CN103123345A

CN103123345A - 一种快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法

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Publication number: CN103123345A
Application number: CN2013100464478A
Authority: CN
Inventors: 陶晓秋; 熊巍; 张海燕; 韶济民; 庞夙; 杨雪; 黄玫; 李斌
Original assignee: SICHUAN PROVINCE Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp
Current assignee: SICHUAN PROVINCE Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2033-02-06
Also published as: CN103123345B

Abstract

本发明公开一种快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，包括提取土壤中的目标物、N-丙基乙二胺纯化、标准储备液和标准工作液的配制、液相色谱-串联质谱测定四个步骤。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对植烟土壤样本优化了酶解条件、固相萃取条件，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与传统的气相色谱比较，采用基质分散固相萃取法来检测麦草畏，2，4-D和2，4，5-T。简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。

Description

一种快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法

技术领域

本发明属于农药残留检验技术领域，具体涉及土壤中的苯氧乙酸类除草剂残留量的测定方法，特别涉及植烟土壤中麦草畏，2，4-D和2，4，5-T残留量的检测方法。

背景技术

苯氧羧酸类除草剂农药，如：麦草畏、2，4-D、2，4，5-T等，是第一类投入商业生产的选择性除草剂，广泛施用于禾谷类作物田、针叶树林和牧草场等。麦草畏，2，4-D和2，4，5-T都为低毒除草剂，通过植物叶面、茎杆和根系吸收传导，阻碍植物激素的正常传导，从而使其死亡。但在使用过程中，结果表明此类物质可以引起人类软组织恶性肿瘤，对动物体表现出胎盘毒性，其中2，4-D和2，4，5-T被认为是环境内分泌干扰物。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）的农用化学品咨询委员会(ACAC)在2008年制定的118种农用化学品指导性残留限量表中将麦草畏、2，4-D和2，4，5-T等苯氧羧酸类的限量分别定为0.20mg/kg，0.20mg/kg和0.05mg/kg。

对于地表水、谷物、蔬果以及纺织品中苯氧羧酸类除草剂残留的检测已有相关报道，而对于土壤中苯氧羧酸除草剂农药残留的检测方法主要有薄层扫描法、毛细管电泳结合紫外检测器检测/气相色谱-质谱法(GC-MS)。薄层扫描法和毛细管电泳法的选择性不强，检出限有较高，对于土壤中极低含量的苯氧羧酸类除草剂检测不太适用。GC-MS法在选择性和灵敏度上要优于前两种方法，但是麦草畏、2，4-D和2，4，5-T不易气化，GC-MS检测中需要衍生化，且其容易残留在色谱柱固定相上，从而干扰检测。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）是近30年发展起来的检测技术，其在水果，纺织品以及谷物中的麦草畏、2，4-D和2，4，5-T残留检测中已有应用，而在土壤中麦草畏、2，4-D和2，4，5-T残留的检测还未见报道。超高效色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）是最新的检测仪器，其选取的亚微米色谱柱填料，使得柱子的分离度显著提高，可以明显缩短检测时间，提高检测通量。

因此UPLC-MS/MS法在农残检测的灵敏度以及选择性方面都明显优于传统方法，在分析速度方面优于普通的LC-MS/MS法。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种前处理简单、检测时间短，利于高通量样品的快速准确的苯氧乙酸类除草剂特别是麦草畏，2，4-D和2，4，5-T残留量的检测方法。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，所述苯氧乙酸类除草剂包括麦草畏，2，4-D和2，4，5-T，该方法包括以下步骤：

1）提取土壤中的目标物

称取烘干磨好的土壤样品，加入纯水浸润，依次加入氘代内标，乙腈和甲酸，涡漩混合振荡；放入冰箱冷冻后取出，依次加入无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，涡旋振荡后离心；

2）N-丙基乙二胺（PSA）纯化

移取上清液于新的离心管中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，于漩涡振荡混合，然后高速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用乙腈和超纯水稀释后待测；

3）标准储备液和标准工作液的配制

用乙腈配置麦草畏、2，4-D和2，4，5-T标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合标准储备液（10g/mL）。

用乙腈准确配置麦草畏-d₃，2，4-D-d₃和2，4，5-T-d₂氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液（10g/mL）；所有的储备液于冰箱-20℃，使用前将其恢复到室温；

用空白土壤样品的萃取基质配制不同浓度的麦草畏、2，4-D和2，4，5-T标准工作溶液；

4）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定：吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的麦草畏、2，4-D和2，4，5-T标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中麦草畏，2，4-D和2，4，5-T含量。

优选地，所述土壤样品的重量为2g。

优选地，所述冷冻的时间为10min，冷冻温度为-18至-15℃。

优选地，步骤1）中提取过程依次加入的超纯水，氘代内标(10g/mL)，乙腈和甲酸(49-51%)的体积分别为10mL，20L，10mL和200L；涡旋振荡（2000rpm）1min；离心管在-10℃条件下保持10min；依次加入的无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g，1g，1g和0.5g；然后漩涡混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，离心（4000rpm）时间为10min。

优选地，步骤2）中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。

优选地，步骤2）中移取滤液体积为200L，加入乙腈和超纯水的体积为100L和700L。

优选地，步骤4）中选取70%甲酸水(体积分数0.05%)和30%乙腈初始流动相体系，分析时间为4min，进样量为10μL。

优选地，步骤4）中梯度洗脱条件为梯度洗脱条件：0~2min，70%A~10%A；2~3.5min，10%A~10%A；3.5~3.51min，10%A~70%A；3.51~4.00min，70%A~70%A；流动相流速为07mL/min。

优选地，步骤4）串联质谱检测器的条件：ESI-，喷雾电压（IS）：2.6kV，雾化气流量：800L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集。

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对植烟土壤样本优化了酶解条件、固相萃取条件，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

与传统的气相色谱比较，采用基质分散固相萃取法来检测麦草畏，2，4-D和2，4，5-T。简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。

由于选取了超高效液相色谱柱，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩短。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的除草剂残留的测定。

选取了三个化合物的氘代标准品对麦草畏，2，4-D和2，4，5-T进行定量，使得方法的准确性更高，有效消除基质干扰和前处理过程中引起的误差。

改进了传统的基质分散固相萃取法，在提取苯氧羧酸的过程中加入甲酸，使得提取效率更高。

改进传统的提取过程，在加入分散萃取剂前，放入冰箱冷冻10min，此方法可以避免分散固相萃取剂结块，从而可以提高萃取效率。

萃取后的样品在进样前稀释五倍进行检测，既可以降低基质效应，又避免损失灵敏度。

待测样品中加入乙腈和纯水，使得其乙腈和水比例达到初始流动相的比例，有利于改善UPLC色谱峰型。

本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

附图说明

图1是麦草畏串联质谱子离子质谱图。

图2是麦草畏-d₃串联质谱子离子质谱图。

图3是2，4-D串联质谱子离子质谱图。

图4是2，4-D-d₃串联质谱子离子质谱图。

图5是2，4，5-T串联质谱子离子质谱图。

图6是2，4，5-T-d₂串联质谱子离子质谱图。

图7是麦草畏选择离子色谱图（定量离子对，20ng/mL）。

图8是麦草畏选择离子色谱图（定性离子对，20ng/mL）。

图9麦草畏-d₃选择离子色谱图（内标离子对，20ng/mL）。

图10是2，4-D选择离子色谱图（定量离子对，20ng/mL）。

图11是2，4-D选择离子色谱图（定性离子对，20ng/mL）。

图12是2，4-D-d₃选择离子色谱图（内标离子对，20ng/mL）。

图13是2，4，5-T选择离子色谱图（定量离子对，20ng/mL）。

图14是2，4，5-T选择离子色谱图（定性离子对，20ng/mL）。

图15是2，4，5-T-d₂选择离子色谱图（内标离子对，20ng/mL）。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例进行说明。参见图1至图15。

1．仪器与试剂

Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配备电喷雾电离源（ESI）；VtexMixer230VeU振荡器（美国Labnet公司）；Sigma3K15离心机(德国Sigma公司)。

甲酸为HPLC级(浓度为49-51%，德国Sigma公司)；乙腈，甲醇均为色谱纯（美国Thermo-Fisher公司）；麦草畏、2，4-D和2，4，5-T标准品来自于Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度：98.5%，Augsburg，德国），内标麦草畏-d₃，2，4-D-d₃来自于Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度：99%，同位素纯度：98.5%，Augsburg，德国）2，4，5-T-d₂购自CDN Isotopes Inc.（化学纯度：99%，同位素纯度：99%，Quebec Canada）。N-丙基乙二胺（PSA）吸附剂、末尾封端碳18（C18E）吸附剂，水为超纯水。

2．提取植烟土壤中的分析物

准确称取2g样品（精确至0.01g）于50mL具盖离心管中，加入10mL水，振荡直至样品被水充分浸润。冷冻10min后移取10mL乙腈至离心管中，加入200L甲酸，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡1min。将离心管置于0℃条件下保持10min，然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min，然后以4000rpm速率离心10min。

3.PSA纯化

移取上清液1.0mL于1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁及25mgPSA吸附剂，于漩涡混合振荡仪上以2000rpm速率振荡2min，以6000rpm速率离心2min。吸取上清液经0.22m有机相滤膜过滤，移取200L，用超纯水稀释至1.0mL，待测。

4.液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定

（1）LC-MS/MS条件

色谱条件：Atiantis UPLC BEH Shield RP18(50mm×2.1mm，1.7um，美国Waters公司)；流动相A：0.05%甲酸水溶液（体积分数），流动相B：乙腈；流速0.7mL/min；柱温45°C；进样量10μL。梯度洗脱条件：0~2min，70%A~10%A；2~3.5min，10%A~10%A；3.5~3.51min，10%A~70%A；3.51~4.00min，70%A~70%A。

质谱条件:电喷雾离子源，喷雾电压（IS）：2.6kV，雾化气流量：800L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量（CE）见表1。

表1多反应监测模式下三种苯氧羧酸类除草剂及其氘代内标的部分质谱参数

^*quantification ion pairs．

（2）标准储备液的配制

储备液及工作液的配制：用乙腈准确配置麦草畏（1.00mg/mL），2，4-D（1.14mg/mL），和2，4，5-T（1.02mg/mL）标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合标准储备液（10g/mL）。

用乙腈准确配置麦草畏-d₃（0.67mg/mL），2，4-D-d₃（0.55mg/mL）和2，4，5-T-d₂（0.95mg/mL）氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液（10g/mL）。所有的储备液于冰箱-20℃，使用前将其恢复到室温。

（3）麦草畏，2，4-D和2，4，5-T含量的测定

吸取配制好的不同浓度的麦草畏，2，4-D和2，4，5-T的混合标准工作溶液各10μL，注入LC-MS/MS；麦草畏，2，4-D和2，4，5-T的线性回归方程分别为y=1.0293x-4.59179，y=0.101124x+0.517632和y=1.08681x-3.28638，其中y代表分析物与内标峰面积的比值，x表示植烟土壤中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中麦草畏，2，4-D和2，4，5-T的含量。

（4）该方法的线性范围和检出限

分别移取混合标准储备液0L，10L，20L，50L，100L1g/mL混合标液和20L，50L及100L10g/mL混合标液到8个10mL容量瓶中，每个容量瓶移入20uL混合氘代内标工作液（1g/mL），加入200L空白烟叶样品萃取液，用纯水定容至1mL。各标准工作溶液的浓度分别为0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL。分别对这些标准溶液进行LC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见表5。结果表明，各种化合物线性关系良好(相关系数r>0.99)，可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限，详见表2。混合标准品及加标样品的总离子流色谱图见图4。

表2三种除草剂的线性范围、相关系数、检测限及保留时间

。

（5）本发明方法的重复性和加标回收率：

在空白的烤烟样品中添加一定量的麦草畏，2，4-D和2，4，5-T标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本实验选用高、中、低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，计算5次结果的平均值为87.6%~113.7%。方法的精密度以回收率的相对标准偏差(RSD)来评价，对同一样品平行测定5次，3种化合物回收率的RSD范围为1.7%~10.4%，结果见表3。

表3植烟土壤中三种除草剂的回收率和精密度(n=5)

。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，所述苯氧乙酸类除草剂是指麦草畏，2，4-D和2，4，5-T，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）提取土壤中的目标物

2）N-丙基乙二胺纯化

3）标准储备液和标准工作液的配制

用乙腈配置麦草畏、2，4-D和2，4，5-T标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合标准储备液；

用乙腈准确配置麦草畏-d₃，2，4-D-d₃和2，4，5-T-d₂氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液；所有的储备液于冰箱-20℃，使用前将其恢复到室温；

2.根据权利要求1所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，所述土壤样品的重量为2g。

3.根据权利要求2所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，所述冷冻的时间为10min，冷冻温度为-18至-15℃。

4.根据权利要求3所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，步骤1）中提取过程依次加入的超纯水，氘代内标，乙腈和甲酸的体积分别为10mL，20L，10mL和200L；涡旋振荡1min；离心管在-10℃条件下保持10min；依次加入的无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g，1g，1g和0.5g；然后漩涡混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，离心时间为10min。

5.根据权利要求3所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，步骤2）中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。

6.根据权利要求3所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，步骤2）中移取滤液体积为200L，加入乙腈和超纯水的体积为100L和700L。

7.根据权利要求3所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，步骤4）中选取70%甲酸水和30%乙腈初始流动相体系，分析时间为4min，进样量为10μL。

8.根据权利要求7所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，步骤4）中梯度洗脱条件为梯度洗脱条件：0~2min，70%A~10%A；2~3.5min，10%A~10%A；3.5~3.51min，10%A~70%A；3.51~4.00min，70%A~70%A；流动相流速为0.7mL/min。

9.根据权利要求8所述的快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法，其特征在于，步骤4）串联质谱检测器的条件：ESI-，喷雾电压：2.6kV，雾化气流量：800L/Hr；锥孔气流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集。