CN108107135A - 测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法及其定量方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法，包括以下步骤：获取可食用花卉样品；提取步骤：向所述可食用花卉样品中加入乙腈，并加入柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠以及无水硫酸镁，使提取液的pH维持在4.5‑5.5的范围内进行盐析，然后离心分离，得到清液；净化步骤：向清液中加入分散萃取填料，涡旋净化，并离心，得到净化液；后续步骤：将净化液浓缩，再用丙酮定容到所需体积，过滤，即完成可食用花卉样品的前处理。本发明还涉及其定量方法，该方法分离良好专属性强，检出限和定量限足够低，线性范围良好，重复性好，准确可靠，可推广运用于日常多种可食用花卉监督检测当中。

Description

测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法及其定量方法和 试剂盒

技术领域

本发明涉及农药残留量测定技术领域，特别涉及测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法及其定量方法和试剂盒。

背景技术

国内外对于可食用花卉的研究，暂时只是基于可食用花卉的化合物成分，营养成分以及气味方面的研究。从可食用花卉植物中提取分离出来的化合物多具有抗氧化活性，具有显著的抑制自由基作用。如羧基自由基清除能力的化合物、酚类化合物，且所占比重相当大。相比于蔬菜水果，可食用花卉中通常带有挥发性或者半挥发性的成分，对农药残留色谱法检测产生干扰，且可食用花卉中农药残留含量较低，因此，假阳性、假阴性机率高。

可食用花卉的多种农药残留检测依据如下：NY/T 1506-2015绿色食品食用花卉，该方法对于可食用花卉的农药检测主要参照NY/T 761；GB/T 20769以及NY/T 1456等方法，该系列前处理方法仅参照蔬菜水果的方法，采取弗罗里硅藻土固相萃取方式进行净化，并未对于可食用花卉样品检测进行针对性的改良。

发明内容

基于此，有必要针对如何检测可食用花卉的多种农药残留量的问题，提供一种测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法及其定量方法和试剂盒。

一种测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法，包括以下步骤：

原料获取步骤：获取可食用花卉样品；

提取步骤：向所述可食用花卉样品中加入乙腈，并加入柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠以及无水硫酸镁，使提取液的pH维持在4.5-5.5的范围内进行盐析，然后分离，得到清液；

净化步骤：向所述清液中加入由碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑组成的分散萃取填料，涡旋净化，并离心，得到净化液；

后续步骤：将所述净化液浓缩，再用规定溶剂定容到所需体积，过滤，得前处理样品，即完成所述可食用花卉样品的前处理。

上述测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法具有较高的提取效率和净化效率，可以同时处理较多的样品，样品处理效率高，适用性较广。

具体地，通过采用柠檬酸钠、柠檬酸二钠组成缓冲体系，将提取液的pH维持在4.5-5.5的范围内，从而使得可食用花卉中的成分充分溶解，相比于传统的使用乙腈单一溶剂，提取效率有了很大提高，有利于后续农药残留量的定性和定量。另外，采用分散萃取填料(其包括：碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑)，除去样品中天然色素、多糖、蜡质或其他可挥发性活性成分，同时净化并浓缩样品，有利于后续定性和定量测量，相比于传统的使用单一的弗罗里硅藻土填料净化效率具有较大幅度的提高。且与传统的固相萃取方式相比，该分散萃取填料使用量少、快速，且能针对可食用花卉选择合适的净化方案，有效消除特殊样品的基质干扰。解决了可食用花卉按照常规检测方法出现回收率偏低的问题。因此，重现性高、准确性高。另外，由于上述方法所需仪器少，试剂用量小，试剂来源广泛，因此可以同时处理较多的样品，适用性广。

另外，传统的弗罗里硅藻土填料或氨基SPF柱固相萃取净化色谱杂质，需要反复氮气浓缩，操作使用的溶剂较多，对实验人员危害较大、过程复杂，样品处理效率低，且农药色谱分析的重现性、灵敏度不够等。而上述测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法无需反复氮气浓缩，使用溶剂少，对实验人员危害小；过程简单，对技术人员要求不高。

在其中一个实施例中，所述可食用花卉样品和乙腈的质量比为1：1～1：3；

所述可食用花卉样品与所述柠檬酸钠的质量比为10：0.8～10：1.2。

在其中一个实施例中，所述碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑的质量比为8：1：1～12：1：1。

在其中一个实施例中，所述碳18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑的质量比为10：1：1。

在其中一个实施例中，所述后续步骤中，将所述净化液浓缩的具体操作为：将所述净化液置于35℃-45℃的水浴锅中，用氮气吹，直至达到所需干燥程度。

一种测定可食用花卉中农药残留量的定量方法，包括以下步骤：

原料获取步骤：获取第一可食用花卉样品和第二可食用花卉样品，所述第一可食用花卉样品为含有待测农药的可食用花卉样品，所述第二可食用花卉样品是不含待测农药的可食用花卉样品；

提取步骤：向所述第一可食用花卉样品中加入乙腈，并加入柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠以及无水硫酸镁，使提取液的pH维持在4.5-5.5的范围内进行盐析，然后离心分离，得到清液；

净化步骤：向所述清液中加入分散萃取填料，涡旋净化，并离心，得到净化液，所述分散萃取填料包括：碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑；

后续步骤：将所述净化液浓缩，再用规定溶剂定容到所需体积，过滤，得前处理样品，即完成所述可食用花卉样品的前处理；

获取空白基质：将所述第二可食用花卉样品按与所述第一可食用花卉样品相同的方法进行处理，得到所述空白基质；

建立工作曲线步骤：向所述空白基质中加入所述待测农药的标准品溶液，并混合，建立工作曲线；

样品测定步骤：将所述第一前处理样品用气相色谱-串联质谱进行分析，根据出峰时间、定性离子对以及定量离子对确定各待测农药种类，并将可食用花卉样品的峰面积代入所述工作曲线中，即得到可食用花卉样品中各农药的含量。

上述测定可食用花卉中农药残留量的定量方法首先通过测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法对可食用花卉样品进行前处理，然后采用基质配标外标法定量的气相质谱联用仪器测定可食用花卉中的农药残留量。

由于与液相串联质谱不同，气相串联质谱的基质效应主要来自气相色谱部分，以增强型为主。基质效应不能被消除，上述方法通过基质配标准工作曲线，对基质效应进行校正，相比于传统的溶剂配标准工作曲线，其定量准确性较高。另外，上述方法根据农药的保留时间和离子丰度比值进行定性，定量离子进行定量，提高了方法的准确度。因此该方法重现性高、灵敏度高、准确性高。

另外，上述方法检出限和定量限足够低，线性范围良好，可以同时测定多个样品中的多种农药的残留量，因此上述方法样品处理效率高，适用性较广，可推广运用于日常多种可食用花卉监督检测当中。

在其中一个实施例中，所述气相色谱-串联质谱的条件为：

色谱柱为：30m*0.25μm*0.25mm；

升温程序为：在100℃保持2min，以20℃/min升温到180℃，再以8℃/min升温到300℃，保持10min，总共31min；

载气流速：1.0mL/min；进样口温度：230℃；传输线温度：280℃；电子轰击离子源；电子能量：70eV；进样量：1.0μL。

在其中一个实施例中，所述农药包括：有机磷农药、有机氯农药、有机氮农药、菊酯类农药以及苯基吡唑类农药。

上述方法除了对有机磷农药、有机氯农药、有机氮农药以及苯基吡唑类农药具有较高的准确性、灵敏性和重现性，其还可同时测定菊酯类农药，菊酯类农药是广谱性杀虫剂，是世界卫生组织推荐可用于防治卫生害虫及其媒介的农药，在花卉种植过程中被推广使用，由于其热稳定性良好，在液相质谱仪上的灵敏度不高，无法准确检测出其含量，而上述方法采用气相色谱-串联质谱仪，可以准确测出其含量。

一种用于上述的测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法或上述的测定可食用花卉中农药残留量的定量方法的试剂盒，包括：柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠、无水硫酸镁以及分散萃取填料。

该试剂盒包含使用该方法所必须的物质，可以与该方法配合使用。

在其中一实施例中，上述的试剂盒中的所述分散萃取填料由质量比为10：1：1的碳18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑混合而成。

该试剂盒中包含最佳配比的分散萃取填料，更方便与上述方法配合使用。

附图说明

图1为一实施例涉及的样品按本发明方法进行前处理后气相色谱-串联质谱仪显示的图；

图2为一实施例涉及的样品按NY/T 761-2008方法进行前处理后杀螟硫磷的气相色谱-串联质谱仪显示的图。

图3为一实施例涉及的样品按NY/T 761-2008方法进行前处理后马拉硫磷的气相色谱-串联质谱仪显示的图。

图4为一实施例涉及的样品按NY/T 761-2008方法进行前处理后氯丹的气相色谱-串联质谱仪显示的图。

图5为一实施例涉及的样品按NY/T 761-2008方法进行前处理后硫丹的气相色谱-串联质谱仪显示的图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行说明。

需要说明的是，本发明未注明具体来源的试剂或仪器，为市场购买的常规试剂或仪器。

实施例1

标准物质：待测农药

待测农药成分为：乐果、五氯硝基苯、杀螟硫磷、马拉硫磷、艾试剂、倍硫磷、三氯杀螨醇、甲基异柳磷、腐霉利、杀扑磷、反氯丹、硫丹1、顺氯丹、硫丹2、三唑磷、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯以及溴氰菊酯。

分析纯试剂：柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠、无水硫酸镁。

色谱纯试剂：乙腈、丙酮

分散萃取填料：乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、碳-18(C18)、石墨炭黑(GCB)

(1)样品的前处理

(a)提取步骤：取可食用花卉(鲜)样品约10g，于50mL聚乙烯离心管中，加乙腈20mL、4g无水硫酸镁、2g氯化钠、1g柠檬酸钠、0.5g三水合二柠檬酸二钠，涡旋提取，并离心，得到清液。

(b)净化步骤：取10mL步骤(a)所得到的清液，加入由1.0g C-18、0.1g PSA和0.1gGCB组成的分散萃取填料，涡旋净化并离心。

(c)后续步骤：取4mL净化后的提取液于40℃水浴中氮气吹至近干，然后用2mL丙酮定容，用0.22μm滤膜过滤，装瓶，准备上机。

(2)标准溶液的制备以及建立工作曲线

待测农药混合储备液：称取各标准物质适量，用丙酮溶解并稀释成浓度约为1mg/mL的储备液。

待测农药标准使用液：取储备液用丙酮稀释成浓度约50μg/mL的标准使用液。

获取空白基质：将不含待测农药的可食用花卉样品(即“空白”样品)按与上述含待测农药的可食用花卉样品相同的方法进行前处理，得到空白基质；

建立工作曲线：将空白基质与标准品溶液混合，形成混合液。建立工作曲线，对基质效应进行校正。

需要说明的是，上述待测农药的组分仅为实施例，待测农药可以是一种农药，也可以是多种农药的混合物，也可以为其他可测定的农药。

表1：色谱条件

(3)待测样品测定

上机数据采集：取标准溶液和样品溶液各1μL注入气相质谱仪，通过保留时间和离子丰度比定性、定量离子峰面积定量。

表2

结果判定：参照GB 2763-2016标准进行判定。

(4)方法验证

4.1分离度

从图1可以看出，按上述方法进行前处理后，各农药均具有较好的分离度。

4.2检出限和定量限

取标准溶液进行测试，以信噪比为3时候的浓度为检出限，信噪比为10时的浓度为定量限，结果如表3。

表3

4.3线性范围(μg/mL)

表4

4.4精密度

表5

4.5准确度

各称取三份混合均匀的样品10g(精确到0.001g)置于小烧杯中，按照下表加入标准溶液，按照(2)制备好供试液，进行测试，计算回收率。

表6

水平一加标回收率

(低浓度水平)

水平二加标回收率

(中浓度水平)

水平三加标回率

(高浓度水平)

(5)样品适用性

在市场购买了一批玫瑰花、桂花、菊花、茉莉花，木棉花、洛神花、鸡蛋花、金银花、玉兰花、百合花小心取下花蕾，搅拌匀浆，按照上述方法开展检测工作，并对其进行0.08mg/kg浓度进行加标回收实验，验证本项目方法优化后的样品适用性，结果如表7。

表7

从表3-表7可以看出，经过优化后的上述前处理方法进行处理，可食用花卉中目标农药化合物回收率达到80％-120％，24h内精密度和稳定性测试RSD≤10％，线性范围在1.0mg/kg-0.02mg/kg之间，检出限和定量限均能满足国家标准中对可食用花卉中农药残留限量的最低要求。

对比例1

在市场购买了一批生菜、青瓜、梨、玫瑰花、菊花等，分别按照NY/T 761-2008的前处理方法，气相色谱法定量，进行含量为0.08μg/mL的平行加标回收实验对比，平均回收率如下：

表8

从表8可以看出，NY/T 761-2008的前处理方法在蔬菜水果中的回收率均有80％以上，但在可食用花卉中的回收率普遍偏低，部分项目回收率仅有20％-50％。说明该方法并不能准确地检测出可食用花卉中农药残留量的真实值。

另外，如图2-图5(图2为杀螟硫磷，图3为马拉硫磷，图4为氯丹，图5为硫丹)所示，该方法的基质效应较大，基质标明显比溶剂标响应高。

对比实施例1和对比例1可以看出，本发明经过对可食用花卉样品进行QuEChERS净化方式优化，有效除去样品中的天然色素、多糖、蜡质或其他可挥发性活性成分，空白样品基质配标，利用气相质谱仪以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量同时测定多种农药残留量。

该方法分离良好专属性强，检出限和定量限足够低，线性范围良好，重复性好，准确可靠，可推广泛运用于日常多种可食用花卉监督检测当中。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

原料获取步骤：获取可食用花卉样品；

提取步骤：向所述可食用花卉样品中加入乙腈，并加入柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠以及无水硫酸镁，使提取液的pH维持在4.5-5.5的范围内进行盐析，然后分离，得到清液；

净化步骤：向所述清液中加入分散萃取填料，涡旋净化，并离心，得到净化液，所述分散萃取填料包括：碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑；

后续步骤：将所述净化液浓缩，再用规定溶剂定容到所需体积，过滤，得前处理样品，即完成所述可食用花卉样品的前处理。

2.根据权利要求1所述的测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法，其特征在于，所述可食用花卉样品和乙腈的质量比为1：1～1：3；

所述可食用花卉样品与所述柠檬酸钠的质量比为10：0.8～10：1.2。

3.根据权利要求1所述的测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法，其特征在于，所述碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑的质量比为8：1：1～12：1：1。

4.根据权利要求3所述的测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法，其特征在于，所述碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑的质量比为10：1：1。

5.根据权利要求1所述的测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法，其特征在于，所述后续步骤中，将所述净化液浓缩的具体操作为：将所述净化液置于35℃-45℃的水浴锅中，用氮气吹，直至达到所需干燥程度。

6.一种测定可食用花卉中农药残留量的定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

原料获取步骤：获取第一可食用花卉样品和第二可食用花卉样品，所述第一可食用花卉样品为含有待测农药的可食用花卉样品，所述第二可食用花卉样品是不含待测农药的可食用花卉样品；

提取步骤：向所述第一可食用花卉样品中加入乙腈，并加入柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠以及无水硫酸镁，使提取液的pH维持在4.5-5.5的范围内进行盐析，然后离心分离，得到清液；

净化步骤：向所述清液中加入由碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑组成的分散萃取填料，涡旋净化，并离心，得到净化液；

后续步骤：将所述净化液浓缩，再用规定溶剂定容到所需体积，过滤，得前处理样品，即完成所述可食用花卉样品的前处理；

获取空白基质：将所述第二可食用花卉样品按与所述第一可食用花卉样品相同的方法进行前处理，得到所述空白基质；

建立工作曲线步骤：向所述空白基质中加入待测农药的标准品溶液，并混合，建立工作曲线；

样品测定步骤：将所述前处理样品用气相色谱-串联质谱进行分析，根据出峰时间、定性离子对以及定量离子对确定各待测农药种类，并将可食用花卉样品的峰面积代入所述工作曲线中，即得到可食用花卉样品中各农药的含量。

7.根据权利要求6所述的测定可食用花卉中农药残留量的定量方法，其特征在于，所述气相色谱-串联质谱的条件为：

色谱柱为：30m*0.25um*0.25mm；

升温程序为：在100℃保持2min，以20℃/min升温到180℃，再以8℃/min升温到300℃，保持10min，总共31min；

载气流速：1.0mL/min；进样口温度：230℃；传输线温度：280℃；电子轰击离子源；电子能量：70eV；进样量：1.0μL。

8.根据权利要求6所述的测定可食用花卉中农药残留量的定量方法，其特征在于，所述农药包括：有机磷农药、有机氯农药、有机氮农药、菊酯类农药以及苯基吡唑类农药。

9.一种用于权利要求1-5任一项所述的测定可食用花卉中农药残留量的前处理方法或权利要求6-8任一项所述的测定可食用花卉中农药残留量的定量方法的试剂盒，其特征在于，包括：柠檬酸钠、柠檬酸二钠、氯化钠、无水硫酸镁以及分散萃取填料。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述分散萃取填料由质量比为10：1：1的碳-18、乙二胺-N-丙基硅烷以及石墨炭黑混合而成。