相色-谱串联质谱测定法。样品采用20％甲酸水-乙腈提取，通过正交试验优化皂化条件：15％氢氧化钾溶液按5:1在60℃条件下皂化20min。
李秀英、黄嘉乐、邱志超等，在“微波水解/超高效液相色谱-串联质谱法快速测定乳粉中的胆碱和左旋肉碱”，《食品安全质量检测学报》2016，利用微波消解技术对乳粉样品进行水解，释放出结合态的胆碱和左旋肉碱。通过微波技术辅助水解，缩短了样品处理的时间，适用于乳粉中的胆碱和左旋肉碱的检测。
徐敦明,陈燕,张缙等，“Determination of L-Carnitine in Dairy Products byHigh Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem MassSpectrometry”，《分析测试学报》。在该论文公开的方法中，建立了高效液相色谱-串联质谱内标法测定乳品中左旋肉碱含量的方法，样品经0.1mol/L HC1溶解，采用乙腈溶液沉淀蛋白，以HILIC色谱柱分离待测物，采用鞘流电喷雾离子化，正离子多反应监测模式(MRM)检测，内标法定量。
宋周虎、周璐意、胡晓敏人等在“离子对色谱法测定保健食品中左旋肉碱的含量”《今日药学》中，建立了一种离子色谱法检测减肥类保健食品中左旋肉碱含量，采用ODS柱进行分离，以40mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈(95∶5)为流动相，流速：0.8mL/min，检测波长：220nm，定量管进样20μL，该方法简便、快速，可用于含左旋肉碱保健食品的含量检测。
马瑞欣、李同庆、张志华在论文“渔用配合饲料中左旋肉碱含量的测定”，《河北渔业》中，针对饲料检测建立了高效液相色谱-串联质谱法检测渔用饲料中左旋肉碱的含量，该方法采用超纯水对样品进行提取，经亲水作用色谱柱(HILIC)分离后采用三重四级杆进行定量分析。该方法存在基质效应，基质抑制率分别为鳖料19.7％，鲫鱼料17.9％，锦鲤料3.37％。
关于饲料添加剂左旋肉碱的检测方法，目前采用的是农业行业标准NY/T1028-2006《饲料添加剂左旋肉碱》。该含量测定方法以冰乙酸为溶剂，结晶紫为指示剂，高氯酸标准溶液滴定其中的碱性氮来推算。
中国专利CN104914183A公开一种左卡尼汀光学纯度分析方法，所述方法为手性高效液相色谱法测定左卡尼汀光学纯度方法，包括设置色谱分析条件和样品处理步骤：Chirobiotic T柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈–水(调pH6.0)，使用前经0.45μm滤膜滤过并脱气；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：210nm；进样量：5μL；柱温：20℃；色谱柱为Chirobiotic T柱；流动相为乙腈–水(调pH6.0)；柱温为20℃。将左卡尼汀用甲醇溶解，供试液5ul进样，记录色谱图。该方法采用手性高效液相色谱法测定左卡尼汀光学纯度，灵敏度高、重现性较好，且操作较简单，为测定左卡尼汀光学纯度提供了一种有效可靠的分析方法。
中国专利CN104698101A公开一种应用于药物检测领域中的一种左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的高效液相检测方法，该方法采用手性固定相高效液相色谱法,手性固定相选用环糊精及其衍生物键合硅胶填料，使得左卡尼汀、右卡尼汀、左卡尼汀杂质A三种成分的分离效果好、方法重复性及耐用性好；流动相选用三乙胺-醋酸水溶液与乙腈体系，该流动相对手性色谱柱基本无损伤，色谱峰保留时间重复性好，峰型对称。
现有专利检测方法利用手性色谱柱进行检测分析，公开了一些利用手性色谱柱进行左旋肉碱的分离的方法，但是这些方法容易受到影响因素的干扰，主要就在于手性色谱柱本身对于同样具有手性已经亲和性的杂质成分的影响。
同时，现有技术的检测方法通常都只能针对单一的添加剂或肉碱进行检测分析。对于饲料生产企业而言，这些单一检测方法或国标方法，众多左旋肉碱的化验分析方法需要用到衍生化处理，消耗大量的人力或检测试剂、检测仪器进行化验分析，导致企业大量生产饲料的成本居高不在，不利于这些优秀的饲料添加剂的大范围推广应用。如果能够提供一种同时检测多种不同添加剂的方法，则可以很好地降低饲料生产企业，畜禽养殖户的化验成本，进而使得这些技术可以更好地推广应用，达到降低食品生产行业的上游成本，利国利民。
发明内容
本发明的主要目的在于针对现有技术中各种检测方法难以同时兼顾多种不同检测分析对象，特别是对于左旋肉碱需要衍生化处理，消耗大量人力、物力进行化验分析的不足，提供一种能够同时检测多种成分的高效液相色谱法。
为了实现上述发明目的，提供以下技术方案：
一种能够同时检测多种成分的高效液相色谱法，包括以下步骤：
S1、制备标准试剂，并采用高效液相色谱仪按照以下色谱条件进行检测分析，建立回归方程。
所述标准试剂包括L-肉碱标准溶液。
所述色谱条件如下：色谱柱为手性色谱柱；流动相为乙腈-高氯酸钠溶液，柱温25摄氏度，流速0.5mL/min。
S2、样品前处理及检测：称取饲料添加剂样品或预混料，加入超纯水超声提取5-30min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤，上机检测，色谱条件同S1。
S3、将S2检测得到的结果带入S1建立的回归方程，计算得到添加剂浓度。
本发明方法检测分析多种成分，针对多种待测试剂成分的特性，采用高效液相色谱(HPLC)进行活化分离，在利用手性色谱柱的基础上，配合高氯酸盐作为活化试剂实现待测样品中的左旋肉碱分子保持适宜的活性状态，在测试溶液中活性状态更佳，分析检测结果更为可靠。左旋肉碱属于两性离子，当pH为中性时以内酯的形式稳定存在。另外，左旋肉碱容易和金属离子螯合，形成四元环或六元环，螯合金属离子对于左旋肉碱含量测试分析影响极大。本发明应用高氯酸盐作为离子环境调节试剂，在有机相中溶解性较好，分离性更佳，利用高氯酸盐改变左旋肉碱检测过程中溶液离子环境，使得分析结果更加稳定、精确。而且，经过优化检测分析方法，可以将样品快速处理进行上机检测，做到15min内完成检测的效果，具有非常高效的优势。同时，本发明无需进行左旋肉碱的衍生处理，避免左旋肉碱衍生处理过程中对于工艺温度、操作技术的要求，降低了检测分析过程中操作人员技能水平差异所致的检测结果波动变化。
而且，本发明检测方法采用常规的HPLC仪器实现检测目的，无需使用HPLC-MS等成本较高的高端分析设备，按照目前市场上实验室设备配置情况，采用本发明方法具有更大的推广可行性，普及适用范围更广。
进一步，所述L-肉碱标准溶液包括：5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL的标准工作溶液。
优选地，先配制浓度为1000μg/mL的标准储备液，然后稀释得到标准工作溶液。优选地，所述标准储备液放置于4℃冰箱保存。
优选地，所述标准储备液是L-肉碱用甲醇溶解得到的。采用甲醇配置标准储备液具有更好的稳定性，更有利于检测结果的可靠性；同时，标准储备液可以保存使用时间更长，减少标准品过期后重复配置所导致的浪费。
进一步，所述流动相为乙腈和高氯酸钠溶液的混合溶液，两者体积比为15-30：85-70，所述高氯酸钠溶液的浓度为0.2-0.3mol/L。最好是乙腈和高氯酸钠溶液体积比20:80。
优选地，色谱条件为，紫外检测器波长220nm；色谱柱：Chiral CD-Ph S5 4.6mmi.d.×250mm；流动相为：乙腈:0.25mol/L NaClO4溶液(v/v)＝20:80，等度洗脱；流速：0.5mL/min；柱温：25℃；进样量：10μl或20μl。
进一步，S2样品前处理及检测具体为：称取0.05g饲料添加剂样品或者预混料称2.0g，精确到0.0001g；置于100mL容量瓶中，加40-80mL超纯水超声提取12-30min，优选为15min，冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤，上机检测。
进一步，所述手性色谱柱是Chiral CD-Ph S5色谱柱。
进一步，所述能够同时检测多种成分的高效液相色谱法是指能够同时测定饲料添加剂、预混料中L-肉碱和D-肉碱的含量的高效液相色谱法。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明检测方法避免了传统检测分析工艺方法中对于肉碱衍生化处理的工艺，结果使得肉碱检测分析效率更高，可以做到15min完成整个检测，简化了测试过程，提高了检测效率。
2、本发明左旋肉碱检测方法采用手性色谱柱搭配高氯酸盐-乙腈混合流动相，实现对于手性分子的高效分离，具体的可以利用高氯酸钠调节离子环境，使得左旋肉碱在流动相中分离效率更高、分离效果更好。
附图说明：
图1是DL-肉碱样品种L-肉碱和D-肉碱分离效果图。
图2是左旋肉碱的线性范围。
图3是流动相pH值对于L-肉碱和D-肉碱分离效果影响。
图4是流动相中高氯酸钠浓度对于L-肉碱和D-肉碱分离效果影响。
图5是本发明测定左旋肉碱标准品的图谱。
图6是本发明实验过程中空白图谱。
图7是本发明实施例5测试样品的图谱。
图8是本发明实施例6测试样品的图谱。
具体实施方式
下面对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
【实施例1】
本研究采用高效液相色谱，Chiral CD-Ph S5色谱柱对L-肉碱和D-肉碱进行分离，能准确测定饲料添加剂、预混料中L-肉碱和D-肉碱的含量。
1实验部分
1.1仪器、试剂与试验材料
LC-1260 infinityII高效液相色谱-VWD紫外检测器(美国安捷伦公司)；LE204E/02十万分之一天平(梅特勒托利多上海有限公司)；LG-22高速冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司)；KQ-300VDE(昆山超声仪器有限公司)
左卡尼汀(左旋肉毒碱，即左旋肉碱)，99.9％，SIGMA-ALDRICH；乙腈(色谱纯，sigma)；高氯酸钠(分析纯，成都科隆)
L-肉碱标准储备液：称取L-肉碱各100mg，用甲醇溶解后分别定容至100mL棕色容量瓶中，浓度为1000μg/mL的标准储备液，4℃冰箱保存。
L-肉碱标准工作中间液：量取储备液稀释制备成L-肉碱浓度分别为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL的标准溶液工作系列。
1.2样品前处理
称取0.05g饲料添加剂样品(精确到0.0001g)，置于100mL容量瓶中，加2/3体积(约65mL)的超纯水超声提取15min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤，上机检测。
1.3色谱条件
高效液相色谱仪-紫外检测器：波长220nm；色谱柱：Chiral CD-Ph S5(4.6mm i.d.×250mm)；流动相为：乙腈:0.25mol/L NaClO4溶液(v/v)＝20:80，等度洗脱；流速：0.5mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。
2结果与讨论
2.1色谱柱的选择
比较了资生堂C-18 UG120 5μm(4.6mm I.D.×250mm)、资生堂Chiral CD-Ph 5μm(4.6mm i.d.×250mm)和安捷伦Poroshell 120HILIC-Z,(4.6mm i.d.×250mm)，手性色谱柱对碱性化合物的保留和分离与一般的反相系ODS色谱柱不同，Chiral CD-Ph色谱柱是以精密分级的高纯度硅胶为基材，通过苯基氨基甲酸酯化将β-环糊精进行化学键合的光学异构体分离色谱柱，更适合对碱性及中性化合物的分离。资生堂Chiral CD-Ph 5μm(4.6mmi.d.×250mm)对L-肉碱和D-肉碱具有较好的保留和分离，如图1所示，本研究选用ChiralCD-Ph 5μm(4.6mm i.d.×250mm)色谱柱。
2.2流动相的选择
手性色谱柱在酸性条件下才能使样品离子化，流动相中添加适量的盐能增加样品与填料的作用，优化峰型。本发明研究对比了甲酸、辛烷磺酸钠、高氯酸钠对L-肉碱和D-肉碱的分离效果，结果表明高氯酸钠相较于其他盐在有机相中的溶解性最好，能使流动相pH在2.5时对D-肉碱和L-肉碱进行有效的分离。
2.3线性范围、检出限和定量限
2.3.1线性范围
配置与待测样品相同基质的混合标准工作系列，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到浓度曲线y＝0.603245x-0.0368553，如图2所示，D-肉碱和L-肉碱在2-800μg/mL浓度范围内线性关系为：0.99979，表明左旋肉碱在2-800μg/mL范围内线性相关性良好。
【实施例2】
在实施例1实验结果的基础上，选择最佳色谱条件和样品预处理工艺，进行加标回收率及精密度实验。
样品预处理工艺：称取0.05g饲料添加剂样品(精确到0.0001g)，置于100mL容量瓶中，加2/3体积(约65mL)的超纯水超声提取15min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤，上机检测。
色谱条件：
高效液相色谱仪-紫外检测器：波长220nm；色谱柱：Chiral CD-Ph S5(4.6mm i.d.×250mm)；流动相为：乙腈:0.25mol/L NaClO4溶液(v/v)＝20:80，等度洗脱；流速：0.5mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。
2.3.2加标回收率及精密度
在样品基质中加入左旋肉碱标准溶液，按照实施例1中1.2样品前处理的方法进行处理，上机检测其浓度，计算加标回收率，如表1所示加标回收率为98.2～101.1％。
表1加标回收率
项目 鱼虾四号1# 鱼虾四号2# 左旋肉碱
测定值(mg/g) 499.3 485.6 488.8
理论值(mg/g) 500 500 500
加标量(mg/g) 500 500 500
实测值(mg/g) 990.3 990.7 980.1
回收率(％) 98.2 101.1 98.2
精密度试验：在空白样品中添加8μg/mL的标准溶液进行精密度试验，结果如表2所示精密度为：
表2精密度
Figure BDA0003271171790000081
2.3.2检出限和定量限
采用空白样品中添加目标化合物的方法按照实施例1中1.2样品前处理步骤进行处理后上机检测，得出检出限为20mg/kg。
3结论
本研究建立了应用HPLC的方法同时检测饲料添加剂、预混合饲料中L-肉碱和D-肉碱的方法。其中L-肉碱的回收率为98.2-101.1％，线性范围为2-800μg/mL，检出限为20mg/kg，该方法能使L-肉碱和D-肉碱得到有效分离。
【实施例3】
样品前处理方式如下：称取0.05g饲料添加剂样品，置于100mL容量瓶中，加2/3体积的超纯水超声提取15min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤，上机检测。
色谱条件：高效液相色谱仪-紫外检测器：波长220nm；色谱柱：Chiral CD-Ph S5(4.6mm i.d.×250mm)；流动相为：乙腈:0.25mol/L NaClO4溶液(v/v)＝20:80，等度洗脱；流速：0.5mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。
本实施例和实施例2类似，样品前处理方法和色谱条件如上，主要比较不同的pH值对于测试结果的影响。
实验过程中，用盐酸调节流动相pH值，比较不同pH值对于液相色谱图谱的差异，结果如图3所示。在未调节流动相pH值的情况下(图3上)，L-肉碱和D-肉碱的分离度较差，无法完全分离，定量检测分析的精确度不佳。在用盐酸调节pH＝2.5的情况下(图3下)，HPLC分析图谱显示L-肉碱和D-肉碱的分离度较好，实现了良好的分离作用。所以，优选流动相pH＝2-4，更优选地，流动相pH＝2-3，最好是pH＝2.4-2.6。
【实施例4】
本实施例采用的仪器、设备、试剂溶液等和实施例1相同，样品前处理、色谱条件等也相同。差别仅在于高氯酸钠溶液为10mmol/mL、25mmol/mL，比较两种不同浓度的高氯酸钠溶液对于色谱分析结果的影响，结果如图4所示。液相色谱图分析结果显示低高氯酸钠浓度10mmol/mL响应低(图4上)，选择25mmol/mL高氯酸钠溶液的情况下(图4下)，液相色谱分析的分离度更好，峰形更加完美，有利于定量分析样品中L-肉碱含量。所以，优选流动相的NaClO4溶液中高氯酸钠的浓度为10-30mmol/mL，更优选地，流动相的NaClO4溶液中高氯酸钠的浓度为20-30mmol/mL，最好是接近25mmol/mL的浓度范围，如24-26mmol/mL。
【实施例5】
同时检测多种成分的高效液相色谱法，整体测试工艺参数、色谱条件、仪器参数等参考实施例1，以下未说明的工艺参数等同实施例1，有具体的说明的为调整后的工艺参数，按照下文中实际撰写进行操作，具体包括以下步骤：
S1、制备L-肉碱标准溶液，并采用高效液相色谱仪按照以下色谱条件进行检测分析，建立回归方程y＝mx+b，m＝0.617198，b＝-0.34339；y峰面积，x含量[ng/μL]。检测过程中的色谱条件如下：色谱柱为手性色谱柱资生堂Chiral CD-Ph 5μm(4.6mm i.d.×250mm)；流动相为乙腈-高氯酸钠溶液(乙腈:0.25mol/L NaClO4溶液(v/v)＝20:80)等度洗脱，柱温25摄氏度，进样量：20μL，检测波长205nm，流速0.5mL/min。测试得到左旋肉碱测试标准图谱，如图5所示，同时标定测试了该色谱条件下的空白图谱，结果如图6所示。
S2、样品前处理及检测：称取饲料添加剂样品0.05g，加入超纯水超声提取5min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤，上机检测，色谱条件同S1。溶液进行上机测试，测试结果如图7所示，图谱显示检测分离的左旋肉碱峰形完整清晰，峰面积计算准确。
S3、将S2检测得到的结果带入S1建立的回归方程，计算得到添加剂，峰面积S＝13.96208，含量/峰面积＝1.66008，保留时间8.877min，含量23.17811[ng/μL]。
【实施例6】
本实施例和实施例5相同，只是测试样品为预混料，精密称取预混料称2.0g，加入超纯水超声提取30min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤，上机检测，进样量20μL。然后按照实施例5相同的色谱仪器、检测参数进行检测分析。
结果如图8所示，保留时间8.878min，峰面积mAU*S＝13.84785，含量/峰面积1.6604，含量22.99302ng/μL，图中可以看出手性左旋肉碱(保留时间8.878min)和巴豆酰甜菜碱(保留时间9.284min)相互分离度较好，峰形完全分开，不存在相互叠加干扰，能够准确地实现左旋肉碱含量测定。
本申请所引用的各专利、专利申请和出版文的说明全部纳入本申请参考。引用的任何参考文献不应认为是允许这些参考文献可以用来作为本申请的“现有技术”。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种能够同时检测L-肉碱和D-肉碱的高效液相色谱法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备标准试剂，并采用高效液相色谱仪按照以下色谱条件进行检测分析，建立回归方程；
所述标准试剂包括L-肉碱、D-肉碱的标准溶液；
所述色谱条件如下：色谱柱为手性色谱柱；紫外检测器波长220 nm；色谱柱：ChiralCD-Ph S5 4.6 mm i.d.×250 mm；流动相为乙腈-高氯酸钠溶液，乙腈: 0.25mol/L NaClO4溶液=20:80，v/v；等度洗脱；柱温25摄氏度，流速0.5mL/min；进样量：10 μl；
流动相pH=2-4；
S2、样品前处理及检测：称取饲料添加剂样品或预混料，加入超纯水超声提取5-30min，取出冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22 µm水相滤膜过滤，上机检测，色谱条件同S1；
S3、将S2检测得到的结果带入S1建立的回归方程，计算得到L-肉碱和D-肉碱浓度。
2.根据权利要求1所述的能够同时检测L-肉碱和D-肉碱的高效液相色谱法，其特征在于，所述L-肉碱标准溶液包括：5.0、10.0、20.0、50.0、100.0µg/mL的标准工作溶液。
3.根据权利要求1所述的能够同时检测L-肉碱和D-肉碱的高效液相色谱法，其特征在于，先配制浓度为1000µg/mL的标准储备液，然后稀释得到标准工作溶液。
4.根据权利要求3所述的能够同时检测L-肉碱和D-肉碱的高效液相色谱法，其特征在于，所述标准储备液是L-肉碱用甲醇溶解得到的。
5.根据权利要求1所述的能够同时检测L-肉碱和D-肉碱的高效液相色谱法，其特征在于，S2样品前处理及检测具体为：称取0.05g饲料添加剂样品或者预混料称2.0g，精确到0.0001g；置于100 mL容量瓶中，加40-80mL超纯水超声提取12-30min，冷却至室温，用超纯水定容至刻度，经0.22 µm水相滤膜过滤，上机检测。
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