CN111707768B - 检测白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留的方法 - Google Patents

检测白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用气相色谱‑质谱联用技术同时检测白芍总苷原料药中22种有机氯类农药残留的方法，包括以下步骤：制备混合标准品溶液、供试品溶液和基质标准曲线溶液；将基质标准曲线溶液以及供试品溶液按色谱条件和质谱条件依次进样，绘制出22种有机氯农药残留的基质标准曲线；分别代入供试品溶液的峰响应强度数据分别计算并得出供试品溶液中22种有机氯农药残留的浓度。本发明的方法中22种有机氯农药残留在5‑400ng/mL范围内线性拟合度高，22种有机氯农药残留在浓度为0.1mg/kg时的回收率在62％～128％，相对标准偏差≤15％，方法定量限≤0.05mg/kg。该方法快速简便，灵敏度高，精密度高，准确度高，适合于白芍总苷原料药中22种有机氯类农药残留的分析检测。

Description

检测白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留的方法
技术领域
本发明属于化学分析及检测领域，特别是涉及一种利用气相色谱-质谱联用技术检测白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留的方法。
背景技术
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干。白芍具养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳的功能。用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，胁痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕。白芍在种植过程中易感染多种病虫害且发病率高，滥用农药造成了白芍的直接污染。此外，白芍生长周期长(一般3-4年)，土壤和空气中残留的农药容易在植物组织中富集，又会对白芍产生间接污染。
随着我国药品标准提高计划的实施和不断推进，国家药品标准体系已初步建立，药品监管信息化建设步伐加快，药品标准管理工作更加趋于规范和完善。但中药白芍总苷原料药标准化工作仍显得相对滞后。白芍总苷原料药是由白芍饮片经溶剂提取、萃取处理后得到的白色粉末，如将白芍饮片利用乙醇提取，再经乙酸乙酯、正丁醇萃取，经浓缩干燥后制成粉末。浦锦宝等人对白芍总苷原料药中芍药苷及总皂苷的含量研究发现，其中芍药苷含量均大于 15％，总皂苷的含量均大于60％。贺妮等人研究发现白芍总苷原料药对小鼠有抗抑郁及抗炎作用，可能通过影响中枢单胺神经功能对抑郁及炎症进行调节。杨德芳等人研究发现当归/白芍组白芍总苷原料药可通过抑制子宫收缩，改善子宫供血，从而对原发性痛经产生治疗作用。目前针对白芍中农药残留的报道较多，尚未见有关白芍总苷原料药测试农药残留方面的资料。白芍总苷原料药中主要成分为皂苷类化合物，极性大，如参考常规药材前处理方法用酸水浸泡或乙腈等极性较大的溶剂对农药残留进行提取，会将皂苷类化合物同时萃取出来，干扰农药残留的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种前处理简单、灵敏度高、精密度高、准确度高、通量高的有机氯类农药残留检测方法，同时为中药及中药白芍总苷原料药中有机氯类农药残留分析检测提供新的思路。
为解决上述技术问题，本发明提供的利用气相色谱-质谱联用技术检测白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留的方法，可以通过下列方法来实现：
(1)溶液的制备：
混合标准品溶液的制备：分别称取22种有机氯农药残留标准品适量，配制成含有所述 22种有机氯农药残留标准品的混合标准品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取适量白芍总苷原料药粉末供试品，经提取、硅胶净化、浓缩、定容得供试品溶液；
基质标准曲线溶液的制备：精密称取适量白芍总苷原料药粉末供试品至少五份，按一定梯度分别加入不同体积的混合标准品溶液，然后按所述供试品溶液的制备相同的方法，配制得具有一定浓度梯度的至少五个基质标准曲线溶液；
(2)采用气相色谱-质谱联用技术测定；
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm；程序升温：初始柱温55℃～65℃维持2min，然后以16℃/min升至150℃维持0min，然后以10℃/min升至200℃维持0min，然后以3℃/min升至220℃维持0min，然后以25℃/min升至290℃维持8min；
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；质谱监测模式：SIM模式。
(3)数据分析：
将所述至少五个基质标准曲线溶液以及供试品溶液按所述色谱条件和质谱条件依次进样，记录图谱数据；根据至少五个基质标准曲线溶液的峰响应强度数据和浓度数据绘制出22 种有机氯农药残留的基质标准曲线；根据基质标准曲线分别代入供试品溶液的峰响应强度数据分别计算并得出供试品溶液中22种有机氯农药残留的浓度；
所述22种有机氯农药残留及其对应的响应峰离子对分别为：α-六六六，离子 219/183/181；六氯苯，离子284/286/282；β-六六六，离子181/183/219；五氯硝基苯，离子 237/249/265；γ-六六六，离子181/183/219；δ-六六六，离子219/181/183；七氯，离子 274/272/100；艾氏剂，离子262.8/260.8/292.9；氧化氯丹，离子386.8/388.8/390.8；顺式环氧七氯，离子353/351/355；反式环氧七氯，离子185/183/253；顺式氯丹，离子372.8/374.8/376.8；反式氯丹，离子372.8/236.8/271.8；β-硫丹，离子339/240.9/195.0；4,4'-滴滴伊，离子246/318/176；狄氏剂，离子277/263/79；2,4'-滴滴涕，离子235/237/165；4,4'-滴滴涕，离子 237/235/165；异狄氏剂，离子243/281/263；α-硫丹离子194.9/240.9/338.8；4,4'-滴滴滴，离子235/237/165；硫丹硫酸酯，离子272/274/270。
具体的，所述混合标准品溶液中，22种有机氯农药残留标准品的浓度均为1μg/mL。
具体的，所述混合标准品溶液配制时，先用丙酮稀释定容至1mg/mL，再用丙酮稀释定容至10μg/mL，再用丙酮稀释定容至1μg/mL。
在一种具体的实施方式中，混合标准品溶液的制备：分别称取22种对照品各10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配置成1mg/mL储备液；农药残留标准品储备液-18℃保存；取100μL储备液，用丙酮定容至10mL，制成10μg/mL溶液，取1mL，用丙酮稀释至10mL，制备出1μg/mL(ppm)混合标准品溶液。
具体的，所述供试品溶液配制时，提取操作以甲苯为提取溶剂。
具体的，所述供试品溶液配制时，硅胶净化操作用无水硫酸镁，硅胶吸附处理经提取得到的提取液。然后，除去溶剂后，再用甲苯溶解、稀释定容。
在一种具体的实施方式中，白芍总苷原料药供试品溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，超声20min，4000r/min 离心5min；取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min；取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm 滤膜，得到供试品溶液。
在一种具体的实施方式中，白芍总苷原料药基质标准曲线溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g七份，称定，分别置于七个15mL具塞离心管中，各加入10mL甲苯，分别加入1μg/mL混标溶液(1ppm)10/20/40/100/200/400/800μL，超声20min，4000r/min，离心5min；分别取上清液至七个15mL离心管中，各加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min，离心5min；分别取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，得到呈浓度梯度的七个基质标准曲线溶液。
具体的，基质标准曲线的浓度梯度为：5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、 200ng/mL、400ng/mL。
优选的，所述色谱条件中，进样口温度为255℃～265℃；优选为258℃～262℃；更优选为 250℃。
优选的，所述色谱条件中，初始柱温为58℃～62℃；优选为60℃。
优选的，所述色谱条件中，进样量：1μL。
优选的，所述色谱条件中，载气流速为0.9ml/min～1.1ml/min；优选为1mL/min。
优选的，所述色谱条件中，分流模式：不分流。
优选的，所述质谱条件还包括：离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃。
具体的，所述方法在进行准确度或精密度试验时，进样白芍总苷原料药供试品加标溶液。所述白芍总苷原料药供试品加标溶液是通过在供试品溶液配制过程中加入混合标准品溶液配制得到。
在一种具体的实施方式中，所述白芍总苷原料药供试品加标溶液的制备方法为：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1ppm 混标200μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得，进样GC-MS分析。其中，具体的，加标溶液浓度为0.1mg/kg，本发明的方法回收率在62％～128％，重复性RSD％≤15％，中间精密度≤32％。
具体的，所述方法在进行定量限试验时，进样白芍总苷原料药供试品定量限溶液。在一种具体的实施方式中，所述白芍总苷原料药供试品定量限溶液的制备方法为：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1μ g/mL混合对照品溶液20μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；得到0.01mg/kg 定量限溶液。进样六针，以基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法LOD＝10δ/S确定定量限。其中，本发明的方法定量限均低于0.05mg/kg。
本发明提供的22种有机氯类农药残留的检测方法具有下列优点：(1)前处理简单(2) 灵敏度高(3)精密度高(4)准确度高，适合于白芍总苷原料药中22种有机氯类农药残留的分析检测。
本发明的方法可同时检测白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留，检测效率高，1小时内即可得出检测结果。
本发明的方法用于22种有机氯农药残留的基质标准曲线线性好，定量准确，相关系数 R2均大于0.99。
本发明的方法重复性好，考察不同日期、不同分析人员对精密度的影响，两个检测人员用对重复性下浓度的各6份平行进行检测，12次重复的相对标准偏差(RSD)不大于32％。
本发明的方法用于22种有机氯农药残留的定量限低，可有效检测出有机氯农药残留浓度低至0.04mg/kg的白芍总苷原料药样品，对其中部分有机氯农药残留的定量限可低至 0.01mg/kg。
本发明的方法采用甲苯提取、硅胶净化，气相色谱-质谱联用，建立了白芍总苷原料药中22种有机氯类农药残留的分析方法，为白芍总苷原料药标准制订和质量控制提供依据。
附图说明
图1-1为本发明方法实施例1中的专属性对应的空白溶剂图。
图1-2为本发明方法实施例1中的专属性对应的400ng/mL混合对照品图。
图1-3为本发明方法实施例1中的专属性对应的空白供试品溶液图。
图1-4为本发明方法实施例1中的专属性对应的供试品加标溶液图。
图2为本发明方法实施例2中的不同填料前处理回收率比较图。
图3为本发明方法实施例3中的不同进样口温度回收率比较图。
图4为本发明方法实施例4中的不同流速回收率比较图。
图5为本发明方法实施例5中的不同初始柱温回收率比较图。
图6-1为本发明方法实施例6中α-六六六的基质标准曲线。
图6-2为本发明方法实施例6中六氯苯的基质标准曲线。
图6-3为本发明方法实施例6中β-六六六的基质标准曲线。
图6-4为本发明方法实施例6中γ-六六六的基质标准曲线。
图6-5为本发明方法实施例6中δ-六六六的基质标准曲线。
图6-6为本发明方法实施例6中五氯硝基苯的基质标准曲线。
图6-7为本发明方法实施例6中七氯的基质标准曲线。
图6-8为本发明方法实施例6中艾氏剂的基质标准曲线。
图6-9为本发明方法实施例6中氧化氯丹的基质标准曲线。
图6-10为本发明方法实施例6中顺式环氧七氯的基质标准曲线。
图6-11为本发明方法实施例6中反式环氧七氯的基质标准曲线。
图6-12为本发明方法实施例6中顺式氯丹的基质标准曲线。
图6-13为本发明方法实施例6中反式氯丹的基质标准曲线。
图6-14为本发明方法实施例6中β-硫丹的基质标准曲线。
图6-15为本发明方法实施例6中4,4'-滴滴伊的基质标准曲线。
图6-16为本发明方法实施例6中狄氏剂的基质标准曲线。
图6-17为本发明方法实施例6中2,4'-滴滴涕的基质标准曲线。
图6-18为本发明方法实施例6中4,4'-滴滴涕的基质标准曲线。
图6-19为本发明方法实施例6中异狄氏剂的基质标准曲线。
图6-20为本发明方法实施例6中α-硫丹的基质标准曲线。
图6-21为本发明方法实施例6中4,4'-滴滴滴的基质标准曲线。
图6-22为本发明方法实施例6中硫丹硫酸酯的基质标准曲线。
图7-1为本发明方法实施例7中α-六六六的定量限质谱图。
图7-2为本发明方法实施例7中六氯苯的定量限质谱图。
图7-3为本发明方法实施例7中β-六六六的定量限质谱图。
图7-4为本发明方法实施例7中δ-六六六的定量限质谱图。
图7-5为本发明方法实施例7中五氯硝基苯的定量限质谱图。
图7-6为本发明方法实施例7中七氯的定量限质谱图。
图7-7为本发明方法实施例7中艾氏剂的定量限质谱图。
图7-8为本发明方法实施例7中顺式环氧七氯的定量限质谱图。
图7-9为本发明方法实施例7中氧化氯丹的定量限质谱图
图7-10为本发明方法实施例7中反式环氧七氯的定量限质谱图。
图7-11为本发明方法实施例7中反式氯丹的定量限质谱图。
图7-12为本发明方法实施例7中β-硫丹的定量限质谱图。
图7-13为本发明方法实施例7中顺式氯丹的定量限质谱图。
图7-14为本发明方法实施例7中4,4'-滴滴伊的定量限质谱图。
图7-15为本发明方法实施例7中狄氏剂的定量限质谱图。
图7-16为本发明方法实施例7中异狄氏剂的定量限质谱图。
图7-17为本发明方法实施例7中α-硫丹的定量限质谱图。
图7-18为本发明方法实施例7中4,4'-滴滴滴的定量限质谱图。
图7-19为本发明方法实施例7中2,4'-滴滴涕的定量限质谱图。
图7-20为本发明方法实施例7中硫丹硫酸酯的定量限质谱图。
图7-21为本发明方法实施例7中4,4'-滴滴涕的定量限质谱图。
图7-22为本发明方法实施例7中γ-六六六的定量限质谱图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中，白芍总苷原料药购自宁波立华制药有限公司，符合中国药典标准；其他试剂无特殊说明的，均为商品化试剂。
实施例1：专属性的考察
22种有机氯农药残留储备液的制备：
称取22种对照品10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配置成1mg/mL储备液；农药残留标准品储备液置-18℃保存；
1μg/mL混合对照品溶液的制备：取100μL储备液，用丙酮定容至10mL，得到10μg/mL混合对照品溶液，取1mL，用丙酮稀释至10mL，得到1μg/mL混和对照品溶液，具体见附表 1；
400ng/mL混合对照品溶液的制备：取上述1μg/mL混合对照品溶液400μL，加丙酮溶解并定容至1mL，得到400ng/mL混合对照品溶液；
白芍总苷原料药供试品溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
白芍总苷原料药加标溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置 15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1μg/mL混合对照品溶液200μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL 定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：60℃维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至 220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；载气/流速：1mL/min；分流模式：不分流。
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
结果：按上述方法对空白溶剂，400ng/mL混合对照品溶液，供试品溶液，供试品加标溶液进行分析和比对，结果见图1-1至1-4，结果表明此方法空白溶剂，空白样品无干扰，该方法能够明确评估白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留。
表1 22种有机氯类农药残留对照品配制信息
Figure BDA0002568724350000081
Figure BDA0002568724350000091
表2 22种有机氯类农药残留质谱监测离子
α-六六六 12.285 219 183 181
六氯苯 12.435 284 286 282
五氯硝基苯 13.043 237 249 265
β-六六六 12.827 181 183 219
γ-六六六 12.935 181 183 219
δ-六六六 13.468 219 181 183
七氯 14.553 274 272 100
艾氏剂 15.454 262.8 260.8 292.9
氧化氯丹 16.680 386.8 388.8 390.8
顺式环氧七氯 16.680 353 351 355
反式环氧七氯 16.765 185 183 253
顺式氯丹 17.905 372.8 374.8 376.8
反式氯丹 17.393 372.8 236.8 271.8
β-硫丹 17.798 339 240.9 195.0
4,4'-滴滴伊 18.701 246 318 176
狄氏剂 18.711 277 263 79
2,4'-滴滴涕 20.179 235 237 165
4,4'-滴滴涕 20.928 237 235 165
异狄氏剂 19.498 243 281 263
α-硫丹 19.814 194.9 240.9 338.8
4,4'-滴滴滴 20.118 235 237 165
硫丹硫酸酯 20.847 272 274 270
实施例2：不同填料前处理的考察
准备①无水硫酸镁900mg、硅胶300mg至15mL具塞离心管中，②无水硫酸镁900mg至另一支10mL具塞离心管中，③市售农残净化管；分别加入6mL甲苯、1ppm农残混合对照品100μL，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置氮吹仪上40℃水浴氮吹至干，加甲苯1mL，涡旋混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液即得。
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：60℃维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至 220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；载气/流速：1mL/min；分流模式：不分流；
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
测定法：按上述色谱及质谱条件进样三种溶液，比较各填料的回收率。
结果：单独使用无水硫酸镁无法很好净化白芍药材基质对于农药的干扰，农残净化管与无水硫酸镁+硅胶的净化效果相当。见附图2。本发明采用无水硫酸镁+硅胶净化方法可以有效替代农残净化管，且使用方便、成本低廉。
实施例3：进样口温度考察
100ng/mL混合对照品溶液的制备：取上述1μg/mL混合对照品溶液100μL，加丙酮溶解并定容至1mL，得到100ng/mL混合对照品溶液；
白芍总苷原料药加标溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置 15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1μg/mL混合对照品溶液200μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL 定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：60℃维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至 220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：待考察；进样量：1μL；载气/流速：1mL/min；分流模式：不分流；
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
测定法：分别在进样口温度240℃、250℃、260℃，其他参数保持不变的条件下比较各农药残留的回收率。
结果：从附图3可看出，当进样口温度为240℃或260℃时，加标供试品溶液中硫丹硫酸酯的回收率＞130％，当进样口温度为250℃时，加标供试品溶液回收率均在正常范围内，因此确定进样口温度为255℃～265℃，优选为258℃～262℃，更优选为250℃。
实施例4：流速的考察
100ng/mL混合对照品溶液的制备：取上述1μg/mL混合对照品溶液100μL，加丙酮溶解并定容至1mL，得到100ng/mL混合对照品溶液；
白芍总苷原料药加标溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置 15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1μg/mL混合对照品溶液200μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL 定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：60℃维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至 220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；载气/流速：待考察；分流模式：不分流；
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
测定法：分别在不同流速0.8ml/m in、1.0ml/min、1.2ml/min，其他参数保持不变的条件下比较各农药残留的回收率。
结果：从附图4可看出，当流速为0.8ml/min或1.2ml/min时，加标供试品溶液中α-硫丹、β硫丹的回收率＞130％，当流速为1.0ml/min时，加标供试品溶液回收率均在正常范围内，因此确定流速为0.9ml/min～1.1ml/min，优选为1.0ml/min。
实施例5：不同初始柱温的考察
100ng/mL混合对照品溶液的制备：取上述1μg/mL混合对照品溶液100μL，加丙酮溶解并定容至1mL，得到100ng/mL混合对照品溶液；
白芍总苷原料药加标溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置 15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1μg/mL混合对照品溶液200μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL 定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：初始柱温(待考察)维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；载气/流速：1mL/min；分流模式：不分流；
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
测定法：分别在不同初始柱温50℃、60℃、70℃，其他参数保持不变的条件下比较各农药残留的回收率。
结果：从附图5可看出，当初始柱温为50℃时，七氯无响应，当初始柱温设置为70℃时，六氯苯无响应；当初始柱温设置为60℃时，22种有机氯均响应正常，因此确定初始柱温为55℃～65℃，优选为58℃～62℃，更优选为60℃。
实施例6：基质标准曲线及准确度、精密度考察
对照品溶液制备：取100μL储备液，用丙酮定容至10mL，制成10μg/mL溶液，取1mL，用丙酮稀释至10mL，制备出1μg/mL(ppm)混标溶液；
样品溶液制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
基质标准曲线制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品，2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，分别加入混标溶液(1ppm)10/20/40/100/200/400/800μL，，超声20min，4000r/min，离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min，离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
加标溶液制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1ppm混标200μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得平行制备样品6份；
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：60℃维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至 220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；载气/流速：1mL/min；分流模式：不分流；
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
测定法：按照该色谱及质谱条件进样上述溶液，对基质标准曲线溶液进行测定，进行回归分析以确定该方法中每种农药残留的线性。绘制浓度与信号强度的曲线，计算相关系数r2。并按回收率测定其准确度、精密度。
结果：该方法在覆盖样品制备的溶液中农药残留浓度的范围内具有良好的线性；且符合农药残留相关系数大于0.99的验收标准，见附表3。准确度符合验收标准：50％～130％，见附表4。精密度符合验收标准：RSD≤15％，见附表4。
表3 22种有机氯类农药残留的线性及范围
Figure BDA0002568724350000131
表4 22种有机氯类农药残留在白芍总苷原料药原料药中的定量限
Figure BDA0002568724350000132
Figure BDA0002568724350000141
表5 22种农药残留中间精密度
Figure BDA0002568724350000142
Figure BDA0002568724350000151
实施例7：定量限的考察
50ng/mL混合对照品溶液的制备：取上述1μg/mL混合对照品溶液50μL，加丙酮溶解并定容至1mL，得到50ng/mL混合对照品溶液；
白芍总苷原料药加标溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置 15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1μg/mL混合对照品溶液20μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL 定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：60℃维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至 220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；载气/流速：1mL/min；分流模式：不分流；
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
测定法及结果：把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的被测物质最低浓度，制备估算浓度的加标样品6份，考察定量限浓度下的准确度和精密度，具体数据见下表6，每种农药的定量限未超过中国药典-四部通则2341- 第二法规定限值，符合验收标准。
表6 22种有机氯类农药残留在白芍总苷原料药中的定量限
Figure BDA0002568724350000161
实施例8一未知样品进行定量检测
22种有机氯农药残留储备液的制备：称取22种对照品10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配置成1mg/mL储备液；农药残留标准品储备液置-18℃保存；
1μg/mL混合对照品溶液的制备：取100μL储备液，用丙酮定容至10mL，得到10μg/mL混合对照品溶液，取1mL，用丙酮稀释至10mL，得到1μg/mL混和对照品溶液，具体见附表 1；
400ng/mL混合对照品溶液的制备：取上述1μg/mL混合对照品溶液400μL，加丙酮溶解并定容至1mL，得到400ng/mL混合对照品溶液；
白芍总苷原料药供试品溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
白芍总苷原料药加标溶液的制备：白芍总苷原料药直接取样，称取供试品2g，称定，置 15mL具塞离心管中，加入10mL甲苯，加入1μg/mL混合对照品溶液200μL，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液至15mL离心管中，加入无水硫酸镁900mg，硅胶300mg，涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清液，置于40℃水浴中氮吹至干，加入甲苯2mL 定容，过0.45μm滤膜，取滤液即得；
色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：60℃维持2min，以16℃/min升至150℃维持0min，以10℃/min升至200℃维持0min，以3℃/min升至 220℃维持0min，以25℃/min升至290℃维持8min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；载气/流速：1mL/min；分流模式：不分流。
质谱条件：离子源：电子轰击源(EI)；离子源温度：230℃；质谱传接口温度：280℃；质谱监测模式：SIM模式。
检测结果：171209批次白芍总苷原料药中22种有机氯类农药均未检出，具体见下表7。
表7一未知样品22种农药残留定量检测结果
Figure BDA0002568724350000171
Figure BDA0002568724350000181
(注：N.D代表未检出)
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测白芍总苷原料药中22种有机氯农药残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）溶液的制备：
混合标准品溶液的制备：分别称取22种有机氯农药残留标准品适量，用丙酮稀释定容配制成含有所述22种有机氯农药残留标准品的混合标准品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取适量白芍总苷原料药粉末供试品，以甲苯为提取溶剂提取、硅胶净化、浓缩、甲苯定容得供试品溶液；
基质标准曲线溶液的制备：精密称取适量白芍总苷原料药粉末供试品至少五份，按一定梯度分别加入不同体积的混合标准品溶液，然后按所述供试品溶液的制备相同的方法，配制得具有一定浓度梯度的至少五个基质标准曲线溶液；
所述硅胶净化是用无水硫酸镁和硅胶吸附处理经提取得到的提取液，除去溶剂后，再用甲苯溶解、稀释定容；
（2）采用气相色谱-质谱联用技术测定；
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS，30m×0.25mm×0.25µm；程序升温：初始柱温55℃~65℃维持2 min，然后以16 ℃/min升至150 ℃维持0 min，然后以10 ℃/min升至200 ℃维持0min，然后以3 ℃/min升至220 ℃维持0 min，然后以25 ℃/min升至290 ℃维持8 min；
质谱条件：离子源：电子轰击源（EI）；质谱监测模式：特征离子扫描；
（3）数据分析：
将所述至少五个基质标准曲线溶液以及供试品溶液按所述色谱条件和质谱条件依次进样，记录图谱数据；根据至少五个基质标准曲线溶液的峰响应强度数据和浓度数据绘制出22种有机氯农药残留的基质标准曲线；根据基质标准曲线分别代入供试品溶液的峰响应强度数据分别计算并得出供试品溶液中22种有机氯农药残留的浓度；
所述22种有机氯农药残留及其对应的响应峰离子对分别为：α-六六六，离子219/183/181；六氯苯，离子284/286/282；β-六六六，离子181/183/219；五氯硝基苯，离子237/249/265；γ-六六六，离子181/183/219；δ-六六六，离子219/181/183；七氯，离子274/272/100；艾氏剂，离子262.8/260.8/292.9；氧化氯丹，离子386.8/388.8/390.8；顺式环氧七氯，离子353/351/355；反式环氧七氯，离子185/183/253；顺式氯丹，离子372.8/374.8/376.8；反式氯丹，离子372.8/236.8/271.8；β-硫丹，离子339/240.9/195.0；4,4'-滴滴伊，离子246/318/176；狄氏剂，离子277/263/79；2,4'-滴滴涕，离子235/237/165；4,4'-滴滴涕，离子237/235/165；异狄氏剂，离子243/281/263；α-硫丹，离子194.9/240.9/338.8；4,4'-滴滴滴，离子235/237/165；硫丹硫酸盐，离子272/274/270。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合标准品溶液中，22种有机氯农药标准品的浓度均为1μg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合标准品溶液配制时，先用丙酮稀释定容至1mg/mL，然后用丙酮稀释定容至10μg/mL，再用丙酮稀释定容至1μg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质标准曲线溶液为七个，浓度梯度为： 5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱条件中，进样口温度为250℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱条件中，初始柱温为58℃~62℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述气相色谱条件中，初始柱温为60℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱条件中，载气流速为0.9 ml/min ~1.1 ml/min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述气相色谱条件中，载气流速为1 mL/min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱条件中，分流模式：不分流。
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