CN103175911B

CN103175911B - 一种烟草中2,4,5-t残留量的测定方法

Info

Publication number: CN103175911B
Application number: CN201310046613.4A
Authority: CN
Inventors: 陶晓秋; 熊巍; 庞夙; 杨雪; 张海燕; 韶济民; 黄玫; 李晨曦
Original assignee: SICHUAN PROVINCE Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp
Current assignee: SICHUAN PROVINCE Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp; China National Tobacco Corp Sichuan Branch
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2033-02-06
Also published as: CN103175911A

Abstract

本发明公开一种烟草中2，4，5-T残留量的测定方法，该方法包括提取烟草中的目标物、PSA纯化、配制标准储备液和标准工作液、液相色谱-串联质谱测定四个主要哦步骤。与传统的气相色谱法比较，本发明可以减少样品前处理过程中引起的误差、超高效液相色谱柱的使用可以显著降低方法的分析时间，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性、选取了基质配标的方法，比纯水配标准品法有更好的准确性，能够消除基质效应的干扰。对复杂基质的烟草样本，基质配标和串联质谱以及氘代内标定量的使用，能够有效的提高方法的选择性与灵敏度。通过色谱柱以及梯度洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。

Description

一种烟草中2,4,5-T残留量的测定方法

技术领域

本发明属于农药残留检验技术领域，具体涉及烟草中2，4，5-T残留量的测定方法。

背景技术

2，4，5-T是第一类投入商业生产的选择性除草剂，广泛施用于禾谷类作物田、针叶树林和牧草场等。2，4，5-T都为低毒除草剂，通过植物叶面、茎杆和根系吸收传导，阻碍植物激素的正常传导，从而使其死亡。但在使用过程中，结果表明此类物质可以引起人类软组织恶性肿瘤，对动物体表现出胎盘毒性。CORESTA的农用化学品咨询委员会(ACAC)在2008年制定的118种农用化学品指导性残留限量表中将2，4，5-T的限量定为0.05mg/kg。

对于水、土壤、蔬果以及纺织品中2，4，5-T残留的检测已有相关报道，而对于烟草中有机氯除草剂农药残留的检测报道较少。刘惠民等研究开发了非水相毛细管电泳法测定烟草中的麦草畏，2，4，-D和2，4，5-T残留，其中2，4，5-T的检出限为0.50μg/mL，烟草样品经乙酸乙酯超声萃取，凝胶渗透色谱净化后，进入毛细管电泳仪检测分析。宋娟梅等改进报道的毛细管电泳法，采用正交法设计实验，优化毛细管电泳法，并将优化好的方法应用于烟草中麦草畏、2，4-D和2，4，5-T的测定。烟草行业也于2004年制定了相应的行业标准，其中麦草畏、2，4-D和2，4，5-T选取盐酸水溶液萃取，旋转蒸发浓缩，三甲基氢氧化锍衍生化，GC-MS分析，其前处理复杂费时，检测时间较长，不利于高通量样品的快速准确检测。非水非水相毛细管电泳法的检测限较高，不能满足限量标准的要求，对于含量较低的烟叶样本的测定存在一定的局限性。

超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）在农残检测的灵敏度以及选择性方面都明显优于传统方法，在分析速度方面优于普通的HPLC方法，而目前未见该检测方法应用检测烟草中的2，4，5-T残留量。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种前处理简单、检测时间短，利于高通量样品的快速准确的2，4，5-T残留量的测定方法。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种烟草中2，4，5-T残留量的测定方法，该方法包括以下步骤：

1）提取烟草中的目标物

称取烘干磨好的烟叶样品，加入纯水浸润，依次加入氘代内标、乙腈和甲酸，涡漩混合振荡，放入冰箱冷冻后取出，依次加入无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，涡旋振荡后离心，移取上清液于新的离心管中；

2）N-丙基乙二胺（PSA）纯化

在盛有上清液的离心管中加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，于漩涡振荡混合，然后高速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用乙腈和超纯水稀释后待测；

3）标准储备液和标准工作液的配制

用乙腈配置2，4，5-T标准储备液，储存于不透明玻璃瓶中，-20℃保存。

用乙腈准确配置2，4，5-T-d2氘带内标标准储备液，储存于不透明玻璃瓶中，-20℃保存，使用前将其恢复到室温。

用国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）空白烟叶的萃取基质配制不同浓度的2，4，5-T标准工作溶液；

（4）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定：吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的2，4，5-T标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中2，4，5-T含量。

优选地，所述烟叶的重量为2g。

优选地，步骤1）中所述冷冻时间为10min，冷冻温度为-18至-15℃。

优选地，步骤1）中提取过程依次加入的超纯水、氘代内标(10g/mL)、乙腈和甲酸(49-51%)的体积分别为10mL，20μL，10mL和200μL，速率涡旋振荡（2000rpm）1min；离心管在-10℃条件下保持10min；依次加入的无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g，1g，1g和0.5g；然后漩涡混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，离心（4000rpm）时间为10min。

优选地，步骤2）中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。

优选地，步骤2）中移取滤液体积为200μL，加入乙腈和超纯水的体积为100μL和700μL。

优选地，步骤4）中选取70%体积分数0.05%的甲酸水和30%乙腈初始流动相体系，分析时间为4min，进样量为10μL。

优选地，步骤4）中梯度洗脱条件为：0～2min，70%A～10%A；2～3.5min，10%A～10%A；3.5～3.51min，10%A～70%A；3.51～4.00min，70%A～70%A；流动相流速为0.7mL/min。

优选地，步骤4）中串联质谱检测器的条件：ESI-，喷雾电压（IS）：2.6kV，雾化气流量：800L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集。

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样本优化了前处理条件，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

选取了基质分散固相萃取方式来处理样品，简化了前处理过程。

在乙腈萃取过程中加入乙酸，有助于提高2，4，5-T这类苯氧羧酸类化合物的萃取效率。

在加入硫酸镁和氯化钠之前，放入冰箱冷冻一段时间，可以防止其加入后过热结块。

与传统的气相色谱比较，采用基质分散固相萃取法来检测2，4，5-T。简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。

与HPLC方法相比，由于选取了超高效液相色谱柱RP18(50mm×2.1mm，1.7um)，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩短。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的除草剂残留的测定。

选取了氘代2，4，5-T对2，4，5-T进行定量，有效消除基质干扰和前处理过程中引起的误差，使得方法的准确性更高。

选取了两个离子对，定量离子对定量，定性离子对确认，可以提高方法的准确度。

本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

附图说明

图1是2，4，5-T的子离子质谱图。

图2是2，4，5-T-d₂的子离子质谱图。

图3是加标样品的选择离子流色谱图（50ng/mL，定量离子对）。

图4是加标样品的选择离子流色谱图（50ng/mL，定性离子对）。

图5是2，4，5-T-d₂的选择离子流色谱图（20ng/mL）。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例进行说明。参见图1至图5。

1.仪器与试剂

Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配备电喷雾电离源（ESI）；VtexMixer230VeU振荡器（美国Labnet公司）；Sigma3K15离心机(德国Sigma公司)。

甲酸为HPLC级(浓度为49-51%，德国Sigma公司)；乙腈，甲醇均为色谱纯（美国Thermo-Fisher公司）；2，4，5-T标准品来自于Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度：98.5%，Augsburg，德国），内标2，4，5-T-d2来自于购自CDN Isotopes Inc.（化学纯度：99%，同位素纯度：99%，Quebec Canada）。N-丙基乙二胺（PSA）吸附剂、末尾封端碳18（C18E）吸附剂，水为超纯水。

2.提取烟草中的分析物

准确称取2g样品（精确至0.01g）于50mL具盖离心管中，加入10mL水，振荡直至样品被水充分浸润。冷冻10min后移取10mL乙腈至离心管中，加入200L甲酸，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡1min。将离心管置于0℃条件下保持10min，然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min，然后以4000rpm速率离心10min。

3.PSA纯化

移取上清液1.0mL于1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁及25mgPSA吸附剂，于漩涡混合振荡仪上以2000rpm速率振荡2min，以6000rpm速率离心2min。吸取上清液经0.22m有机相滤膜过滤，移取200L，用超纯水稀释至1.0mL，待测。

4.液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定

（1）LC-MS/MS条件：

色谱条件：Atiantis UPLC BEH Shield RP18(50mm×2.1mm，1.7um，美国Waters公司)；流动相A：0.05%甲酸水溶液（体积分数），流动相B：乙腈；流速0.7mL/min；柱温45℃；进样量10μL。梯度洗脱条件：0～2min，70%A～10%A；2～3.5min，10%A～10%A；3.5～3.51min，10%A～70%A；3.51～4.00min，70%A～70%A。

质谱条件:电喷雾离子源，喷雾电压（IS）：2.6kV，雾化气流量：800L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量（CE）见表1。

表1多反应监测模式下2，4，5-T及其氘代内标的部分质谱参数

*quantification ion pairs。

（2）标准储备液的配制

储备液及工作液的配制：用乙腈准确配置2，4，5-T（1.02mg/mL）标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得标准储备液（10g/mL）。

用乙腈准确配置2，4，5-T-d₂（0.95mg/mL）氘代内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液（10g/mL）。所有的储备液于冰箱-20℃，使用前将其恢复到室温。

（3）2，4，5-T含量的测定

吸取配制好的不同浓度的2，4，5-T的混合标准工作溶液各10μL，注入LC-MS/MS；2，4，5-T的线性回归方程分别为y=0.0231x-0.00714，其中y代表分析物与内标峰面积的比值，x表示烟草中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中2，4，5-T的含量。

（4）该方法的线性范围和检出限

分别移取混合标准储备液0μL，10μL，20μL，50μL，100μL1g/mL混合标液和20μL，50μL及100μL10g/mL混合标液到8个10mL容量瓶中，每个容量瓶移入20uL混合氘代内标工作液（1g/mL），加入200μL空白烟叶样品萃取液，用纯水定容至1mL。各标准工作溶液的浓度分别为0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL。分别对这些标准溶液进行LC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见表5。结果表明，2，4，5-T线性关系良好(相关系数r>0.998)，可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限，详见表2。混合标准品及加标样品的总离子流色谱图见图4。

表22，4，5-T的线性范围、相关系数、检测限及保留时间

（5）本发明方法的重复性和加标回收率

在空白的烤烟样品中添加一定量的2，4，5-T标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本实验选用高、中、低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，计算5次结果的平均值为87.6%～99.5%。方法的精密度以回收率的相对标准偏差(RSD)来评价，对同一样品平行测定5次，2，4，5-T回收率的RSD范围为4.0%～10.4%，结果见表3。

表3烟草中2，4，5-T的回收率和精密度(n=5)

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.测定烟草中2，4，5-T残留量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)提取烟草中的目标物

2)N-丙基乙二胺纯化

3)标准储备液和标准工作液的配制

用乙腈配置2，4，5-T标准储备液，储存于不透明玻璃瓶中，-20℃保存，

用乙腈准确配置2，4，5-T-d₂氘带内标标准储备液，储存于不透明玻璃瓶中，-20℃保存，使用前将其恢复到室温，

用国际烟草科学研究合作中心空白烟叶的萃取基质配制不同浓度的2，4，5-T标准工作溶液；

(4)液相色谱-串联质谱测定：吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的2，4，5-T标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中2，4，5-T含量；采用BEH Shield RP18色谱柱，规格为：50mm×2.1mm，1.7μm；以70％流动相A和30％流动相B初始流动相体系，分析时间为4min，进样量为10μL，流动相A为体积分数0.05％的甲酸水，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件为：0～2min，70％A～10％A；2～3.5min，10％A～10％A；3.5～3.51min，10％A～70％A；3.51～4.00min，70％A～70％A；流动相流速为0.7mL/min；串联质谱检测器的条件：ESI-，喷雾电压：2.6kV，雾化气流量：800L/Hr；锥孔气流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集。

2.根据权利要求1所述的测定烟草中2，4，5-T残留量的方法，其特征在于，所述烟叶的重量为2g。

3.根据权利要求2所述的测定烟草中2，4，5-T残留量的方法，其特征在于，步骤1)中所述冷冻时间为10min，冷冻温度为-18至-15℃。

4.根据权利要求3所述的测定烟草中2，4，5-T残留量的方法，其特征在于，步骤1)中提取过程依次加入的超纯水、氘代内标、乙腈和甲酸的体积分别为10mL，20μL，10mL和200μL，速率涡旋振荡1min；离心管在-10℃条件下保持10min；依次加入的无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g，1g，1g和0.5g；然后漩涡混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，离心时间为10min。

5.根据权利要求3所述的测定烟草中2，4，5-T残留量的方法，其特征在于，步骤2)中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。

6.根据权利要求3所述的测定烟草中2，4，5-T残留量的方法，其特征在于，步骤2)中移取滤液体积为200μL，加入乙腈和超纯水的体积为100μL和700μL。