CN102866215A - 烟草及烟草制品中20种农药残留的gc-ms/ms测定方法 - Google Patents

Abstract

一种烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，其特征在于：将待测样品经水浸润后，加入乙腈和内标物，然后涡旋提取、盐析分层，再加入甲苯进行液液萃取，取上清液经分散固相萃取（d-SPE）后,以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定的方法。本发明方法具有如下优良效果：⑴以水浸润样品，提高了随后加入的有机溶剂乙腈对农药目标物的萃取效果。⑵在加入无水硫酸镁之前，预先冷冻处理，从而避免了无水硫酸镁在除水过程中的剧烈放热而导致部分目标物的热降解。⑶在萃取盐析之后的样品萃取液中加入甲苯，得到的萃取液比单独用乙腈时的颜色要浅，实际对萃取液起到了稀释并有部分净化除杂的作用。

Description

烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品中农药残留检测技术领域，主要涉及烟草及烟草制品中的敌菌丹、内吸磷-O、杀虫脒、内吸磷-S、八甲磷、自克威、棉隆、异丙甲草胺、除草定、敌草胺、烯效唑、乙酯杀螨醇、腈菌唑、稻瘟灵、草枯醚、丁硫克百威、溴苯磷、三氯杀螨砜、丙硫克百威、精喹禾灵等20种农药残留的测定技术。 

  

背景技术

农药残留是指农药施用于农作物之后，残留在环境、农作物和生物体内的微量农药及其代谢物和降解产物等。在烟草的育苗生长和采摘后的储存过程中，不可避免的使用到除草剂、植物生长调节剂、杀虫剂、杀螨剂和杀菌剂等。而同时烟草作为一种吸食品，其安全性要求高，因此，烟草中的农药残留得到了广泛的关注。 

农药主要通过呼吸、饮食等方式进入人体，在人体组织和器官内进行积累，尤其是脂肪和肝脏中。对人体健康的影响主要有：急性中毒、慢性中毒、影响神经系统和致癌、致畸、致突变等。 

对食品中农药残留的控制要求分析方法快速、精确、有效、灵敏度高、选择性好。显然，多种农药残留分析的方法（Multi Residue Methods）可对不同种类、不同极性和不同化学性质的多种农药一次进样完全分析，缩短分析时间，提高检测效率。在多种农药残留分析中，使用最多的方法即色质联用，包括用GC或LC进行分离，用MS进行定性定量检测。 

对烟草中多种农药残留分析的检测方法主要有气相色谱（GC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）等。石杰等利用微波辅助萃取，GC-ECD检测的方法对17种有机氯农药进行同时测定，灵敏度高，检出限低，但方法容易出现假阳性误判。质谱作为检测器提高了方法在定性上的可靠性，二级质谱（MS/MS）相对一级质谱（MS），其抗干扰能力更强，对样品前处理的要求更低。 

  

发明内容：

本发明的目的旨在克服上述现有技术缺陷，而专门提供的一种烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，即敌菌丹、内吸磷-O、杀虫脒、内吸磷-S、八甲磷、自克威、棉隆、异丙甲草胺、除草定、敌草胺、烯效唑、乙酯杀螨醇、腈菌唑、稻瘟灵、草枯醚、丁硫克百威、溴苯磷、三氯杀螨砜、丙硫克百威、精喹禾灵等20种农药残留的测定。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，将待测样品经水浸润后，加入乙腈和内标物，然后涡旋提取、盐析分层，再加入甲苯进行液液萃取，取上清液经分散固相萃取（d-SPE）后,以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定的方法,具体步骤如下：

a、内标溶液的配制：配制TPP（三苯基磷酸酯）浓度为20 μg/mL的丙酮溶液；

b、称取样品：称取2.0 g烟草样品于50 mL具塞离心管中，精确到0.1 g； 

c、加水浸润样品：准确加入10 mL水，浸润10 min；

d、振荡萃取：准确加入10 mL乙腈和50 μL内标溶液，在漩涡混合振荡仪上以2000 rpm涡旋1 min；放入4 ℃冰箱冷冻10 min；

e、盐析分层：加入盐析试剂包，立即于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm振荡1 min；

f、液液萃取：加入5 mL甲苯，在漩涡混合振荡器上以2000 rpm的转速振荡2 min，静置；

g、取上清液1.5 mL于2 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁和40 mg PSA（N-丙基乙二胺吸附剂），在漩涡混合震荡仪上以2000 rpm振荡2 min，在高速离心机上以9000 rpm离心3 min，取上清液待用；

h、准备标准工作溶液：分别称取0.010 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，然后用甲苯稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液； 

i、准备基质配标工作溶液：对空白烟草样品（指不含以上20种农药的烟草样品）按相同的前处理方式（b-g过程）处理后（起到减弱基质效应的作用），分别取1 mL上清液氮气吹干后，用1 mL不同浓度梯度的农药标准工作溶液进行复溶；

j、GC-MS/MS测定:吸取配制好的不同浓度的基质配标工作溶液，过0.22 μm有机滤膜后，注入GC-MS/MS;

k、农药残留测定结果的计算:以内标法进行农药目标物的定量分析，即以农药和内标TPP的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标TPP的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的敌菌丹、内吸磷-O、杀虫脒、内吸磷-S、八甲磷、自克威、棉隆、异丙甲草胺、除草定、敌草胺、烯效唑、乙酯杀螨醇、腈菌唑、稻瘟灵、草枯醚、丁硫克百威、溴苯磷、三氯杀螨砜、丙硫克百威、精喹禾灵的含量。

在本发明盐析分析步骤中，所述盐析试剂包由4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠组成。 

所述标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.01 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，配制成各农药浓度为1 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成各农药浓度为10 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取2 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用甲苯定容，配制成各农药浓度为2 μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.01 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1 mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10 mL容量瓶中，准确加入50 μL内标溶液，用甲苯定容，即得系列标准工作溶液，配制的系列标准溶液浓度为：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。 

在GC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：DB-35MS弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min后以25 ℃/min升至150 ℃；然后以5 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（纯度为99.999%）；恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样量：1 μL； 

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气（纯度99.999%），碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式 ：多反应监测（MRM）。

20种农药及内标的保留时间和质谱参数见表1。 

表1  20种农药及内标物的保留时间和MRM参数 

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草及烟草制品，优化了样品前处理方法和仪器检测条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

⑴本发明方法样品前处理过中先采取以水浸润样品，提高了随后加入的有机溶剂乙腈对农药目标物的萃取效果，且乙腈与水互溶，可以借助水，更好地渗入烟草内部。实验结果表明，本发明的萃取效率比单纯采用有机溶剂直接萃取的萃取效率要高。

⑵本发明方法样品前处理过中在加入无水硫酸镁和氯化钠的盐析包前，先放在冰箱中冷冻10 min，从而避免了无水硫酸镁在除水过程中的剧烈放热而导致部分目标物的热降解。 

⑶本发明方法采取在萃取盐析之后的样品萃取液中加入甲苯，得到的萃取液比单独用乙腈时的颜色要浅，实际对萃取液起到了稀释并有部分净化除杂的作用。另外，加入甲苯后可直接取上清液进行净化，不需要离心，节省了操作时间。 

⑷本发明方法采用了高灵敏度和强抗干扰能力的GC-MS/MS进行检测，因此具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。 

①本发明方法的检测限： 

将不同浓度农药的基质配标工作溶液注入GC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检测限（LOD），检测限在0.3 ng/g～4.5 ng/g之间。

②本发明方法的重复性和加标回收率： 

在空白烟草样品中加入敌菌丹、内吸磷-O、杀虫脒、内吸磷-S、八甲磷、自克威、棉隆、异丙甲草胺、除草定、敌草胺、烯效唑、乙酯杀螨醇、腈菌唑、稻瘟灵、草枯醚、丁硫克百威、溴苯磷、三氯杀螨砜、丙硫克百威、精喹禾灵等20种农药的标准溶液，然后分别进行前处理和GC-MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可以看出，20种农药的回收率在70.4％～113.1％之间，平均相对标准偏差（RSD）在为1.34％～10.10％之间，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

表2  20种农药的回收率和重复性（n=6） 

附图说明

图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。 

  

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。 

实例1： 

1．仪器与试剂：

20种农药：敌菌丹、内吸磷-O、杀虫脒、内吸磷-S、八甲磷、自克威、棉隆、异丙甲草胺、除草定、敌草胺、烯效唑、乙酯杀螨醇、腈菌唑、稻瘟灵、草枯醚、丁硫克百威、溴苯磷、三氯杀螨砜、丙硫克百威、精喹禾灵，内标：TPP，均为标准品；乙腈、丙酮、甲苯，均为色谱级试剂；蒸馏水，符合GB/T 6682中一级水的要求。

美国Thermo Fisher TSQ Quantum GC气相色谱-三重四级杆串联质谱仪；瑞士Mettler AE 163电子天平（感量：0.0001g）；美国Labnet VtexMixer VX200振荡器；德国Sigma高速冷冻离心机。 

2．样品处理： 

称取约2 g样品，精确至0.01 g，于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡至样品被水充分浸润后静置10 min。移取10 mL乙腈至离心管中，加入50 μL内标工作液，并置于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min 速度振荡1 min。在-4 ℃冰箱中冷冻保存10 min。在离心管中分别加入4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min 速度振荡1 min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，加入5 mL甲苯，在漩涡混合振荡仪上以2000 r/min 速度振荡2 min；

取上清液1.5 mL于2 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁和40 mg PSA（N-丙基乙二胺吸附剂），在漩涡混合震荡仪上以2000 rpm振荡2 min，在高速离心机上以9000 rpm离心3 min，取上清液待用；

3.准备标准工作溶液：分别称取0.01 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，配制成各农药浓度为1 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成各农药浓度为10 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取2 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用甲苯定容，配制成各农药浓度为2 μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.01 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1 mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10 mL容量瓶中，准确加入50 μL内标溶液，用甲苯定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。

4.准备基质配标工作溶液：对空白烟草样品（指实验证明不含以上20种农药的烟草样品）按相同的前处理方式处理后，分别取1 mL上清液氮气吹干后，用1 mL不同浓度梯度的农药标准工作溶液进行复溶。 

5.测定方法: 将配制好的不同浓度的农药基质配标工作溶液注入GC-MS/MS，以内标法进行农药的定量分析，即以农药与内标TPP的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得检出农药与内标TPP的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的20种农药的含量见表3。 

表3 样品A中农药目标物的检测结果 

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（ng/g）
			1	敌菌丹	54.3
2	内吸磷-O	—
			3	杀虫脒	6.6
4	内吸磷-S	—
			5	八甲磷	—
6	自克威	—
			7	异丙甲草胺	5.5
8	除草定	11.7
			9	敌草胺	—
10	烯效唑	—
			11	乙酯杀螨醇	—
12	腈菌唑	—
			13	稻瘟灵	—
14	草枯醚	—
			15	丁硫克百威	—
16	棉隆	—
			17	溴苯膦	—
18	三氯杀螨砜	—
			19	丙硫克百威	—
20	精喹禾灵	13.3

注：“—”表示未检出。

在GC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：DB-35MS弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min后以25 ℃/min升至150 ℃；然后以5 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（纯度为99.999%）；恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样量：1 μL。总运行时间为44 min 

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气（纯度99.999%），碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式 ：多反应监测（MRM）。20种农药及内标的保留时间和质谱参数见表1。

  

实例2：

如实施例1所述，选择另一烟草样品B，测得样品中20种农药目标物的含量见表4。

表4 样品B中农药目标物的检测结果 

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（ng/g）
			1	敌菌丹	—
2	内吸磷-O	—
			3	杀虫脒	8.2
4	内吸磷-S	—
			5	八甲磷	—
6	自克威	—
			7	异丙甲草胺	7.4
8	除草定	14.8
			9	敌草胺	17.7
10	烯效唑	79.8
			11	乙酯杀螨醇	18.3
12	腈菌唑	74.6
			13	稻瘟灵	—
14	草枯醚	—
			15	丁硫克百威	—
16	棉隆	—
			17	溴苯膦	—
18	三氯杀螨砜	—
			19	丙硫克百威	19.2
20	精喹禾灵	19.7

注：“—”表示未检出

实例3：

如实施例1所述，选择另一烟草样品C，测得样品中20种农药目标物的含量见表5。

表5 样品C中农药目标物的检测结果 

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（ng/g）
			1	敌菌丹	—
2	内吸磷-O	—
			3	杀虫脒	—
4	内吸磷-S	—
			5	八甲磷	—
6	自克威	—
			7	异丙甲草胺	5.5
8	除草定	—
			9	敌草胺	—
10	烯效唑	15.8
			11	乙酯杀螨醇	—
12	腈菌唑	11.1
			13	稻瘟灵	—
14	草枯醚	—
			15	丁硫克百威	—
16	棉隆	—
			17	溴苯膦	—
18	三氯杀螨砜	—
			19	丙硫克百威	19.3
20	精喹禾灵	—

注：“—”表示未检出

实例4：

如实施例1所述，选择另一烟草样品D，测得样品中20种农药目标物的含量见表6。

表6 样品C中农药目标物的检测结果 

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（ng/g）
			1	敌菌丹	38.7
2	内吸磷-O	—
			3	杀虫脒	—
4	内吸磷-S	—
			5	八甲磷	—
6	自克威	—
			7	异丙甲草胺	6.1
8	除草定	10.1
			9	敌草胺	70.2
10	烯效唑	—
			11	乙酯杀螨醇	—
12	腈菌唑	9.3
			13	稻瘟灵	—
14	草枯醚	—
			15	丁硫克百威	—
16	棉隆	—
			17	溴苯膦	—
18	三氯杀螨砜	—
			19	丙硫克百威	—
20	精喹禾灵	—

注：“—”表示未检出

Claims (5)

1.一种烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，其特征在于：将待测样品经水浸润后，加入乙腈和内标物，然后涡旋提取、盐析分层，再加入甲苯进行液液萃取，取上清液经分散固相萃取（d-SPE）后,以气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）进行测定的方法。

2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，其特征在于：具体步骤如下：

a、内标溶液的配制：配制TPP（三苯基磷酸酯）浓度为20 μg/mL的丙酮溶液；

b、称取样品：称取2.0 g烟草样品于50 mL具塞离心管中； 

c、加水浸润样品：准确加入10 mL水，浸润10 min；

d、振荡萃取：准确加入10 mL乙腈和50 μL内标溶液，在漩涡混合振荡仪上以2000 rpm涡旋1 min；放入4 ℃冰箱冷冻10 min；

e、盐析分层：加入盐析试剂包，立即于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm振荡1 min；

f、液液萃取：加入5 mL甲苯，在漩涡混合振荡器上以2000 rpm的转速振荡2 min，静置；

g、取上清液1.5 mL于2 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁和40 mg PSA（N-丙基乙二胺吸附剂），在漩涡混合震荡仪上以2000 rpm振荡2 min，在高速离心机上以9000 rpm离心3 min，取上清液待用；

h、准备标准工作溶液：分别称取0.010 g各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，然后用甲苯稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液； 

i、准备基质配标工作溶液：对空白烟草样品按相同的前处理方式（b-g过程）处理后，分别取1 mL上清液氮气吹干后，用1 mL不同浓度梯度的农药标准工作溶液进行复溶；

j、GC-MS/MS测定:吸取配制好的不同浓度的基质配标工作溶液，过0.22 μm有机滤膜后，注入GC-MS/MS;

k、农药残留测定结果的计算:以内标法进行农药目标物的定量分析，即以农药和内标TPP的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标TPP的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的敌菌丹、内吸磷-O、杀虫脒、内吸磷-S、八甲磷、自克威、棉隆、异丙甲草胺、除草定、敌草胺、烯效唑、乙酯杀螨醇、腈菌唑、稻瘟灵、草枯醚、丁硫克百威、溴苯磷、三氯杀螨砜、丙硫克百威、精喹禾灵的含量。

3.根据权利要求2所述的烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，其特征在于：所述盐析试剂包由4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠组成。

4.根据权利要求2所述的烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，其特征在于：标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.01 g（精确至0.1 mg）各种农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，配制成各农药浓度为1 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成各农药浓度为10 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取2 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用甲苯定容，配制成各农药浓度为2 μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.01 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1 mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10 mL容量瓶中，准确加入50 μL内标溶液，用甲苯定容，即得系列标准工作溶液，配制的系列标准溶液浓度为：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。

5.根据权利要求2所述的烟草及烟草制品中20种农药残留的GC-MS/MS测定方法，其特征在于：在GC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：DB-35MS弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min后以25 ℃/min升至150 ℃；然后以5 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（纯度为99.999%）；恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样量：1 μL；

采用的质谱条件为：EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氩气（纯度99.999%），碰撞池压力为1.0 mTorr；溶剂延迟5 min；扫描方式 ：多反应监测（MRM）。

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