CN104458947A - 一种同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，该方法是将烟草样品中加入无水硫酸钠、内标和酸化乙腈后，涡旋提取，离心分层，取一定量萃取液过固相萃取小柱净化，用体积比3：1的乙腈/甲苯混合液洗脱，将洗脱液浓缩，并以正己烷进行溶剂交换，过有机相滤膜，用气相色谱-质谱联用仪进行检测。本发明简化了烟草样品前处理方法，缩短了样品分析时间，同时得到干净的上机溶液，减少仪器的维护频率和使用成本。

Description

一种同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法

技术领域

本发明属于农药残留分析检测技术领域，涉及的农药残留分析检测方法，尤其涉及一种同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法。

背景技术

农业产业化的发展，农产品的生产越来越依赖于农药、抗生素和激素等化学、生物制品。而这些物质的不合理使用必将导致农产品中的残留超标，影响消费者食用安全，严重时会造成消费者致病、发育不正常，甚至直接导致中毒死亡。控制农药残留对人体的危害，最为有效的方法之一是加强对化学、生物制品使用的监管，为保障监管必须提高食品中农药残留检测的能力水平和效率。当今世界农药残留检测向多残留、快速分析发展，多残留检测是农残分析的一个重要趋势，具有“多”、“快”、“准”三大优势。国内自2006年开始到2008年止，水果和蔬菜、粮谷、茶叶、果蔬汁和果酒、牛奶和奶粉、食用菌等农产品相继制订了同时测定100种以上农药的多残留检测标准。

烟草作为特殊的经济作物，在生产过程中为了有效的控制病虫害常使用各种类型的农药，经常发生农药残留超标现象，烟叶农药残留已经成为影响烟叶安全性的一个重要因素，烟草行业于2011年发布了3个烟草多农残检测行业标准，该系列标准使用4种前处理方法，3种分析方法，可以检测146种农药。其中极性较大的73种农药采用QuEChERS净化后，使用LC/MS/MS进行分析，非极性或中等极性的38种农药用QuEChERS方法处理后，过硅胶和弗洛里硅土小柱进行净化，使用GC/MS和GC/ECD进行分析，而有机氯及拟除虫菊酯类35种农药单独作为一类，过固相萃取小柱后，使用GC/ECD进行分析。使用上述行业标准分析烟草中使用范围较广的几种农药，如甲霜灵、仲丁灵、二甲戊灵、氟节胺、高效氯氟氰菊酯、菌核净(以上3个标准不含菌核净)6种农药，同样需要采用4种前处理方法，耗时耗力，效率低下。

为了缩短分析时间，提高检测效率，中国烟草总公司在2014年又发布了一项烟草及烟草制品多农残检测的企业标准，使用气相色谱-串联质谱仪和液相色谱-串联质谱仪检测，其中气质串联方法检测169种农药，液质串联方法检测141种农药。两种方法均采用QuEChERS方法进行样品前处理，串联质谱方法进行分析。与之前的行业标准相比可大大提高工作效率，减轻劳动负担。

QuEChERS方法是目前世界上公认的简单、快速的样品前处理技术，在水果蔬菜上的应用较广。QuEChERS方法中PSA具有一定的去除色素能力，但是相对偏弱，净化后的上机溶液中仍存在大量色素和其他杂质，尤其是对一些基质复杂的样品如茶叶、烟草等，其净化效果还存在一定的局限性，只能使用抗干扰能力强的GC/MS/MS和LC/MS/MS串联质谱进行检测，随着进样次数的增多，色素会污染衬管、色谱柱和检测器，使得后期结果失真，增加维护仪器的频率，尤其是对活性农药检测结果的准确性影响更大。因此在烟草的多农残检测工作中，尤其是大批量样品分析时，干净的上机溶液对于保证检测结果的准确性尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于进一步简化烟草样品前处理方法，缩短样品分析时间，同时得到干净的上机溶液，减少仪器的维护频率和使用成本，从而提供一种准确度高、重现性好、适用范围更广的多农残同时检测方法。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，该方法是将烟草样品中加入无水硫酸钠、内标和酸化乙腈后，涡旋提取，离心分层，取一定量萃取液过固相萃取小柱净化，用体积比3：1的乙腈/甲苯混合液洗脱，将洗脱液浓缩，并以正己烷进行溶剂交换，过有机相滤膜，用气相色谱-质谱联用仪进行检测。

优选地，如上所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其具体的操作步骤如下：

(1)内标混合溶液的配制：配制灭蚁灵和氯唑磷浓度均为5μg/mL的正己烷内标混合溶液；

(2)农药目标物提取：称取2.000g烟末于50mL离心管中，加入5g无水硫酸钠、100μL步骤(1)配制的内标混合溶液，以及20mL 1％甲酸的乙腈溶液，涡旋震荡3分钟，以4000r/min离心10分钟，吸取5mL上清液到10mL离心管中，待净化；

(3)固相萃取小柱活化：TPT固相萃取小柱中加入2cm高无水硫酸钠，用5mL体积比3：1的乙腈/甲苯混合液活化柱子，弃去流出液；

(4)提取液的净化：将步骤(2)得到的提取液转移到步骤(3)活化后的固相萃取小柱中，用2mL体积比3：1的乙腈/甲苯混合液洗涤试管，重复两次，并将洗涤液转移至小柱中，用10mL体积比3：1的乙腈/甲苯混合液洗涤小柱，收集流出液至平底烧瓶中；

(5)洗脱液的浓缩、溶剂置换：将步骤(4)得到的流出液在40℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩近干,用5mL正己烷进行溶剂置换，重复两次，加入1mL正己烷，转动烧瓶使壁上残留农药充分溶解，涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜，待测GC/MS；

(6)标准储备液配制：将待测的101种农药分成9组，每组10-13种农药，分别称取0.0100g农药标准品，用体积比为9:1的正己烷/丙酮溶液定容于10mL容量瓶中，配制成9组浓度为1000μg/mL的101种农药的标准储备液；

(7)混合标准溶液配制：将步骤(6)中标准储备液各取0.1mL，等比例稀释到10mL容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为10μg/mL的101种农药的混合标准溶液；

(8)空白烟草样品基质的制备：称量2.0g不含目标农药的烟草样品，共五份，除不添加内标溶液外，其他均按照步骤(2)、(3)、(4)和(5)进行操作，制备空白烟草样品基质提取液；

(9)基质混合标准溶液配制：准确移取步骤(7)中浓度为10μg/mL的混合标准溶液2mL，置于10mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成各农药浓度为2μg/mL的混合标准溶液I；准确移取0.0125、0.025、0.0625、0.125、0.2mL的混合标准溶液I，准确移取50μL步骤(1)中内标溶液，加到1.0mL的空白烟草样品基质提取液中，混匀，配成具有浓度梯度的目标农药的基质混合标准工作溶液，配制的系列标准溶液的浓度分别为：0.025、0.05、0.125、0.25、0.4μg/mL；

(10)GC/MS测定：将步骤(9)中的基质混合标准溶液，过0.45μm有机滤膜后，进GC/MS进行测定；

(11)农药残留结果计算：采用内标法进行农药目标物的定量分析，即以农药和内标物的定量离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标物定量离子峰面积比值，代入标准曲线，求的样品中农药的含量。

进一步优选地，如上所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其中步骤(10)中GC/MS测定时采用的色谱条件为：色谱柱DB-5MS弹性毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样口：250℃；初始温度50℃，保持5min，以25℃/min速率升至150℃，保持0min，以3℃速率升至200℃，保持0min，以8℃速率升至280℃，保持5min，以10℃/min速率升至300℃，保持10min，总运行时间为52-53min。

进一步优选地，如上所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其中步骤(10)中GC/MS测定时采用的质谱条件为：电子轰击离子源，70ev，离子源温度300℃；接口温度：280℃，四级杆温度：180℃；溶剂延迟6min；扫描模式：选择离子监测。

再进一步优选地，如上所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其中所述的101种农药包括：叶蝉散、庚烯磷、仲丁威、残杀威、甲基内吸磷、灭线磷、二溴磷、氟乐灵、氟草胺、特丁硫磷、敌虫硫磷、乙拌磷、敌稗、α-HCH、林丹、β-HCH、δ-HCH、op"-DDE、pp"-DDE、op"-DDD、pp"-DDD、op"-DDT、pp"-DDT、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、环氧七氯、顺式-氯丹、α-硫丹、反式-氯丹、狄试剂、异狄试剂、β-硫丹、硫丹硫酸酯、乐果、克百威、磷胺E、磷胺Z、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲基对硫磷、皮蝇硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、溴硫磷、灭芽磷、亚胺硫磷、乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、敌草索、草乃敌、异丙乐灵、除芽通、丁草胺、氟节胺、敌草胺、除草醚、异稻瘟净、三唑酮、三唑醇、稻瘟灵、菌核净、戊菌唑、毒虫畏、噻菌灵、灭菌丹、杀虫畏、丰索磷、噁霜灵、七氟菊酯、联苯菊酯、甲氧DDT、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、顺式-氯菊酯、反式-氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、四溴菊酯、顺式-氟氰菊酯、反式-氟氰菊酯、氰戊菊酯、顺式-氟胺氰菊酯、反式-氟胺氰菊酯、s-氰戊菊酯、溴氰菊酯、异菌脲、硫线磷、氯硝铵、水胺硫磷、苯霜灵、仲丁灵、二嗪磷、甲霜灵、毒死蜱、倍硫磷、乙基对硫磷、付杀硫磷、谷硫磷、乙基谷硫磷。

再进一步优选地，如上所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其中步骤(6)中将101种农药分成如下9组：

第1组13种：叶蝉散、庚烯磷、仲丁威、残杀威、甲基内吸磷、灭线磷、二溴磷、氟乐灵、氟草胺、特丁硫磷、敌虫硫磷、乙拌磷、敌稗；

第2组10种α-HCH、林丹、β-HCH、δ-HCH、op"-DDE、pp"-DDE、op"-DDD、pp"-DDD、op"-DDT、pp"-DDT；

第3组11种：五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、环氧七氯、顺式-氯丹、α-硫丹、反式-氯丹、狄试剂、异狄试剂、β-硫丹、硫丹硫酸酯；

第4组13种：乐果、克百威、磷胺E、磷胺Z、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲基对硫磷、皮蝇硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、溴硫磷、灭芽磷、亚胺硫磷；

第5组11种：乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、敌草索、草乃敌、异丙乐灵、除芽通、丁草胺、氟节胺、敌草胺、除草醚；

第6组12种：异稻瘟净、三唑酮、三唑醇、稻瘟灵、菌核净、戊菌唑、毒虫畏、噻菌灵、灭菌丹、杀虫畏、丰索磷、噁霜灵；

第7组10种：七氟菊酯、联苯菊酯、甲氧DDT、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、顺式-氯菊酯、反式-氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、四溴菊酯；

第8组10种：顺式-氟氰菊酯、反式-氟氰菊酯、氰戊菊酯、顺式-氟胺氰菊酯、反式-氟胺氰菊酯、s-氰戊菊酯、溴氰菊酯、异菌脲、硫线磷、氯硝铵；

第9组11种：水胺硫磷、苯霜灵、仲丁灵、二嗪磷、甲霜灵、毒死蜱、倍硫磷、乙基对硫磷、付杀硫磷、谷硫磷、乙基谷硫磷。

再进一步优选地，如上所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其中第1组农药以氯唑磷为内标进行校正，第2-9组农药以灭蚁灵为内标进行校正。

本发明方法的检测限：将不同浓度目标农药的基质混合标准溶液进GC/MS,以3倍信噪比(S/N)计算检测限(LOD)，检测限在0.001-0.060μg/mL之间。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点和进步性：

(1)前处理中使用两种不同极性的内标进行校正，可以满足极性差异大的目标物如有机氯、菊酯类农药和有机磷农药的同时分析需求，保证了非极性和极性目标物的回收率。

(2)选用1％甲酸的乙腈作为提取溶剂，可以降低一些农药的降解(如N-三卤代乙基硫农药灭菌丹)，增加目标农药在乙腈中的稳定性，提高回收率。

(3)采用本发明方法净化后的上机溶液清澈透明，与现有技术得到的上机溶液相比，共萃取基质中色素等干扰组分大大减少(见图4、5，两种处理方法上机溶液的紫外-可见吸收光谱图，QuECHERS方法上机溶液在400-500nm和650nm处的可见区均有较强的吸收峰，而本发明上机溶液无明显吸收峰)，减少了仪器的维护频率，更适用于大批量样品分析。

(4)本发明方法使用气相色谱-质谱联用仪进行检测，可以降低烟草多农残检测业务门槛。

附图说明

图1：101种农药标准品SIM谱图；

图2：烟叶空白样本添加101种农药标准品SIM谱图；

图3：烟叶空白样本SIM谱图；

图4：本发明上机溶液紫外-可见吸收光谱图；

图5：QuECHERS方法上机溶液紫外-可见吸收光谱图。

具体实施方式

实施例1：样品A烟末中101种农药残留量检测

1、仪器与试剂：

农药标准品：叶蝉散、庚烯磷、仲丁威、残杀威、甲基内吸磷、灭线磷、二溴磷、氟乐灵、氟草胺、特丁硫磷、敌虫硫磷、乙拌磷、敌稗、α-HCH、林丹、β-HCH、δ-HCH、op"-DDE、pp"-DDE、op"-DDD、pp"-DDD、op"-DDT、pp"-DDT、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、环氧七氯、顺式-氯丹、α-硫丹、反式-氯丹、狄试剂、异狄试剂、β-硫丹、硫丹硫酸酯、乐果、克百威、磷胺E、磷胺Z、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲基对硫磷、皮蝇硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、溴硫磷、灭芽磷、亚胺硫磷、乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、敌草索、草乃敌、异丙乐灵、除芽通、丁草胺、氟节胺、敌草胺、除草醚、异稻瘟净、三唑酮、三唑醇、稻瘟灵、菌核净、戊菌唑、毒虫畏、噻菌灵、灭菌丹、杀虫畏、丰索磷、噁霜灵、七氟菊酯、联苯菊酯、甲氧DDT、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、顺式-氯菊酯、反式-氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、四溴菊酯、顺式-氟氰菊酯、反式-氟氰菊酯、氰戊菊酯、顺式-氟胺氰菊酯、反式-氟胺氰菊酯、s-氰戊菊酯、溴氰菊酯、异菌脲、硫线磷、氯硝铵、水胺硫磷、苯霜灵、仲丁灵、二嗪磷、甲霜灵、毒死蜱、倍硫磷、乙基对硫磷、付杀硫磷、谷硫磷、乙基谷硫磷，

内标：灭蚁灵、氯唑磷，均为标准品；乙腈、甲酸、丙酮、正己烷、甲苯、均为色谱纯，无水硫酸钠为分析纯；蒸馏水，符合GB/T6682中一级水的要求。

美国安捷伦7890A-5975C气相色谱-质谱仪；旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；BS214S分析天平(德国Sartorius公司)；上海安亭高速离心机。

2、样品处理：

(1)称取2.0g烟末(样品A：精确至0.001g)于50mL离心管中，加入5g无水硫酸钠、100μL内标(灭蚁灵、氯唑磷混标)，20mL 1％甲酸乙腈溶液，涡旋震荡3分钟，以4000r/min离心10分钟，吸取5mL上清液到10mL离心管中，待净化。

(2)固相萃取小柱活化：TPT固相萃取小柱中加入2cm高无水硫酸钠，用5mL乙腈/甲苯(体积比3：1)活化柱子，弃去流出液。

(3)提取液的净化：将步骤2中提取液转移到活化后的固相萃取小柱中，用2mL乙腈/甲苯(体积比3：1)洗涤试管，重复两次，并将洗涤液转移至小柱中，用10mL乙腈/甲苯(体积比3：1)洗涤小柱，收集流出液至平底烧瓶中。

(4)洗脱液的浓缩、溶剂置换：将步骤3中流出液在40℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩近干,用5mL正己烷进行溶剂置换，重复两次，加入1mL正己烷，转动烧瓶使壁上残留农药充分溶解，涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜，待测(GC/MS)。

采用上述样品处理方法净化后的上机溶液清澈透明，与现有技术得到的上机溶液相比，共萃取基质中色素等干扰组分大大减少(见图4、图5，两种处理方法上机溶液的紫外-可见吸收光谱图，QuECHERS方法上机溶液在400-500nm和650nm处的可见区均有较强的吸收峰，而本发明上机溶液无明显吸收峰)，减少了仪器的维护频率，更适用于大批量样品分析。

3、准备混合标准溶液：

将本发明涉及101种农药分成如下9组：

第1组13种：叶蝉散、庚烯磷、仲丁威、残杀威、甲基内吸磷、灭线磷、二溴磷、氟乐灵、氟草胺、特丁硫磷、敌虫硫磷、乙拌磷、敌稗；

第2组10种α-HCH、林丹、β-HCH、δ-HCH、op"-DDE、pp"-DDE、op"-DDD、pp"-DDD、op"-DDT、pp"-DDT；

第3组11种：五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、环氧七氯、顺式-氯丹、α-硫丹、反式-氯丹、狄试剂、异狄试剂、β-硫丹、硫丹硫酸酯；

第4组13种：乐果、克百威、磷胺E、磷胺Z、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲基对硫磷、皮蝇硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、溴硫磷、灭芽磷、亚胺硫磷；

第5组11种：乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、敌草索、草乃敌、异丙乐灵、除芽通、丁草胺、氟节胺、敌草胺、除草醚；

第6组12种：异稻瘟净、三唑酮、三唑醇、稻瘟灵、菌核净、戊菌唑、毒虫畏、噻菌灵、灭菌丹、杀虫畏、丰索磷、噁霜灵；

第7组10种：七氟菊酯、联苯菊酯、甲氧DDT、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、顺式-氯菊酯、反式-氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、四溴菊酯；

第8组10种：顺式-氟氰菊酯、反式-氟氰菊酯、氰戊菊酯、顺式-氟胺氰菊酯、反式-氟胺氰菊酯、s-氰戊菊酯、溴氰菊酯、异菌脲、硫线磷、氯硝铵；

第9组11种：水胺硫磷、苯霜灵、仲丁灵、二嗪磷、甲霜灵、毒死蜱、倍硫磷、乙基对硫磷、付杀硫磷、谷硫磷、乙基谷硫磷。

分别称取0.010g农药标准品(结果精确至0.1mg)，用体积比为9:1的正己烷/丙酮溶液定容于10mL容量瓶中，配制成9组浓度为1000μg/mL的农药的标准储备液。标准储备液避光0℃-4℃保存，可使用1年。

将上述9组标准储备液各取0.1mL，等比例稀释到10mL容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为10μg/mL的101种农药的混合标准溶液。混合标准溶液避光0℃-4℃保存，可使用1个月。

第1组农药以氯唑磷为内标进行校正，第2-9组农药以灭蚁灵为内标进行校正。101种目标农药和内标的保留时间和质谱参数见附表1。101种农药标准品SIM色谱图见图1，烟叶空白样本SIM色谱图见图2，烟叶空白样本添加101种农药标准品SIM色谱图见图3。

表1：101种农药及内标的保留时间及质谱参数

4、准备基质混合标准工作溶液：

对空白烟草样品按相同的前处理方式进行处理(除不添加内标溶液外，其他操作与步骤2相同)，共五份，制备空白烟草样品基质提取液。准确移取步骤3中浓度为10μg/mL的混合标准溶液2mL，置于10mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成各农药浓度为2μg/mL的混合标准溶液I。准确移取0.0125、0.025、0.0625、0.125、0.20mL的混合标准溶液I，准确移取50μL内标溶液，加到1.0mL的空白烟草样品基质提取液中，混匀，配成具有浓度梯度的目标农药的基质混合标准工作溶液。配制的系列标准溶液的浓度分别为：0.025、0.05、0.125、0.25、0.4μg/mL。

5、测定方法：

将配制好的不同浓度的农药基质混合标准工作溶液注入GC/MS，以内标法进行定量分析，即以农药和内标物的定量离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标物定量离子峰面积比值，代入标准曲线，求的样品中农药的含量见表2。

表2：样品A农药目标物检测结果

GC/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱DB-5MS弹性毛细管色谱柱，规格为(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口：250℃；初始温度50℃，保持5min，以25℃/min速率升至150℃，保持0min，以3℃速率升至200℃，保持0min，以8℃速率升至280℃，保持5min，以10℃/min速率升至300℃，保持10min，总运行时间为52.667min。载气：氦气，纯度为99.999％；恒压模式，17Psi；进样量：1μL，不分流进样。当色谱柱柱效改变，导致色谱峰保留时间漂移时，使用气相色谱保留时间锁定功能，将甲基毒死蜱保留时间锁定在21.75min，其他农药保留时间会校正到方法初始状态的出峰时间。

GC/MS质谱条件：电子轰击离子源，70ev，离子源温度300℃；接口温度：280℃，四级杆温度：180℃；溶剂延迟6min；扫描模式：选择离子监测(SIM)。

上述方法的重复性和加标回收率在空白烟草样品中加入低、中、高不同量的农药的标准溶液，然后分别进行前处理和GC/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表3。由表3可以看出，101种农药中95％以上的农药回收率在70-120％之间，相对标准偏差在0.22-9.66％之间，说明该方法的回收率和重复性完全满足烟草多农残分析工作的需要。

表3:101种农药的检测限、回收率和重复性(n＝6)

需要说明的是，前处理中，使用两种不同极性的内标对整个分析过程进行校正，可以满足极性差异大的目标物如有机氯、菊酯类农药和有机磷农药的同时分析需求。选用1％甲酸的乙腈作为提取溶剂，可以降低一些农药的降解，(如N-三卤代乙基硫农药灭菌丹)增加目标化合物在乙腈中的稳定性，提高回收率。显然，由于在提取之前加入内标溶液，该方法简化了农药目标物的二次提取和提取液的浓缩过程，可以节省操作时间，并得到了干净的上机溶液，减少仪器的维护频率。另外，采用茶叶专用柱进行净化，小柱中的石墨化碳会吸附待测样品中色素和平面结构的化合物，故平面结构的农药如百菌清、六氯苯等不适宜用此方法，净化后的样品待测液清澈透明，无色素残留，降低仪器的维护频率，更适用于大批量样品分析。

实施例2：样品B烟末中101种农药残留量检测

按照实施例1的方法进行操作，选择另一烟草样品B，测得样品中农药目标物的含量见表4。

表4：样品B农药目标物检测结果

实施例3：样品C烟末中101种农药残留量检测

按照实施例1的方法进行操作，选择另一烟草样品C，测得样品中农药目标物的含量见表5。

表5：样品C农药目标物检测结果

Claims (7)

1.一种同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，该方法是将烟草样品中加入无水硫酸钠、内标和酸化乙腈后，涡旋提取，离心分层，取一定量萃取液过固相萃取小柱净化，用体积比3：1的乙腈/甲苯混合液洗脱，将洗脱液浓缩，并以正己烷进行溶剂交换，过有机相滤膜，用气相色谱-质谱联用仪进行检测。

2.根据权利要求1所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，其具体的操作步骤如下：

(1)内标混合溶液的配制：配制灭蚁灵和氯唑磷浓度均为5μg/mL的正己烷内标混合溶液；

(2)农药目标物提取：称取2.000g烟末于50mL离心管中，加入5g无水硫酸钠、100μL步骤(1)配制的内标混合溶液，以及20mL 1％甲酸的乙腈溶液，涡旋震荡3分钟，以4000r/min离心10分钟，吸取5mL上清液到10mL离心管中，待净化；

(3)固相萃取小柱活化：TPT固相萃取小柱中加入2cm高无水硫酸钠，用5mL体积比3：1的乙腈/甲苯混合液活化柱子，弃去流出液；

(4)提取液的净化：将步骤(2)得到的提取液转移到步骤(3)活化后的固相萃取小柱中，用2mL体积比3：1的乙腈/甲苯混合液洗涤试管，重复两次，并将洗涤液转移至小柱中，用10mL体积比3：1的乙腈/甲苯混合液洗涤小柱，收集流出液至平底烧瓶中；

(5)洗脱液的浓缩、溶剂置换：将步骤(4)得到的流出液在40℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩近干,用5mL正己烷进行溶剂置换，重复两次，加入1mL正己烷，转动烧瓶使壁上残留农药充分溶解，涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜，待测GC/MS；

(6)标准储备液配制：将待测的101种农药分成9组，每组10-13种农药，分别称取0.0100g农药标准品，用体积比为9:1的正己烷/丙酮溶液定容于10mL容量瓶中，配制成9组浓度为1000μg/mL的101种农药的标准储备液；

(7)混合标准溶液配制：将步骤(6)中标准储备液各取0.1mL，等比例稀释到10mL容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为10μg/mL的101种农药的混合标准溶液；

(8)空白烟草样品基质的制备：称量2.0g不含目标农药的烟草样品，共五份，除不添加内标溶液外，其他均按照步骤(2)、(3)、(4)和(5)进行操作，制备空白烟草样品基质提取液；

(9)基质混合标准溶液配制：准确移取步骤(7)中浓度为10μg/mL的混合标准溶液2mL，置于10mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成各农药浓度为2μg/mL的混合标准溶液I；准确移取0.0125、0.025、0.0625、0.125、0.2mL的混合标准溶液I，准确移取50μL步骤(1)中内标溶液，加到1.0mL的空白烟草样品基质提取液中，混匀，配成具有浓度梯度的目标农药的基质混合标准工作溶液，配制的系列标准溶液的浓度分别为：0.025、0.05、0.125、0.25、0.4μg/mL；

(10)GC/MS测定：将步骤(9)中的基质混合标准溶液，过0.45μm有机滤膜后，进GC/MS进行测定；

(11)农药残留结果计算：采用内标法进行农药目标物的定量分析，即以农药和内标物的定量离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标物定量离子峰面积比值，代入标准曲线，求的样品中农药的含量。

3.根据权利要求2所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，步骤(10)中GC/MS测定时采用的色谱条件为：色谱柱DB-5MS弹性毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样口：250℃；初始温度50℃，保持5min，以25℃/min速率升至150℃，保持0min，以3℃速率升至200℃，保持0min，以8℃速率升至280℃，保持5min，以10℃/min速率升至300℃，保持10min，总运行时间为52-53min。

4.根据权利要求2所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，步骤(10)中GC/MS测定时采用的质谱条件为：电子轰击离子源，70ev，离子源温度300℃；接口温度：280℃，四级杆温度：180℃；溶剂延迟6min；扫描模式：选择离子监测。

5.根据权利要求1或2所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，所述的101种农药包括：叶蝉散、庚烯磷、仲丁威、残杀威、甲基内吸磷、灭线磷、二溴磷、氟乐灵、氟草胺、特丁硫磷、敌虫硫磷、乙拌磷、敌稗、α-HCH、林丹、β-HCH、δ-HCH、op"-DDE、pp"-DDE、op"-DDD、pp"-DDD、op"-DDT、pp"-DDT、五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、环氧七氯、顺式-氯丹、α-硫丹、反式-氯丹、狄试剂、异狄试剂、β-硫丹、硫丹硫酸酯、乐果、克百威、磷胺E、磷胺Z、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲基对硫磷、皮蝇硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、溴硫磷、灭芽磷、亚胺硫磷、乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、敌草索、草乃敌、异丙乐灵、除芽通、丁草胺、氟节胺、敌草胺、除草醚、异稻瘟净、三唑酮、三唑醇、稻瘟灵、菌核净、戊菌唑、毒虫畏、噻菌灵、灭菌丹、杀虫畏、丰索磷、噁霜灵、七氟菊酯、联苯菊酯、甲氧DDT、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、顺式-氯菊酯、反式-氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、四溴菊酯、顺式-氟氰菊酯、反式-氟氰菊酯、氰戊菊酯、顺式-氟胺氰菊酯、反式-氟胺氰菊酯、s-氰戊菊酯、溴氰菊酯、异菌脲、硫线磷、氯硝铵、水胺硫磷、苯霜灵、仲丁灵、二嗪磷、甲霜灵、毒死蜱、倍硫磷、乙基对硫磷、付杀硫磷、谷硫磷、乙基谷硫磷。

6.根据权利要求5所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，步骤(6)中将101种农药分成如下9组：

第1组13种：叶蝉散、庚烯磷、仲丁威、残杀威、甲基内吸磷、灭线磷、二溴磷、氟乐灵、氟草胺、特丁硫磷、敌虫硫磷、乙拌磷、敌稗；

第2组10种α-HCH、林丹、β-HCH、δ-HCH、op"-DDE、pp"-DDE、op"-DDD、pp"-DDD、op"-DDT、pp"-DDT；

第3组11种：五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、环氧七氯、顺式-氯丹、α-硫丹、反式-氯丹、狄试剂、异狄试剂、β-硫丹、硫丹硫酸酯；

第4组13种：乐果、克百威、磷胺E、磷胺Z、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲基对硫磷、皮蝇硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、溴硫磷、灭芽磷、亚胺硫磷；

第5组11种：乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、敌草索、草乃敌、异丙乐灵、除芽通、丁草胺、氟节胺、敌草胺、除草醚；

第6组12种：异稻瘟净、三唑酮、三唑醇、稻瘟灵、菌核净、戊菌唑、毒虫畏、噻菌灵、灭菌丹、杀虫畏、丰索磷、噁霜灵；

第7组10种：七氟菊酯、联苯菊酯、甲氧DDT、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、顺式-氯菊酯、反式-氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、四溴菊酯；

第8组10种：顺式-氟氰菊酯、反式-氟氰菊酯、氰戊菊酯、顺式-氟胺氰菊酯、反式-氟胺氰菊酯、s-氰戊菊酯、溴氰菊酯、异菌脲、硫线磷、氯硝铵；

第9组11种：水胺硫磷、苯霜灵、仲丁灵、二嗪磷、甲霜灵、毒死蜱、倍硫磷、乙基对硫磷、付杀硫磷、谷硫磷、乙基谷硫磷。

7.根据权利要求6所述同时测定烟草或烟草制品中101种农药残留的方法，其特征在于，第1组农药以氯唑磷为内标进行校正，第2-9组农药以灭蚁灵为内标进行校正。