CN115754041B

CN115754041B - 一种洗眼液中护眼物质牛磺酸的检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN115754041B
Application number: CN202211352717.3A
Authority: CN
Inventors: 徐敏; 王青松; 张柳青
Original assignee: Zhuhai Xigu Medical Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Xigu Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-01
Filing date: 2022-11-01
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-11-01
Also published as: CN115754041A

Abstract

本申请涉及一种洗眼液中护眼物质牛磺酸的检测方法及检测试剂盒，所述检测方法及检测试剂盒中，以对甲氧基苄氯作为衍生剂与牛磺酸进行衍生反应，从而检测得到牛磺酸含量。本发明采用对甲氧基苄氯与牛磺酸进行衍生反应具有反应条件温和、反应速率快、反应时间短、节能环保高效的优点。而该检测方法测得的样品回收率为98.2‑100.20%、线性系数R²为1.0000，具有准确度高、线性相关性良好的优点。

Description

一种洗眼液中护眼物质牛磺酸的检测方法及检测试剂盒

技术领域

本申请涉及医疗器械及检测分析领域，具体涉及一种牛磺酸的检测方法及检测试剂盒，尤其涉及一种洗眼液中护眼物质牛磺酸的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

牛磺酸是一种含硫的非蛋白质氨基酸，存在于动物体内，提取后作用于人体可具有一定的治疗功效。如具有消炎抗菌、抗病毒、镇静、镇痛的作用，可作用于人体多个系统。牛磺酸对热稳定，在人和动物胆汁中与胆酸结合，以结合形式存在；而在脑、卵巢、心脏、肝、乳汁、松果体、垂体、视网膜、肾上腺等组织中，以游离形式存在，总量 12-18g，但不参与蛋白质的合成。牛磺酸作为哺乳动物体内的一种重要的必需氨基酸，还对胎儿、婴儿神经系统的发育有重要作用。而且，因其既可体内合成又可体外摄入，与其他化学物质相比，生物安全性高，毒副作用小，可应用于医药、食品添加剂、荧光增白剂、有机合成等领域，也可用作生化试剂、湿润剂、pH 缓冲剂等。尤其将其作为功能成分加入洗眼液中可以起到保护眼睛的作用。

但是，各种加入食品、药品、医疗保健品中的功能性添加剂的剂量与限度均受国家法律法规严格管控，进而产生分析检测需求。目前涉及牛磺酸的检测方法有很多，如高效液相色谱法、氨基酸自动分析法、毛细管电泳法、液相质谱连用法、离子色谱法等。高效液相色谱作为现阶段市场上最普及的检测设备，与其他价格高昂的检测设备相比有不可忽略的优势。此外又因牛磺酸本身不具有紫外吸收，故而检测时需对其进行化学衍生。目前公开披露的衍生剂有邻苯二甲醛（OPA）、2，4-二硝基氟苯（NDFB）、丹磺酰氯（dansyl-cl）、异硫氰酸苯酯（PITC）、6-氨基喹啉基-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）。

邻苯二甲醛( OPA) 与牛磺酸在还原剂如2－巯基乙醇或亚硫酸钠的存在下发生反应，生成取代的异吲哚。该衍生物不仅可用紫外检测，也可用荧光检测，其灵敏度是茚三酮的100 倍。此外，该衍生物还具有电活性，可以通过电化学检测。这些特点使得OPA 是一个应用广泛的衍生化试剂，如今OPA 衍生化法被定为多种标准方法。由于OPA 衍生化反应时间短，反应简单，还可以利用液相色谱的自动进样器进行程序设定，完成样品的柱前在线衍生及测定。不足之处是测定条件要求严格，衍生物不稳定，必须在衍生化后5 min 内测定，该方法需要购置柱后衍生装置，检测成本较高。

2，4－二硝基氟苯(NDFB)也称为Sanger 试剂，在弱碱性条件下，α－氨基酸与2， 4－二硝基氟苯反应生成黄色的2， 4 －二硝基苯氨基酸。反应需避光进行，衍生试剂及衍生产物均性质稳定。但其水解产物2，4 －二硝基苯酚对测定有干扰。且2，4－二硝基氟苯(NDFB)本身为高毒的化学物质对环境保护和人体健康均有负面影响。

丹磺酰氯( dansyl－Cl)是一种荧光试剂，与氨基酸生成的衍生物具有强荧光，可使用荧光检测，也可使用紫外检测( λ = 250 nm) 。衍生反应迅速、灵敏度高，衍生产物稳定。衍生的副产物对测定有干扰，反应一定时间后需要用盐酸甲胺终止反应。

异硫氰酸苯酯( PITC) 与氨基酸的氨基反应，生成苯硫脲衍生物，用紫外检测。反应速度快，产物单一，重现性好。由于试剂具有挥发性，因此需加入过量试剂。反应后剩余的试剂需要真空蒸发装置除去，否则会缩短色谱柱的寿命。该试剂毒性较强，衍生物也不太稳定。

6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC)与牛磺酸迅速反应，生成有强荧光性的脲，过量的试剂水解生成6 －氨基喹啉、N －羟基琥珀酰亚氨和二氧化碳。通过氨基酸专用柱梯度洗脱分离。AQC与氨基酸的反应简单、快速、衍生产物稳定。该法既可用荧光检测( Ex = 250 nm，Em = 395 nm)，也可用紫外检测( λ = 248 nm)。但该种化学试剂为美国waters公司1993年合成发明，1994年商业化与专利化价格昂贵，不利于商业化推广。

基于此，有必要开发一种用于牛磺酸检测的新的衍生剂。

发明内容

基于上述衍生剂的优缺点，本发明的目的在于提供一种洗眼液中护眼物质牛磺酸的检测方法及检测试剂盒，尤其是一种采用新型衍生剂对甲氧基苄氯（PMB）与牛磺酸在室温下衍生化后，由高效液相色谱仪进行检测分离的方法。

为了解决上述技术问题，本申请提供下述技术方案。

在第一方面中，本申请提供了一种对甲氧基苄氯作为衍生剂在制备牛磺酸检测用衍生试剂或在牛磺酸检测方法中的应用。

在第二方面中，本申请提供了一种牛磺酸检测用衍生试剂，包括衍生剂对甲氧基苄氯和pH调节剂。

作为优选方案，所述pH调节剂选自无机碱和有机碱，创造碱性环境即可。例如pH调节剂可选自碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺等。所述pH调节剂的用量为将衍生化反应溶液的pH调至碱性的量，更优选调至pH值为10～12。

在第三方面中，本申请提供了一种牛磺酸检测试剂盒，包括前述的牛磺酸检测用衍生试剂，以及牛磺酸对照液、空白溶液。

作为优选方案，所述空白溶液为纯化水。

作为优选方案，所述牛磺酸对照液的浓度为0.1～2 mg/ml，其配制方法为：称取牛磺酸对照品，加空白溶液稀释，即得。

在第四方面中，本申请提供了一种牛磺酸的检测方法，包括以下步骤：

A、柱前衍生化处理：将空白溶液、牛磺酸对照液及待测样品溶液分别加入前述的牛磺酸检测用衍生试剂后，进行衍生化处理；

B、将步骤A处理后得到的溶液直接进样，进行HPLC检测。

作为优选方案，步骤A中，所述牛磺酸对照液或待测样品溶液与牛磺酸检测用衍生试剂形成的衍生溶液中，对甲氧基苄氯与牛磺酸的浓度比值大于1.5；

步骤A中混匀所得溶液的pH值调至碱性，更优选pH值调至10～12；

所述衍生化处理的条件为：室温～40℃下混合10～40min。

作为优选方案，步骤B中，进行HPLC检测中，采用的色谱柱为C18柱；进行梯度洗脱采用的流动相为磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合相，流速为0.8～1.2 ml/min，柱温为25～35℃，运行时间15～25min，进样量为5～20μl；

进行HPLC检测中，采用的检测器为紫外检测器，紫外波长为200～230nm。

作为优选方案，所述流动相中，磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合体积比为65:35～85:15，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为1.36g/L。

作为优选方案，步骤B中，所述检测结果通过以下公式计算后，得到待测样品溶液中牛磺酸的含量：

牛磺酸含量 =；

式中，牛磺酸含量单位为mg/ml；

Aspl：待测样品溶液中牛磺酸的峰面积；

F：牛磺酸对照液的平均响应因子。

与现有技术相比，本发明的积极效果在于：

1）本发明提供了一种新型衍生剂——对甲氧基苄氯，通过其对待测样品中的牛磺酸进行柱前衍生化处理后，可进行牛磺酸含量检测。且采用对甲氧基苄氯与牛磺酸进行衍生反应时，在低于40℃温度尤其是室温的条件下、衍生时间为10min时即可以完全反应，具有反应条件温和、反应速率快、节能环保高效的优点。

2）本发明的检测方法测得的样品回收率为98.2-100.20%、线性系数R²为1.0000，具有准确度高、线性相关性良好的优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1显示根据实施例1方法得到的牛磺酸线性方程；

图2显示根据实施例1方法测定空白溶液的高效液相色谱图；

图3显示根据实施例1方法测定对照溶液（即牛磺酸对照液1）的高效液相色谱图；

图4显示根据实施例1方法测定供试品溶液的高效液相色谱图。

在图2-4中，横坐标为保留时间，单位为分钟，纵坐标为响应，单位为mAU。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质（如分子量，熔体指数等）是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100， 101, 102等，以及所有的子范围，例如100到166,155到170,198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数（例如1.1， 1.5等）的范围，则适当地将1个单位看作0.0001， 0.001， 0.01或者0.1。对于包含小于10（例如1到5）的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。还应指出，本文中的术语“第一”、“第二”等不限定先后顺序，只是为了区分不同结构的物质。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然（例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体）。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，除了对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

以下实施例提供了一种新的衍生剂——对甲氧基苄氯（alpha-Chloro-4-methoxytoluene， PMB）。通过其对待测样品中的牛磺酸进行柱前衍生化处理后，可进行牛磺酸含量检测。反应原理如下：

。

基于上述的衍生剂——对甲氧基苄氯，可制备得到含有该衍生剂的衍生试剂，并用于高效色谱色谱法（HPLC）检测牛磺酸的含量。

在一种具体实施方式中，所述的衍生试剂还包括pH调节剂，用于调节待测样品溶液的pH值。所述pH调节剂的种类可选自无机碱（例如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾等），也可选自无机碱（例如三乙胺等），只需创造碱性环境即可。在一具体实施方式中，采用的pH调节剂为碳酸钠溶液，调节的pH值为10～12。例如，调节至pH值为10、10.5、11、11.5、12或者它们中任意两个数值之间的范围和子范围。

在一种具体实施方式中，所述牛磺酸对照液或待测样品溶液与牛磺酸检测用衍生试剂形成的衍生溶液中，对甲氧基苄氯与牛磺酸的浓度比值大于1.5。在该浓度比值下，衍生化反应完全。

基于上述的衍生试剂，可进一步可制备得到含有其的检测试剂盒，用于高效色谱色谱法（HPLC）检测牛磺酸的含量。

在一具体实施方式中，所述的检测试剂盒还包括牛磺酸对照液、空白溶液。所述空白溶液为纯化水；所述牛磺酸对照液的浓度为0.1～2 mg/ml，其配制方法为：称取牛磺酸对照品，加空白溶液稀释，即得。

在一具体实施方式中，提供了一种基于高效液相色谱法（HPLC）检测洗眼液中护眼物质牛磺酸含量的方法。在一种实施方式中，本文采用的高效液相色谱法检测方法的色谱条件如下：色谱柱采用C18色谱柱；流动相由磷酸二氢钾溶液与乙腈组成；检测器采用紫外检测器。

在一具体实施方式中，还提供一种通过高效液相色谱法检测洗眼液中牛磺酸含量的方法，所述方法可包括以下步骤：

A、柱前衍生化处理：将空白溶液、牛磺酸对照液及待测样品溶液分别加入牛磺酸检测用衍生试剂后，进行衍生化处理；

B、将步骤A处理后得到的溶液直接进样，进行HPLC检测。

在一种具体实施方式中，流动相可采用磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合相，所述磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合体积比为65:35～85:15，磷酸二氢钾溶液的浓度为1.36g/L。换句话说，流动相A磷酸二氢钾溶液可占流动相总体积的65-85%，而流动相B乙腈可占流动相总体积的15-35%。

在一种具体实施方式中，色谱条件如下所述。流动相流速为0.8～1.2mL/min，例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min或者它们中任意两个数值之间的范围或者子范围。色谱柱的柱温为20～30℃，例如可为20℃、25℃、30℃或者它们中任意两个数值之间的范围或子范围。色谱仪运行时间为10-15 min。紫外检测器的检测波长为200～230nm。待测样品的进样体积为5～20μl。

实施例

下面将结合本申请的实施例，对本申请的技术方案进行清楚和完整的描述。如无特别说明，所用的试剂和原材料都可通过商业途径购买。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

本实施例提供了一种采用高效色谱色谱法检测牛磺酸的方法，具体包括以下步骤：

1、柱前衍生化处理

1.1准备以下溶液

空白溶液（稀释剂）：纯化水（自制，无特殊要求，符合中国药典相关标准即可）

牛磺酸对照液：精密称取20 mg牛磺酸对照品，置于20 ml量瓶中，加适量稀释剂（纯化水）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得牛磺酸对照液1（浓度为 1.0046mg/ml）、牛磺酸对照液2（浓度为1.0052 mg/ml）。

供试品溶液（即待测样品溶液）：牛磺酸浓度为1.0mg/ml的洗眼液，4个平行样。

1%碳酸钠溶液：取碳酸钠1g，加纯化水100mL使其溶解，即得。

1mg/ml对甲氧基苄氯溶液：取对甲氧基苄氯（化学纯，CR）100mg，加纯化水100mL使其溶解，即得。

1.2 各取上述空白溶液、牛磺酸对照液、供试品溶液0.1mL置于进样小瓶中，然后各加入1%碳酸钠溶液0.5ml，加入1mg/ml 对甲氧基苄氯（PMB）0.5ml，室温下混合10min。

2、上样检测

将步骤1衍生化处理的各样品上样至高效液相色谱仪中，采用C18色谱柱，以磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合相作为流动相，进行梯度洗脱，并利用紫外检测器检测牛磺酸含量。

具体色谱条件如下：

色谱柱：YMC Pack ODS-AQ 4.6*150mm 5μm或其他相当的色谱柱；

流动相A：磷酸二氢钾溶液

流动相B：乙腈（HPLC级）

流动相A:流动相B = 85：15（体积比）

柱温：30 ℃；进样量：10 μl；流速：1.0 ml/min；采集时间：20 min；

紫外检测器的检测波长：210 nm。

其中，磷酸二氢钾溶液的配制为：取磷酸二氢钾（AR级）1.36g，加水1L使溶解，摇匀过滤，等比例放大。所得磷酸二氢钾溶液的浓度为1.36g/L。

具体采用的进样程序为：待系统稳定后，进2针空白溶液（必要时可进多针），5针牛磺酸对照液1，2针牛磺酸对照液2，待测样品溶液各1针，每个验证项目结束和整个序列结束后进1针牛磺酸对照液1。

系统适用性要求为：连续进样5针牛磺酸对照液1中牛磺酸峰的峰面积RSD≤2.0%；2针牛磺酸对照液中，牛磺酸的相对响应因子（/）应在0.980～1.020之间；6针或6针以上牛磺酸对照液1中牛磺酸峰的相对响应（A_质控针/A）应在0.980～1.020之间。

其中，响应因子：峰面积/浓度；

浓度的计算公式为：

浓度（mg/ml）=MP/V

M：为牛磺酸对照品称重，mg；

P：为牛磺酸对照品含量；

V：为牛磺酸对照液的稀释体积，ml；

：5针对照品溶液1中牛磺酸峰的平均响应因子；

：2针对照品溶液2中牛磺酸峰的平均响应因子；

A_质控针：质控针对照品溶液1中牛磺酸峰的峰面积；

A：5针对照品溶液1的中牛磺酸峰平均峰面积。

供试品溶液中牛磺酸的含量采用以下公式计算：

牛磺酸含量 = ；

式中，牛磺酸含量单位为mg/ml；

Aspl：供试品溶液中牛磺酸的峰面积；

F：牛磺酸对照液的平均响应因子（），ml/mg。

空白溶液、对照溶液（牛磺酸对照液1）及供试品溶液1的高效液相色谱图如图2-图4所示。

供试品溶液的测试结果如表1所示。

表1 供试品溶液的测试结果

3、准确度试验

对本发明方法的准确度进行考察，具体采用的准确度溶液及其回收率结果如表2所示。其中，准确度溶液的配制具体为：精密称取25.17mg、50.23mg、1.4978mg牛磺酸对照品，置于50 ml量瓶中，加适量稀释剂（纯化水）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得50%、100%、150%的标准度溶液。

表2 准确度溶液及其回收率结果

由表2的结果可见，本发明方法的样品回收率为98.92-100.20%，说明本发明方法的准确度高。

4、线性

对本发明方法的线性方程进行拟合，配制的溶液浓度（采用牛磺酸对照品配制，配制方法与步骤3中准确度溶液配制方法相同）及峰面积如表3所示。所得牛磺酸线性方程如图1所示。

表3 配制的溶液浓度及峰面积

由图1可见，本发明所得线性方程为：y=2759.1724x-4.6665，R²=1.0000，其中x表示色谱图中牛磺酸特征峰的积分峰面积，y表示牛磺酸的浓度（单位为mg/mL），R²表示相关系数。因此，本实施例所述的高效液相色谱法检测浓度在0.2～1.5 mg/ml范围内的牛磺酸具有良好的线性相关性。

实施例2

本实施例考察了柱前衍生化处理中，加入碳酸钠溶液调节反应体系酸碱度对检测结果的影响。具体步骤与实施例1基本相同，衍生化处理的具体条件为：

条件一：不调整pH。取0.1mL牛磺酸对照液（浓度为1 mg/ml）置于进样小瓶中，然后加入0.5ml 纯化水和 0.5ml对甲氧基苄氯（浓度为1mg/ml），室温下混合10min。

条件二：调整pH为碱性。取0.1mL牛磺酸对照液（浓度为1 mg/ml）置于进样小瓶中，然后加入0.5ml 碳酸钠溶液（1%）和 0.5ml对甲氧基苄氯（浓度为1mg/ml），室温下混合10min。

将上述条件处理后的溶液上样检测，所得峰面积如表4所示。

表4 反应体系和峰面积

由表4的结果可见，酸性条件下，牛磺酸的氨基会被质子化，影响其与衍生剂的亲核反应，进而影响反应速率和反应程度；相对而言，碱性条件下，反应速率明显加快且反应程度更充分。

实施例3

本实施例考察了柱前衍生化处理中，衍生时间对检测结果的影响。具体步骤与实施例1基本相同，衍生化处理的具体条件为：

取0.1mL牛磺酸对照液（浓度为1 mg/ml）置于进样小瓶中，然后加入0.5ml 碳酸钠溶液（1%）和 0.5ml对甲氧基苄氯（浓度为1mg/ml），室温下混合10-40min。

将上述条件处理后的溶液上样检测，采用不同衍生时间（前述的混合时间）所得峰面积如表5所示。

表5 衍生时间和峰面积

由表5的结果可见，衍生时间为10min时反应完全，反应速率快，反应时间短，反应条件温和，节能环保高效。

实施例4

本实施例考察了柱前衍生化处理中，衍生温度对检测结果的影响。具体步骤与实施例3基本相同，衍生化处理的具体条件为：

取0.1mL牛磺酸对照液（浓度为1 mg/ml）置于进样小瓶中，然后加入0.5ml 碳酸钠溶液（1%）和 0.5ml对甲氧基苄氯（浓度为1mg/ml），40℃下混合10 min。

将上述条件处理后的溶液上样检测，所得峰面积如表6所示。

表6 衍生温度和峰面积

由和表5中衍生时间为10 min的峰面积结果与表6的峰面积结果对比可见，本发明采用衍生化的反应温度为室温和40℃下时，得到的牛磺酸峰面积结果基本相同。且本发明的衍生化反应在室温下即可以完全反应，反应条件温和。

上述对实施例的描述是为了便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本申请。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其它实施例中而不必付出创造性的劳动。因此，本申请不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本申请披露的内容，在不脱离本申请范围和精神的情况下做出的改进和修改都本申请的范围之内。

Claims

1.一种牛磺酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

B、将步骤A处理后得到的溶液直接进样，进行HPLC检测；

步骤A中，所述牛磺酸检测用衍生试剂包括衍生剂对甲氧基苄氯和pH调节剂；

加入牛磺酸检测用衍生试剂后所得溶液的pH值调至碱性；

所述衍生化处理的条件为：室温～40℃下混合10～40min；

步骤B中，进行HPLC检测中，采用的色谱柱为C18柱；进行等度洗脱采用的流动相为磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合相，磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合体积比为85:15。

2.根据权利要求1所述的牛磺酸的检测方法，其特征在于，步骤A中，所述pH调节剂选自有机碱和无机碱。

3. 根据权利要求1所述的牛磺酸的检测方法，其特征在于，步骤A中，所述牛磺酸对照液的浓度为0.1～2 mg/ml，其配制方法为：称取牛磺酸对照品，加空白溶液稀释，即得。

4.根据权利要求1所述的牛磺酸的检测方法，其特征在于，步骤A中，所述牛磺酸对照液或待测样品溶液与牛磺酸检测用衍生试剂形成的衍生溶液中，对甲氧基苄氯与牛磺酸的浓度比值大于1.5。

5. 根据权利要求1所述的牛磺酸的检测方法，其特征在于，步骤B中，进行HPLC检测中，进行等度洗脱采用的流速为0.8～1.2 ml/min，柱温为25～35℃，运行时间15～25min，进样量为5～20μl；

6.根据权利要求1所述的牛磺酸的检测方法，其特征在于，所述流动相中，磷酸二氢钾溶液的浓度为1.36g/L。

7.根据权利要求1所述的牛磺酸的检测方法，其特征在于，步骤B中，HPLC检测结果通过以下公式计算后，得到待测样品溶液中牛磺酸的含量：

牛磺酸含量 = ；

式中，牛磺酸含量单位为mg/ml；

Aspl：待测样品溶液中牛磺酸的峰面积；

F：牛磺酸对照液的平均响应因子。