CN106404932B - 一种动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学技术领域，公开了一种动物源性食品中β‑受体激动剂残留量的检测方法，本发明以GB/T 22286‑2008检测方法为基础，针对其对样品提取处理需要较长的酶解步骤的缺陷，提出了一种无需酶解的新的样品处理步骤，从检测时间和成本上得到了显著改善，同时具备较高的准确度、灵敏度和精密度，适合大批量样品的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体的说是涉及一种动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测方法。
背景技术
β-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，代表性化合物为沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗(瘦肉精)、溴代克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗，早期主要用于防治人、动物支气管哮喘和支气管痉挛，后来发现在饲料中添加该类药物具有营养再分配作用，可明显提高动物的瘦肉率，因此曾被作为促生长添加剂被广泛关注。但是，人们食用了该类药物残留的畜禽产品会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应，严重的可危及生命。因此，美国、欧盟都先后立法禁止在养殖业中使用该类药物，我国政府也明令禁止其使用。
动物源性食品中β-受体激动剂残留量的测定，通常使用的国家标准为GB/T22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》，该检测方法适用于猪肝和猪肉中上述提及的β-受体激动剂残留量的检测，检测原理是试样中的残留物经酶解，用高氯酸调节pH值，沉淀蛋白后离心，上清液用异丙醇-乙酸乙酯提取，再用阳离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。但是该国标中的检测方法酶解一步需要用到β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，该酶成本较高且水浴水解处理时间长达12h，在检测效率和成本上该方法有所欠缺，不适合大批量样品的检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测方法，使得所述方法不需要酶解步骤，缩短处理时间，检测成本低，适合大批量样品的检测。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测方法，包括：
步骤1、准确称取β-受体激动剂混合标准工作液梯度浓度溶液，然后液相色谱串联质谱法检测，获得标准曲线；
步骤2、准确称取5.00g待测样品，于50ml离心管中，加入100ng/mL同位素内标工作液100uL，再加入0.1mol/L盐酸溶液20.0mL，再加入沸水浴中煮沸30min，超声提取10分钟，用10mol/L NaOH溶液调pH至9.5±0.1，离心取上清液，加入乙酸乙酯10mL提取，涡旋2min，离心取有机相与另一离心管中，再加入乙酸乙酯10mL提取，涡旋2min，离心取有机相合并，氮气吹干，加入2％甲酸水溶液5mL，涡旋5min，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混合2分钟，离心，弃去正己烷层，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混合，离心，弃去正己烷层，获得处理后的待测样品；
步骤2、处理后的待测样品进行阳离子交换柱净化，然后液相色谱串联质谱法检测定性，内标法定量。
针对现有GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》中检测时间过长的缺陷，本发明提供了新的样品处理方法，无需采用酶解，显著地缩短了检测时间。
作为优选，步骤2所述阳离子交换柱净化具体为：
阳离子交换柱使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化，取处理后的待测样品全部过柱，再依次用3mL水、3mL 2％甲酸水溶液和3mL甲醇淋洗，抽干，最后用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱，流速控制在0.5mL/min，洗脱液在40℃用氮气吹干，残余物用0.5mL 2％甲酸/水-甲醇溶液溶解，超声混匀，15000r/min高速离心10min，取上清液用于液相色谱串联质谱法检测。
其中，所述阳离子交换柱优选为MCX柱，更优选地，所述MCX柱为MCX小柱，购自Water公司阳离子交换柱，规格60mg/3mL。
在本发明液相色谱串联质谱法中，各参数设置可参照GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》中的记载，例如：
a)色谱柱:Waters ATLANTICS C18柱，内径150mm×2.1mm，粒度5μm；
b)流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；梯度淋洗；
c)流速：0.2mL/min；
d)柱温：30℃；
e)进样量：20μL；
f)离子源：电喷雾(ESI)，正离子模式；
g)扫描方式：多反应检测(MRM)；
h)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适的高纯气体；
i)毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度；
其中梯度淋洗程序见表1，被测物的母离子和离子参数见表2；
表1梯度淋洗表
| 时间/min | A/％ | B/％ |
| 0 | 96 | 4 |
| 2 | 96 | 4 |
| 8 | 20 | 80 |
| 21 | 77 | 23 |
| 22 | 5 | 95 |
| 25 | 5 | 95 |
| 25.5 | 96 | 4 |
表2被测物的母离子和离子参数
此外，本发明所述检测方法关于液相色谱-串联质谱确证、空白试验以及计算公式均可参照GB/T 22286-2008中的记载，例如：
按照上述液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，如杲检出的质量色谱峰保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样晶谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，误差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的被测物。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差
空白试验中除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
按以下公式计箅样品中沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗或溴代克仑特罗残留量。计箅结果需扣除空白值。沙丁胺醇-D3作为沙丁胺醇、特布他林和莱克多巴胺的内标物质，克仑特罗-D9作为其余β-受体激动剂的内标物质。
式中:
X—样品中被测物残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c—沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗或溴代克仑特罗标准工作溶液的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
csi—标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
ci—样液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
As—沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗或溴代克仑特罗标准工作溶液的峰面积；
A—样液中沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗或溴代克仑特罗的峰面积；
Asi—标准工作溶液中内标物的峰面积；
Ai—样液中内标物的峰面积；
V—样品定容体积，单位为毫升(mL)；
m—样品称样量，单位为克(g)；
计箅结果小于检出限0.5μg/kg时，视为未检出。
作为优选，本发明所述β-受体激动剂混合标准工作液为浓度均为1μg/mL的沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴代克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗混合溶液。
作为优选，步骤1所述β-受体激动剂混合标准工作液梯度浓度溶液由如下方法配制：
取浓度均为1μg/mL的β-受体激动剂混合标准工作液，稀释成100ng/mL混合标准工作液，分别取0μL，12.5μL，25μL，50μL，100μL，250μL用2％甲酸/水-甲醇溶液溶解定容至0.5mL。
作为优选所述同位素内标工作液为浓度均为10ng/mL的沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9混合溶液。
作为优选，所述β-受体激动剂为沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴代克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗中的一种或两种以上。其中，克仑特罗也指代盐酸克仑特罗。
作为优选，所述动物源性食品为猪肉或猪肝。
本发明以盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇为对象，从线性范围、检出限和定量限、准确性和回收率、精密度等方面评价本发明所述检测方法，结果显示，各方面的结果均符合国标要求，线性范围良好，具备较高的准确度、灵敏度和精密度。同时，以相同猪肉样品，分别采用本发明检测方法和GB/T 22286-2008方法检测，两者检测结果一致，但本发明显著减少了检测时间，效率更高。
由以上技术方案可知，本发明以GB/T 22286-2008检测方法为基础，针对其对样品提取处理需要较长的酶解步骤的缺陷，提出了一种无需酶解的新的样品处理步骤，从检测时间和成本上得到了显著改善，同时具备较高的准确度、灵敏度和精密度，适合大批量样品的检测。
附图说明
图1所示为盐酸克仑特罗工作曲线；
图2所示为莱克多巴胺工作曲线；
图3所示为沙丁胺醇工作曲线。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述检测方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的检测方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测方法做进一步说明。
实施例1：本发明所述检测方法
取浓度均为1μg/mL的β-受体激动剂混合标准工作液，稀释成100ng/mL混合标准工作液，分别取0μL，12.5μL，25μL，50μL，100μL，250μL用2％甲酸/水-甲醇溶液溶解定容至0.5mL。然后液相色谱串联质谱法检测，获得标准曲线；
准确称取5.00g待测样品于50ml离心管中，加入100ng/mL同位素内标工作液100uL，再加入0.1mol/L盐酸溶液20.0mL，再加入沸水浴中煮沸30min，超声提取10分钟，用10mol/L NaOH溶液调pH至9.5±0.1，离心取上清液，加入乙酸乙酯10mL提取，涡旋2min，离心取有机相与另一离心管中，再加入乙酸乙酯10mL提取，涡旋2min，离心取有机相合并，氮气吹干，加入2％甲酸水溶液5mL，涡旋5min，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混合2分钟，离心，弃去正己烷层，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混合，离心，弃去正己烷层，获得处理后的待测样品；
处理后待测样品进行MCX柱净化，MCX柱使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化，取处理后待测样品全部过柱，再依次用3mL水、3mL 2％甲酸水溶液和3mL甲醇淋洗，抽干，最后用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱，流速控制在0.5mL/min，洗脱液在40℃用氮气吹干，残余物用0.5mL 2％甲酸/水-甲醇溶液溶解，超声混匀，15000r/min高速离心10min，取上清液用于液相色谱串联质谱法检测定性，内标法定量。
所述同位素内标工作液为浓度均为10ng/mL的沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9混合溶液。沙丁胺醇-D3作为沙丁胺醇、特布他林和莱克多巴胺的内标物质，克仑特罗-D9作为其余β-受体激动剂的内标物质。
其他测定要求和规定参照发明内容部分或GB/T 22286-2008相关记载。
实施例2：线性与工作曲线范围
分别制备盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL梯度浓度标准工作液进行检测，制备工作曲线，结果见图1-3，表4-5。
表4盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇浓度的峰面积
表5盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇线性关系
| 物质名称 | 斜率 | 截距 | 线性拟合相关系数 |
| 盐酸克仑特罗 | 1.523593 | 0.042159 | 0.9991 |
| 莱克多巴胺 | 1.364837 | 0.11713 | 0.9984 |
| 沙丁胺醇 | 0.878222 | 0.003971 | 0.9989 |
由上述各结果可知，线性拟合相关系数均高于0.990，曲线符合要求，适用浓度范围0.25-5μg/kg。
实施例3：检出限和定量限
分别制备盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇2.5ng/mL，重复测定至少6次，收集每次的信噪比，统计检出限和定量限，结果见表6。
表6检出限和定量限
由上表可知，本发明检出限远低于报告检出限，不仅符合要求，而且灵敏度更高。
实施例4：准确性与回收率试验
分别制备盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇0.25μg/kg、0.5μg/kg、5.0μg/kg三个浓度点加标测试，待测样品为猪肉，每个浓度点重复测3次，结果见表7-9，各表结果说明，本发明检测方法准确度较好。
表7盐酸克仑特罗回收率试验
表8莱克多巴胺回收率试验
表9沙丁胺醇回收率试验
注：回收率＝(测量值-本底值)/加标量×100％
实施例5：精密度试验
分别制备盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇0.25ng/mL三个标准工作液，重复测定7次，结果见表10。
表10精密度试验(表中数据为峰面积)
| 项目名称 | 盐酸克仑特罗 | 莱克多巴胺 | 沙丁胺醇 |
| 浓度(ng/mL) | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 1 | 43777.6804 | 3443.2284 | 2200.1838 |
| 2 | 42910.4044 | 3858.9456 | 2326.1125 |
| 3 | 41838.2995 | 3597.1483 | 2105.1140 |
| 4 | 42121.4705 | 3530.6675 | 2183.8607 |
| 5 | 41091.2370 | 3464.8996 | 1976.6298 |
| 6 | 41582.7626 | 3613.3266 | 2220.4414 |
| 7 | 41349.3925 | 3513.5578 | 2210.0368 |
| Avg | 42095.8924 | 3574.5391 | 2174.6256 |
| RSD(％) | 2.3 | 3.9 | 5.0 |
由上表可知，本发明检测方法的相对标准偏差小于10％，符合规定要求，具有较高的精密度。
实施例6：样品测定
采用本发明检测方法和GB/T 22286-2008检测方法对相同猪肉样品进行检测，测定其中盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的残留，结果见表11。
表11样品测定结果
由上表可知，本发明方法与国标中的方法检测结果一致，但是本发明方法相比国标方法节省了10h以上，检测效率和成本上的效果得到很大提高。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。
Claims (10)
1.一种动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测方法，其特征在于，包括：
步骤1、准确称取β-受体激动剂混合标准工作液梯度浓度溶液，然后液相色谱串联质谱法检测，获得标准曲线；
步骤2、准确称取5.00g待测样品，于50ml离心管中，加入100ng/mL同位素内标工作液100uL，再加入0.1mol/L盐酸溶液20.0mL，再加入沸水浴中煮沸30min，超声提取10分钟，用10mol/L NaOH溶液调pH至9.5±0.1，离心取上清液，加入乙酸乙酯10mL提取，涡旋2min，离心取有机相于 另一离心管中，再加入乙酸乙酯10mL提取，涡旋2min，离心取有机相合并，氮气吹干，加入2％甲酸水溶液5mL，涡旋5min，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混合2分钟，离心，弃去正己烷层，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混合，离心，弃去正己烷层，获得处理后的待测样品；
步骤2、处理后的待测样品进行阳离子交换柱净化，然后液相色谱串联质谱法检测定性，内标法定量。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述阳离子交换柱净化具体为：
阳离子交换柱使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化，取处理后的待测样品全部过柱，再依次用3mL水、3mL 2％甲酸水溶液和3mL甲醇淋洗，抽干，最后用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱，流速控制在0.5mL/min，洗脱液在40℃用氮气吹干，残余物用0.5mL 2％甲酸/水-甲醇溶液溶解，超声混匀，15000r/min高速离心10min，取上清液用于液相色谱串联质谱法检测。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述阳离子交换柱为MCX柱。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述MCX柱为MCX小柱，购自Water公司阳离子交换柱，规格60mg/3mL。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱法的参数条件如下：
a)色谱柱:Waters ATLANTICS C18柱，内径150mm×2.1mm，粒度5μm；
b)流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；梯度淋洗；
c)流速：0.2mL/min；
d)柱温：30℃；
e)进样量：20μL；
f)离子源：电喷雾(ESI)，正离子模式；
g)扫描方式：多反应检测(MRM)；
h)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述β-受体激动剂混合标准工作液为浓度均为1μg/mL的沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴代克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗混合溶液。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述β-受体激动剂混合标准工作液梯度浓度溶液由如下方法配制：
取浓度均为1μg/mL的β-受体激动剂混合标准工作液，稀释成100ng/mL混合标准工作液，分别取0μL，12.5μL，25μL，50μL，100μL，250μL用2％甲酸/水-甲醇溶液溶解定容至0.5mL。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述同位素内标工作液为浓度均为10ng/mL的沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9混合溶液。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述β-受体激动剂为沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、溴代克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗中的一种或两种以上。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述动物源性食品为猪肉或猪肝。
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