CN103257198A

CN103257198A - 一种分析烟草及烟草制品中有机氯农药残留的gc-ms/ms方法

Info

Publication number: CN103257198A
Application number: CN2013102268354A
Authority: CN
Inventors: 边照阳; 陈晓水; 唐纲岭; 刘珊珊; 杨飞; 陈再根; 刘洋; 张洪非; 李中皓; 胡清源
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2013-06-08
Filing date: 2013-06-08
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2033-06-08
Also published as: CN103257198B

Abstract

一种分析烟草及烟草制品中有机氯农药残留的GC-MS/MS方法，属于烟草及烟草制品中农药残留检测技术领域，是将样品经水浸润后，加入乙腈和内标物，然后涡旋提取、盐析分层，然后用氯化钠水溶液与正己烷进行二次盐析和液液萃取，取正己烷上清液，以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定的方法。本发明的方法简化了现有样品处理方法，并提供更干净的上机溶液，减少了仪器在使用过程中的维护。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：样品前处理过程中省去基质分散固相萃取（d-SPE）的净化步骤，而是取乙腈提取液，用正己烷和氯化钠水溶液进行液液萃取和二次盐析，上层清液中的极性共萃取基质大大减少，而且灵敏度高、重复性好。

Description

一种分析烟草及烟草制品中有机氯农药残留的GC-MS/MS方法

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品中农药残留检测技术领域，主要涉及烟草及烟草制品中的有机氯农药残留的测定技术。

背景技术

有机氯类农药作为一种持久性有机污染物（POPs），由于其半衰期长，且具有长期残留性、生物蓄积性和高毒性，因此得到了广泛的关注。

农药残留是指农药施用于农作物之后，残留在环境、农作物和生物体内的微量农药及其代谢物和降解产物等。在烟草的育苗生长和采摘后的储存过程中，不可避免的使用到除草剂、植物生长调节剂、杀虫剂、杀螨剂和杀菌剂等。而同时烟草作为一种吸食品，其安全性要求高，因此，烟草中的农药残留得到了广泛的关注。

鉴于农药残留的危害性和重要性，很多国家和地区提出了对多种农作物中的农药残留限量及质控方法，如日本的一齐法、欧盟的SANCO/10684/2009等。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）于2003年12月提出了烟草中99种农药的指导性残留限量（GRLs， Guidance Residue Levels）,2008年6月进行了修订，现为118种。

对烟草中有机氯类残留分析的检测方法主要有气相色谱（GC-ECD）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等，气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）未单独用于分析有机氯农残。质谱作为检测器提高了方法在定性上的可靠性，二级质谱（MS/MS）相对一级质谱（MS），其抗干扰能力更强，对样品前处理的要求更低。

为适应二级质谱的高选择性和强抗干扰能力，前处理方法中应用最多的就是简单快速的QuEChERS方法。自2003年起，Anastassiades等提出了适用于水果和蔬菜中多残留分析的QuEChERS方法之后，该方法迅速发展并不断改进，并应用到烟草及烟草制品中农药残留的测定。该方法的一般原理是，乙腈萃取后用PSA净化，而后或稀释或溶剂替换，上机检测。

发明内容：

本发明的目的旨在进一步简化现有方法并得到更干净的上机溶液，提供一种样品经水浸润后，加入乙腈和内标物，然后涡旋提取、盐析分层，然后用氯化钠水溶液与正己烷进行二次盐析和液液萃取，取正己烷上清液，以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定的方法。该方法能快速、准确检测烟草及烟草制品中有机氯农药残留，测定结果准确、重复性好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的烟草及烟草制品中有机氯农药（指的是表1中的27种）残留量的测定方法包括以下步骤：

a、内标溶液的配制：配制TPP（三苯基磷酸酯）浓度为20 μg/mL的丙酮溶液；

b、称取样品：称取2.0 g烟草样品于50 mL具塞离心管中，精确到0.1 g；

c、加水浸润样品：准确加入10 mL水，浸润10 min；

d、振荡萃取：准确加入10 mL乙腈和100 μL内标溶液，在漩涡混合振荡仪上以2000 rpm涡旋1 min；

e、盐析分层：加入盐析试剂包（含4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠），立即于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm振荡2 min，在高速离心机上以5000 rpm离心3 min；

f、液液萃取：取1 mL乙腈提取液于15 mL离心管中，并加入1 mL正己烷和5 mL氯化钠水溶液（20 %，w/w），在漩涡混合振荡器上以2000 rpm的转速振荡2 min，在高速离心机上以5000 rpm离心3 min，取上层正己烷溶液待用；

g、准备标准工作溶液：分别称取0.010 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品（各农药标准品名称见表1），置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，然后用正己烷-丙酮（9：1，v/v）稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液；

h、准备基质配标工作溶液：对空白烟草样品按相同的前处理方式处理后，分别取1 mL上层正己烷溶液氮气吹干后，用1 mL不同浓度梯度的农药标准工作溶液进行复溶；

i、GC-MS/MS测定:吸取配制好的不同浓度的基质配标工作溶液，过0.22 μm有机滤膜后，注入GC-MS/MS;

j、农药残留测定结果的计算:以内标法进行农药目标物的定量分析，即以农药和内标TPP的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标TPP的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中有机氯农药的含量。

在本发明中，标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.01 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，配制成各农药浓度为1 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成各农药浓度为10 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取2 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用正己烷-丙酮（9：1，v/v）定容，配制成各农药浓度为2 μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.01 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1 mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10 mL容量瓶中，准确加入100 μL内标溶液，用正己烷-丙酮（9：1，v/v）定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。

在GC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：TR-Pesticide II弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度90 ℃，保持5 min后以25 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；然后以5 ℃/min升至280 ℃，保持6.5 min；柱后程序：300 ℃，保持5 min；不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（纯度为99.999%）；恒流模式，流速为1.2 mL/min；进样量：1 μL。总运行时间为55 min。

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气（纯度99.999%），碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。有机氯农药及内标的保留时间和质谱参数见表1。

表1 有机氯农药目标物及内标的保留时间和MRM参数

序号

中文通用名称

英文名称

定量离子对

定性离子对

碰撞能量(eV)

保留时间(min)

1

艾氏剂

Aldrin

262.9/192.9

262.9/227.9

32;20

20.81

2

狄氏剂

Dieldrin

276.9/240.9

276.9/206.9

10;20

29.50

3

氯丹（顺）

cis-Chlordane

372.8/265.9

409.8/374.8

15;5

27.81

4

氯丹（反）

trans-Chlordane

372.8/265.9

409.8/374.8

15;5

26.79

5

氯酞酸甲酯

Chlorthal-dimethyl

331.9/300.9

300.9/222.9

10;20

21.34

6

二溴氯丙烷

DBCP

157.0/75.0

157.0/77.0

8;8

6.60

7

o,p'-DDT

234.9/165.0

236.9/165.0

20;25

32.19

8

p,p'-DDT

234.9/165.0

236.9/165.0

25;20

34.06

9

o,p'-DDD

237.0/165.0

235.0/165.0

25;20

32.10

10

p,p'-DDD

235.0/165.0

235.0/199.0

20;13

29.98

11

o,p'-DDE

246.0/176.0

317.9/246.0

30;20

27.29

12

p,p'-DDE

246.0/176.0

248.0/176.0

25;25

29.64

13

氯硝胺

Dicloran

206.0/176.0

208.0/178.0

10;10

13.27

14

α-硫丹

alpha-Endosulfan

240.9/205.9

264.9/192.9

15;17

27.72

15

β-硫丹

beta-Endosulfan

240.9/205.9

195.0/159.9

20;10

31.46

16

硫丹硫酸酯

Endosulfan-sulphate

273.9/238.9

271.9/236.9

15;20

33.60

17

异狄氏剂

Endrin

262.9/192.9

262.9/190.9

26;25

30.76

18

α-六六六

HCH (α-)

218.9/182.9

218.9/144.9

10;20

12.87

19

β-六六六

HCH (β-)

218.9/182.9

218.9/144.9

10;20

13.73

20

δ-六六六

HCH (δ-)

218.9/182.9

180.9/144.9

10;15

15.30

21

林丹

γ-HCH (lindane)

180.9/144.9

180.9/109.0

15;25

14.10

22

七氯

Heptachlor

271.9/236.9

269.9/234.9

20;12

18.08

23

环氧七氯（顺）

Heptachlor epoxides (cis-)

354.8/264.9

352.8/262.9

15;15

24.73

24

环氧七氯（反）

Heptachlor epoxides (trans-)

216.9/181.9

288.9/218.9

15;15

25.10

25

六氯苯

Hexachlorobenzene

283.8/248.8

283.8/213.9

20;25

13.05

26

甲氧滴滴涕

Methoxychlor

227.0/169.0

227.0/212.0

25;15

36.80

27

灭蚁灵

Mirex

271.8/236.8

269.8/234.8

15;15

38.53

IS

TPP

Triphenyl phosphate

326.1/325.1

326.1/233.1

10;10

35.01

本发明的方法简化了现有样品处理方法，并提供更干净的上机溶液，减少了仪器在使用过程中的维护。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

⑴本发明方法样品前处理过程中借鉴了已有方法中“以水浸润样品”的步骤以提高乙腈对农药目标物的萃取效果；同时省去了“加入盐析包之前放入冰箱”的步骤，经考察发现，有机氯农药大都热稳定，不会因为无水硫酸镁和水的结合放热而导致降解，故此处可节省操作时间。

⑵本发明方法样品前处理过程中省去基质分散固相萃取（d-SPE）的净化步骤，而是取乙腈提取液，用正己烷和氯化钠水溶液进行液液萃取和二次盐析，保证了非极性和弱极性有机氯农药的回收率。同时，因为正己烷的非极性强，故上层清液中的极性共萃取基质也大大减少，上机溶液更干净，减少了仪器在使用过程中的维护。

⑶本发明方法采用了高灵敏度和强抗干扰能力的GC-MS/MS进行检测，因此具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

①本发明方法的检测限：

将不同浓度农药的基质配标工作溶液注入GC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检测限（LOD），检测限在0.09 ng/g～3.03 ng/g之间。

②本发明方法的重复性和加标回收率：

在空白烟草样品中加入有机氯农药的标准溶液（浓度为50 ng/mL），然后分别进行前处理和GC-MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可以看出，农药的回收率在74.20％～112.54％之间，相对标准偏差（RSD）在1.84％～13.17％之间，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

附图说明

图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：

27种有机氯农药：艾氏剂、狄氏剂、氯丹（顺）、氯丹（反）、氯酞酸甲酯、二溴氯丙烷、o,p'-DDT、p,p'-DDT、o,p'-DDD、p,p'-DDD、o,p'-DDE、p,p'-DDE、氯硝胺、α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯、异狄氏剂、α-六六六、β-六六六、δ-六六六、林丹、七氯、环氧七氯（顺）、环氧七氯（反）、六氯苯、甲氧滴滴涕、灭蚁灵，内标：TPP，均为标准品；乙腈、丙酮、正己烷，均为色谱级试剂；蒸馏水，符合GB/T 6682中一级水的要求。

美国Thermo Fisher TSQ Quantum GC气相色谱-三重四级杆串联质谱仪；瑞士Mettler AE 163电子天平（感量：0.0001g）；美国Labnet VtexMixer VX200振荡器；德国Sigma高速冷冻离心机。

2．样品处理：

称取约2 g样品，精确至0.01 g，于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡至样品被水充分浸润后静置10 min。移取10 mL乙腈至离心管中，加入100 μL内标工作液，并置于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min 速度振荡1 min。在离心管中加入4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm振荡2 min，在高速离心机上以5000 rpm离心3 min；

取1 mL乙腈提取液于15 mL离心管中，内含1 mL正己烷和5 mL氯化钠水溶液（20 %，w/w），在漩涡混合振荡器上以2000 rpm的转速振荡2 min，在高速离心机上以5000 rpm离心3 min，取上层正己烷溶液待用；

3. 准备标准工作溶液：

分别称取0.01 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，配制成各农药浓度为1 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成各农药浓度为10 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取2 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用正己烷-丙酮（9：1，v/v）定容，配制成各农药浓度为2 μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.01 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1 mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10 mL容量瓶中，准确加入100 μL内标溶液，用正己烷-丙酮（9：1，v/v）定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。

4. 准备基质配标工作溶液：

对空白烟草样品按相同的前处理方式处理（参照步骤“2. 样品处理”）后，分别取1 mL上层正己烷溶液氮气吹干后，用1 mL不同浓度梯度的农药标准工作溶液进行复溶；

5. 测定方法：

将配制好的不同浓度的农药基质配标工作溶液注入GC-MS/MS，以内标法进行农药的定量分析，即以农药与内标TPP的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得检出农药与内标TPP的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的有机氯农药的含量见表3。

表3 样品A中农药目标物的检测结果

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（μg/g）
			1	艾氏剂	——
2	狄氏剂	——
			3	氯丹（顺）	——
4	氯丹（反）	——
			5	氯酞酸甲酯	——
6	二溴氯丙烷	——
			7	o,p'-DDT	——
8	p,p'-DDT	——
			9	o,p'-DDD	——
10	p,p'-DDD	——
			11	o,p'-DDE	——
12	p,p'-DDE	——
			13	氯硝胺	——
14	α-硫丹	——
			15	β-硫丹	——
16	硫丹硫酸酯	0.02
			17	异狄氏剂	——
18	α-六六六	——
			19	β-六六六	——
20	δ-六六六	——
			21	林丹	——
22	七氯	——
			23	环氧七氯（顺）	——
24	环氧七氯（反）	——
			25	六氯苯	——
26	甲氧滴滴涕	——
			27	灭蚁灵	——

注：“—”表示未检出

实例2：

如实施例1所述，选择另一烟草样品B，测得样品中有机氯农药目标物的含量见表4。

表4 样品B中农药目标物的检测结果

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（μg/g）
			1	艾氏剂	——
2	狄氏剂	——
			3	氯丹（顺）	——
4	氯丹（反）	——
			5	氯酞酸甲酯	——
6	二溴氯丙烷	——
			7	o,p'-DDT	——
8	p,p'-DDT	——
			9	o,p'-DDD	——
10	p,p'-DDD	——
			11	o,p'-DDE	——
12	p,p'-DDE	——
			13	氯硝胺	——
14	α-硫丹	——
			15	β-硫丹	0.01
16	硫丹硫酸酯	0.03
			17	异狄氏剂	——
18	α-六六六	——
			19	β-六六六	——
20	δ-六六六	——
			21	林丹	——
22	七氯	——
			23	环氧七氯（顺）	——
24	环氧七氯（反）	——
			25	六氯苯	——
26	甲氧滴滴涕	——
			27	灭蚁灵	——

注：“—”表示未检出

实例3：

如实施例1所述，选择另一烟草样品C，测得样品中有机氯农药目标物的含量见表5。

表5 样品C中农药目标物的检测结果

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（μg/g）
			1	艾氏剂	——
2	狄氏剂	——
			3	氯丹（顺）	——
4	氯丹（反）	——
			5	氯酞酸甲酯	——
6	二溴氯丙烷	——
			7	o,p'-DDT	——
8	p,p'-DDT	——
			9	o,p'-DDD	——
10	p,p'-DDD	——
			11	o,p'-DDE	——
12	p,p'-DDE	——
			13	氯硝胺	——
14	α-硫丹	——
			15	β-硫丹	0.21
16	硫丹硫酸酯	0.03
			17	异狄氏剂	——
18	α-六六六	——
			19	β-六六六	——
20	δ-六六六	——
			21	林丹	——
22	七氯	——
			23	环氧七氯（顺）	——
24	环氧七氯（反）	——
			25	六氯苯	——
26	甲氧滴滴涕	——
			27	灭蚁灵	——

注：“—”表示未检出

实例4：

如实施例1所述，选择另一烟草样品D，测得样品中有机氯农药目标物的含量见表6。

表6 样品D中农药目标物的检测结果

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（μg/g）
			1	艾氏剂	——
2	狄氏剂	——
			3	氯丹（顺）	——
4	氯丹（反）	——
			5	氯酞酸甲酯	——
6	二溴氯丙烷	——
			7	o,p'-DDT	——
8	p,p'-DDT	——
			9	o,p'-DDD	——
10	p,p'-DDD	——
			11	o,p'-DDE	——
12	p,p'-DDE	——
			13	氯硝胺	——
14	α-硫丹	——
			15	β-硫丹	0.05
16	硫丹硫酸酯	0.03
			17	异狄氏剂	——
18	α-六六六	——
			19	β-六六六	——
20	δ-六六六	——
			21	林丹	——
22	七氯	——
			23	环氧七氯（顺）	——
24	环氧七氯（反）	——
			25	六氯苯	——
26	甲氧滴滴涕	——
			27	灭蚁灵	——

注：“—”表示未检出

Claims

1.一种分析烟草及烟草制品中有机氯农药残留的GC-MS/MS方法，其特征在于：是将样品经水浸润后，加入乙腈和内标物，然后涡旋提取、盐析分层，之后用氯化钠水溶液与正己烷进行二次盐析和液液萃取，取正己烷上清液，以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定的方法，具体方法如下：

c、加水浸润样品：准确加入10 mL水，浸润10 min；

g、准备标准工作溶液：分别称取0.010 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，然后用正己烷-丙酮（9：1，v/v）稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的系列标准工作溶液；

2.根据权利要求1所述的分析烟草及烟草制品中有机氯农药残留的GC-MS/MS方法，其特征在于：有机氯农药指的是以下27种：艾氏剂、狄氏剂、氯丹（顺）、氯丹（反）、氯酞酸甲酯、二溴氯丙烷、o,p'-DDT、p,p'-DDT、o,p'-DDD、p,p'-DDD、o,p'-DDE、p,p'-DDE、氯硝胺、α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯、异狄氏剂、α-六六六、β-六六六、δ-六六六、林丹、七氯、环氧七氯（顺）、环氧七氯（反）、六氯苯、甲氧滴滴涕、灭蚁灵。

3.根据权利要求1所述的分析烟草及烟草制品中有机氯农药残留的GC-MS/MS方法，其特征在于：具有浓度梯度的各种农药的系列标准工作溶液浓度为：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。

4.根据权利要求1所述的分析烟草及烟草制品中有机氯农药残留的GC-MS/MS方法，其特征在于：

在GC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：TR-Pesticide II弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度90 ℃，保持5 min后以25 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；然后以5 ℃/min升至280 ℃，保持6.5 min；柱后程序：300 ℃，保持5 min；不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（纯度为99.999%）；恒流模式，流速为1.2 mL/min；进样量：1 μL，总运行时间为55 min；

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气（纯度99.999%），碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。