CN104569254A

CN104569254A - 一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法

Info

Publication number: CN104569254A
Application number: CN201410775249.XA
Authority: CN
Inventors: 罗彦波; 陈再根; 庞永强; 朱风鹏; 姜兴益; 李雪
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: CN104569254B

Abstract

本发明公开了一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其用有机溶剂对润湿的烟叶样品进行浸提，再加入干燥剂对提取液进行干燥，随后用磁性吸附剂对其进行净化，最后用在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱联用仪检测，建立了烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法。本发明的方法克服了现有测定方法的不足，优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比，本发明方法不仅降低了测试成本，而且具有样品前处理过程操作简单、净化能力强、灵敏度高等优点。

Description

一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法

技术领域

本发明属于农药残留量测定技术领域，具体涉及一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法。

背景技术

有机氯农药是用于防治植物病虫害的组成成分中含有氯元素的有机化合物，尽管其在保障农作物高产等方面发挥着十分重要的作用，但其广泛使用会导致其在农产品上的残留，从而危害人类健康并对生态环境造成负面的影响。国际烟草科学研究合作中心农用化学品咨询委员会于2003年发布了烟草中农药指导性残留限量的基本原则与实施意见，并于2013年进行了扩充和修正，共对120种农药残留提出了指导性限量指标，这些都对烟草中农药残留分析提出了更高的要求。

由于烟草基质复杂，而其中的有机氯农药残留量含量较低（可低至ng/g级别），因此在对烟草中的有机氯残留量进行测定时通常需要一定的样品预处理过程。楼小华等（CN 102645498 A）公开了一种烟叶中202种农药残留量的测定方法,该方法的前处理过程包括以下步骤：烟草样品加水浸润后加入乙腈，再在无机盐的盐析作用下完成样品的提取，最后用吸附材料净化后进行检测。其中，常用的吸附材料可以为乙二胺-N-丙基键合硅胶或C18键合硅胶，这类材料虽然能够除去基质中的色素、有机酸和糖类，但是其在减少基质效应干扰时的作用有限。而且这类吸附材料通常需要离心或过滤的方法才可以与萃取液分离，延长了分析时间，不利于大量样品的快速分析。除此之外，现有技术中使用的净化材料价格相对较高。凝胶色谱-气相色谱-串联质谱是一种新型分析检测技术，样品经凝胶色谱柱分离净化后，含待测组分的馏分与基质干扰物质分离并在线转入气相色谱-串联质谱进行分析。GPC-GC-MS/MS技术不但具有复杂基质样品中痕量目标化合物的分离分析能力，而且具有自动化程度高的优点，使分析结果的准确性、精密度和速度大大提高。因此，以GPC-GC-MS/MS技术为检测手段，发展测试成本低、样品前处理过程操作简单、净化能力强的烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的检测方法具有十分重要的意义。

发明内容

为克服现有技术缺陷，本发明的目的在于提供一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其包括如下步骤：

1）配制内标溶液：以磷酸三苯酯为内标，甲苯为溶剂，配制浓度为20 μg/mL的内标溶液；

2）制备基质匹配系列标准工作溶液：配制具有浓度梯度且含有内标的基质匹配系列标准工作溶液；

3）样品提取：准确称取2.00 g 待测样品于离心管中，加入10 mL水，振荡至样品被水充分浸润；静置10 min后加入10 mL 有机溶剂和100 μL 内标溶液，然后将离心管置于涡漩混合仪上以2000 rpm 速率振荡2 min；取出离心管于-20℃条件下放置10 min，然后向离心管中加入5 mL甲苯、4 g 无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠（用作干燥剂，建议立即手持离心管剧烈振荡以防止结块），再将离心管置于涡漩混合仪上以2000 rpm 速率振荡2 min，然后以4000 rpm的速度离心5 min，收集上层清液，备用；

4）样品净化：取0.5 mL上层清液加入到装有磁性吸附剂的离心管中，再以2000 rpm的速度振荡净化；随后在外加磁场的作用下将磁性吸附剂与溶液分离，所得溶液即为样品净化液；

5）样品检测：将基质匹配系列标准工作溶液和样品净化液在相同条件下进行在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱分析；

6）结果计算：由目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行定量。

具体的，步骤2）所述制备基质匹配系列标准工作溶液的具体步骤如下：以多种有机氯农药标准品为溶质，甲苯为溶剂，磷酸三苯酯为内标，配制不同浓度的系列标准工作溶液：0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 μg/mL，且系列标准工作溶液中内标浓度为0.200 μg/mL；取不含目标分析物的空白样品，按照步骤3）和4）处理后获得空白净化液，其中重复步骤3）时不添加内标溶液；取八份一定体积的空白净化液用氮吹浓缩仪吹干，再分别加入相同体积不同浓度的前述系列标准工作溶液，混匀溶解后即得到基质匹配系列标准工作溶液。其中，不同浓度的系列标准工作溶液的配制可参考如下过程：分别称取10 mg 不同有机氯农药标准品于100 mL 容量瓶中，用甲苯溶解并定容至刻度，配制成每种有机氯农药的单一标准储备液；移取2 mL各有机氯农药的单一标准储备液于同一100 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，获得浓度均为2 μg/mL的混合标准储备液；分别移取5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL和1000 μL的混合标准储备液至八个10 mL 的容量瓶中，再加入100 μL 内标溶液后用甲苯定容至刻度，即制得不同浓度的系列标准工作溶液。

步骤3）中所述有机溶剂为乙腈，或环己烷和丙酮的混合溶液（V_环己烷：V_丙酮=7：3），或正己烷和乙酸乙酯的混合溶液（V_正己烷：V_乙酸乙酯=5：5）。

步骤4）中所述磁性吸附剂为乙二胺-N-丙基键合硅胶、四氧化三铁和石墨化炭黑组成的混合物，或乙二胺-N-丙基键合硅胶、四氧化三铁和石墨烯组成的混合物，或乙二胺-N-丙基键合硅胶、四氧化三铁和碳纳米管组成的混合物；磁性吸附剂添加量不小于10 mg（优选60－100 mg）；振荡净化时间不少于0.5 min。乙二胺-N-丙基键合硅胶可购买普通市售产品，其是将乙二胺-N-丙基硅烷键合到硅胶上而得，此为本领域公知常识，故不赘述。为了取得较好的净化效果，磁性吸附剂中三种原料的质量比优选为1：0.5－4：0.4－1.6。

步骤5）中凝胶渗透色谱仪条件为：色谱柱为Shodex CLNpak EV-200（16 μm，2 mm × 150 mm）；流动相为环己烷和丙酮的混合溶液（V_环己烷：V_丙酮=7：3）；流速为0.1 mL/min；柱温为40℃；进样量为10 μL；收集凝胶渗透色谱保留时间为3.0－5.0 min的组分，并将其全部在线导入气相色谱-串联质谱仪分析；气相色谱-串联质谱仪条件为：惰性前置柱为5 m × 0.53 mm的空柱；预柱为DB-35 ms，5 m× 0.25 mm × 0.25 μm；分离柱为DB-35 ms，25 m × 0.25 mm × 0.25 μm；色谱柱升温程序为：初始温度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃并保持7.75 min，运行时间为40 min；采用不分流进样方式，进样时间为7.0 min；以高纯He为载气，载气压力程序为由120 kPa开始，以100 kPa/min升至180 kPa并保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢复至原始压力，并保持33.8 min；程序升温进样口升温程序为：120℃保持5 min，再以100 ℃/min升至250℃并保持33.7 min；接口温度和离子源温度分别为300和200℃；质谱电离源为EI源；电离电压为70 ev；溶剂延迟时间为15 min；多反应监测模式（目标分析物及内标的多反应监测参数如表1所示），碰撞气为Ar，压力为200 kPa。

步骤6）结果计算具体如下：以基质匹配系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线；根据样品净化液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比，代入工作曲线，得到样品中目标分析物的含量。

本发明方法的检测限和定量限为目标分析物信噪比（S/N）为3和10时所对应的浓度。

针对现有技术的缺陷，本发明专门设计了一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法（如图1所示）：用有机溶剂作为提取溶剂对润湿的烟叶样品进行浸提，再加入干燥剂对提取液进行干燥，随后用磁性吸附剂对其进行净化以除去杂质，最后用在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱联用仪进行检测。本发明中对烟草提取溶剂、磁性材料的用量、净化时间及在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱分析条件等进行了优化和考察，并考察了乙腈、环己烷/丙酮（70/30, v/v）和正己烷/乙酸乙酯（50/50, v/v）的提取效果。结果表明：三者对目标分析物均具有较好的提取效果，最终选择单一乙腈作为提取溶剂；考察了磁性吸附剂的用量（10－100 mg），结果发现随着磁性吸附剂用量的不断增加，最终得到的样品溶液的颜色不断变浅，且当用量为80 mg时基本呈现无色状态，继续增加至100 mg时，样品溶液的颜色基本没有变化，因此将磁性吸附剂的用量定为80 mg；优化了净化时间（0.5－6 min），结果表明净化时间为0.5 min时，已经能够得到较好的净化效果，为了保证稳定的净化效果，将净化时间定为1.0 min；为了获取较好的灵敏度，我们对目标分析物的多反应监测条件进行了优化，包括定量离子对和碰撞能量等，最终的多反应监测参数如表1所示。

和现有技术相比，本发明测定方法的有益效果：

1）克服了现有测定技术中前处理繁冗费时、基质去除不彻底等不足，针对烟草提取物的特点和目标分析物的性质，改进了测试方法。具体为：采用磁性吸附剂对烟草提取液进行净化，不仅可以有效地除去基质干扰，而且还能在外借磁场作用下实现样品溶液与磁性吸附剂的分离，具有样品前处理过程操作简单、净化能力强、灵敏度高等优点；

2）以GPC-GC-MS/MS技术为检测手段，可以进一步将目标分析物与大分子干扰基质分离，具有灵敏度高的优点；

3）通过调研和计算发现：现有技术中净化一个样品所使用材料的价格为14元，而采用本发明方法净化一个样品的材料的制备成本不足4元。因此，与现有的测定技术相比，本发明方法显著降低了测试成本。

附图说明

图1为本发明所述烟草及烟草制品中有机氯农药残留量测定方法的操作流程简图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1：

一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法：

2）制备基质匹配系列标准工作溶液：配制具有浓度梯度且含有内标的基质匹配系列标准工作溶液，具体如下：

以多种有机氯农药标准品（即表1中的二十六种有机氯农药标准品）为溶质，甲苯为溶剂，磷酸三苯酯为内标，配制不同浓度的系列标准工作溶液：0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 μg/mL，且系列标准工作溶液中内标浓度为0.200 μg/mL；取不含目标分析物的空白样品，按照步骤3）和4）处理后获得空白净化液，其中重复步骤3）时不添加内标溶液；取八份一定体积的空白净化液用氮吹浓缩仪吹干，再分别加入相体积不同浓度的前述系列标准工作溶液，混匀溶解后即得到基质匹配系列标准工作溶液。其中，不同浓度的系列标准工作溶液的配制可参考如下过程：分别称取10 mg 不同有机氯农药标准品于100 mL 容量瓶中，用甲苯溶解并定容至刻度，配制成每种有机氯农药的单一标准储备液；移取2 mL各有机氯农药的单一标准储备液于同一100 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，获得浓度均为2 μg/mL的混合标准储备液；分别移取5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL和1000 μL的混合标准储备液至八个10 mL 的容量瓶中，再加入100 μL内标溶液后用甲苯定容至刻度，即制得不同浓度的系列标准工作溶液。

3）样品提取：准确称取2.00 g 待测样品于50 mL 具塞离心管中，加入10 mL水，振荡至样品被水充分浸润；静置10 min后加入10 mL 乙腈和100 μL 内标溶液，然后将离心管置于涡漩混合仪上以2000 rpm 速率振荡2 min；取出离心管于-20℃条件下放置10 min，然后向离心管中加入5 mL甲苯、4 g 无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠，立即手持离心管剧烈振荡以防止结块，再将离心管置于涡漩混合仪上以2000 rpm 速率振荡2 min，然后以4000 rpm的速度离心5 min，收集上层清液，备用；

4）样品净化：取0.5 mL上层清液加入到装有80 mg磁性吸附剂（所述磁性吸附剂由乙二胺-N-丙基键合硅胶、四氧化三铁和石墨化炭黑组成，其质量比为1：2：0.8）的离心管中，再以2000 rpm的速度振荡净化；随后在外加磁场的作用下将磁性吸附剂与溶液分离，所得溶液即为样品净化液；

5）样品检测：将基质匹配系列标准工作溶液和样品净化液在相同条件下进行在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱分析；其中，凝胶渗透色谱仪条件为：色谱柱为Shodex CLNpak EV-200（16 μm，2 mm × 150 mm）；流动相为环己烷和丙酮的混合溶液（V_环己烷：V_丙酮=7：3）；流速为0.1 mL/min；柱温为40℃；进样量为10 μL；收集凝胶渗透色谱保留时间为3.0－5.0 min的组分（共计约0.2 mL），并将其全部在线导入气相色谱-串联质谱仪分析；气相色谱-串联质谱仪条件为：惰性前置柱为5 m × 0.53 mm的空柱；预柱为DB-35 ms，5 m × 0.25 mm × 0.25 μm；分离柱为DB-35 ms，25 m × 0.25 mm × 0.25 μm；色谱柱升温程序为：初始温度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃并保持7.75 min，运行时间为40 min；采用不分流进样方式，进样时间为7.0 min；以高纯He为载气，载气压力程序为由120 kPa开始，以100 kPa/min升至180 kPa并保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢复至原始压力，并保持33.8 min；程序升温进样口升温程序为120℃保持5 min，再以100 ℃/min升至250℃并保持33.7 min；接口温度和离子源温度分别为300和200℃；质谱电离源为EI源；电离电压为70 ev；溶剂延迟时间为15 min；多反应监测模式（目标分析物及内标磷酸三苯酯的多反应监测参数如表1所示），碰撞气为Ar，压力为200 kPa。

6）结果计算：由目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行定量；具体如下：以基质匹配系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线；根据样品净化液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比，代入工作曲线，得到样品中目标分析物的含量。

将目标分析物信噪比（S/N）为3和10时所对应的浓度定为检测限和定量限，本发明中目标分析物的线性范围、工作曲线、定量限和检测限如表2所示。

为了考察本发明方法的重现性，配制低、中、高三种浓度的样品，以一天内配制的4个样品进行测定，计算不同浓度下的日内相对标准偏差，其中低、中、高三种浓度分别为各目标分析物线性范围最低值的2倍、10倍和100倍（下同）；以连续3天配制的样品进行萃取，计算不同浓度下的日间相对标准偏差。结果如表3所示，目标分析物在不同浓度下的日内及日间精密度分别小于11.1%和15.0%，说明该方法具有较好的重现性。

采用上述方法和现行标准方法对三种烟叶样品进行了测定。结果如表4所示：本发明测定方法和标准方法检测结果不存在显著差异。

在上述烟叶样品中添加低、中、高三种浓度（同上）的标准溶液，然后用本发明测定方法对其分析，将所得的峰面积之比代入目标分析物的标准工作曲线计算所测得的浓度，并与实际添加量相比得到相对回收率。如表5所示，不同浓度下目标分析物的相对回收率介于65.3－124.2%之间，表明本发明测定方法的准确性良好，可以满足日常烟叶样品中有机氯农药残留的分析要求。

Claims

1.一种烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

3）样品提取：准确称取2.00 g 待测样品于离心管中，加入10 mL水，振荡至样品被水充分浸润；静置10 min后加入10 mL 有机溶剂和100 μL 内标溶液，然后将离心管置于涡漩混合仪上以2000 rpm 速率振荡2 min；取出离心管于-20℃条件下放置10 min，然后向离心管中加入5 mL甲苯、4 g 无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠，再将离心管置于涡漩混合仪上以2000 rpm 速率振荡2 min，然后以4000 rpm的速度离心5 min，收集上层清液，备用；

2.如权利要求1所述烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其特征在于，步骤2）所述制备基质匹配系列标准工作溶液的具体步骤如下：以有机氯农药标准品为溶质，甲苯为溶剂，磷酸三苯酯为内标，配制不同浓度的系列标准工作溶液：0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 μg/mL，且系列标准工作溶液中内标浓度为0.200 μg/mL；取不含目标分析物的空白样品，按照步骤3）和4）处理后获得空白净化液，其中重复步骤3）时不添加内标溶液；取八份一定体积的空白净化液用氮吹浓缩仪吹干，再分别加入相同体积不同浓度的前述系列标准工作溶液，混匀溶解后即得到基质匹配系列标准工作溶液。

3.如权利要求1所述烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其特征在于，步骤3）中所述有机溶剂为乙腈，或环己烷和丙酮的混合溶液，或正己烷和乙酸乙酯的混合溶液。

4.如权利要求1所述烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其特征在于，步骤4）中所述磁性吸附剂为乙二胺-N-丙基键合硅胶、四氧化三铁和石墨化炭黑组成的混合物，或乙二胺-N-丙基键合硅胶、四氧化三铁和石墨烯组成的混合物，或乙二胺-N-丙基键合硅胶、四氧化三铁和碳纳米管组成的混合物；磁性吸附剂添加量不小于10 mg；振荡净化时间不少于0.5 min。

5.如权利要求1所述烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其特征在于，步骤5）中凝胶渗透色谱条件为：色谱柱为Shodex CLNpak EV-200；流动相为环己烷和丙酮的混合溶液；流速为0.1 mL/min；柱温为40℃；进样量为10 μL；收集凝胶渗透色谱保留时间为3.0－5.0 min的组分，并将其全部在线进行气相色谱-串联质谱分析；气相色谱-串联质谱条件为：惰性前置柱为5 m × 0.53 mm的空柱；预柱为DB-35 ms，5 m × 0.25 mm × 0.25 μm；分离柱为DB-35 ms，25 m ×0.25 mm × 0.25 μm；色谱柱升温程序为：初始温度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃并保持7.75 min，运行时间为40 min；采用不分流进样方式，进样时间为7.0 min；以高纯He为载气，载气压力程序为：由120 kPa开始，以100 kPa/min升至180 kPa并保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢复至原始压力，并保持33.8 min；程序升温进样口升温程序为：120℃保持5 min，再以100 ℃/min升至250℃并保持33.7 min；接口温度和离子源温度分别为300和200℃；质谱电离源为EI源；电离电压为70 ev；溶剂延迟时间为15 min；多反应监测模式，碰撞气为Ar，压力为200 kPa。

6.如权利要求1所述烟草及烟草制品中有机氯农药残留量的测定方法，其特征在于，步骤6）结果计算具体如下：以基质匹配系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线；根据样品净化液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比，代入工作曲线，得到样品中目标分析物的含量。