CN116990408A - 一种快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农药残留检测技术领域，特别是涉及一种快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，即检测吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的方法。通过检测动物源食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量，进一步计算得到精吡氟禾草灵残留量；所述动物源食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量检测方法为：向待检测动物源食品中加入乙腈，超声研磨后再离心得上清液，取上清液净化后过有机滤膜，而后将过滤后上清液经高效液相色谱串联质谱定量和/或定性来完成对样品中吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的检测。本发明首次建立动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的检测方法，通过建立一种高效液相色谱串联质谱法快速检测动物源性食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量，进而计算出精吡氟禾草灵的残留量。本方法简单方便、易于操作，能够满足吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在动物源性食品中的快速检测和精准确证的要求。
Description
技术领域
本发明属于农药残留检测技术领域，特别是涉及一种快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，即检测吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的方法。
背景技术
精吡氟禾草灵(fluazifop-P-butyl)，化学名称：(R)-2-[4-(5-三氟甲基-2-吡啶氧基)苯氧基]丙酸丁酯，由日本石原产业公司研制，并与ICI(现为Syngenta公司)共同开发，1983年上市的一种脂肪酸合成抑制剂，抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的合成。其作用方式主要通过叶片吸收，水解成吡氟禾草酸，在木质部和韧皮部传导。精吡氟禾草灵作为一种芳氧苯氧丙酸类除草剂，主要登记于冬油菜、大豆、棉花、甜菜和花生等作物，用于防治其田间杂草。
精吡氟禾草灵残留物为吡氟禾草灵和吡氟禾草酸之和(GB 2763-2021)，故本发明检测精吡氟禾草灵的残留量，即是对吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的检测。因为精吡氟禾草灵是吡氟禾草灵的有效体(R)，所以本发明中吡氟禾草灵的检测方法同样适用于精吡氟禾草灵的检测。
目前国内已报道的关于精吡氟禾草灵残留检测的文章极少，且分析对象均属于植物源性食品类。动物源性食品是可食用的动物组织以及蛋和奶，该食品中样品净化需去除的杂质脂肪和蛋白含量高，由于动物源性食品与植物源性食品物质组成有较大差异，一般不能简单将植物源食品检测方法转移到动物源食品上检测。目前国内尚无关于动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的检测方法，因此，发明一种快速高效检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，即检测吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，填补了其在生牛乳、鸡肉和猪肝等动物源性食品中农药残留检测方法的空白。该方法操作简便，提取效果好，分析时间短，具有快速、准确、高效的特点。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，通过检测动物源食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量，进一步计算得到精吡氟禾草灵残留量；所述动物源食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量检测方法为：向待检测动物源食品中加入乙腈，超声研磨后再离心得上清液，取上清液净化后过有机滤膜，而后将过滤后上清液经高效液相色谱串联质谱定量和/或定性来完成对样品中吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的检测。
高效液相色谱串联质谱测定数据由吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准曲线获得其含量；其中，标准曲线的绘制以吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准品混合配得吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，而后配制成不同浓度的一系列混合标准溶液，对所得不同浓度的混合标准溶液采用色谱条件进样检测，而后以混合标准溶液质量浓度为横坐标、对应的监测离子峰面积为纵坐标，作标准曲线。
所述高效液相色谱串联质谱检测条件为：
高效液相色谱条件：Agilent Extend-C18 50×2.1mm 3.5um色谱柱，洗脱液为乙腈和水(含0.1％甲酸)溶液，柱温为35.0℃，流速为0.400mL/min，进样量为5.00μL；
质谱条件为：电喷雾离子源AJS ESI，干燥气温度为280℃，干燥气流速为7L/min，正、负离子喷雾电压为3500V，雾化气(氮气)压力为35psi，鞘气温度为325℃，鞘气流速为11L/min，毛细管电压为3500V，多重反应监测(MRM)。
高效液相色谱串联质谱检测，正离子模式扫描吡氟禾草灵，保留时间为1.778min；负离子模式扫描吡氟禾草酸，保留时间为1.378min。
向待检测动物源食品中加入乙腈，放入研磨珠，先超声提取，再研磨，然后加入氯化钠，漩涡混匀后离心，取上清液加入PSA和C18，漩涡混匀后，取上清液过0.22μm有机系滤膜，待用。
(1)储备液的配制：分别取吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准品用乙腈溶解配得吡氟禾草灵和吡氟禾草酸储备液；
(2)样品前处理：取待检测动物源食品加入乙腈，放入研磨珠，先超声提取，再于高通量组织研磨仪研磨，然后加入氯化钠，漩涡混匀后离心，取上清液加入PSA和C18，漩涡混匀后取上清液过0.22μm有机系滤膜，待高效液相色谱串联质谱检测；
(3)标准工作溶液的配制：取吡氟禾草灵储备液和吡氟禾草酸储备液混合，配得吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，将动物源食品空白样品按上述步骤(2)前处理提取、净化后，用于稀释吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，对所得不同浓度的混合标准溶液采用液质条件进样检测，而后以混合标准溶液质量浓度为横坐标、对应的监测离子峰面积为纵坐标，作标准曲线；
(4)将步骤(2)处理后的待检测动物源食品溶液经高效液相色谱串联质谱检测，由标准曲线得到吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在待检测动物源食品中的残留量，通过计算得到精吡氟禾草灵的残留量。
进一步的步骤(2)样品前处理：取待检测动物源食品加入乙腈，放入15mm研磨珠，先超声提取10min，再于高通量组织研磨仪以1000次/min研磨5min，然后加入氯化钠，漩涡混匀约30秒后离心，5000r/min，离心3min，取上清液加入PSA和C18，漩涡混匀约30秒后取上清液过0.22μm有机系滤膜，待高效液相色谱串联质谱检测；
所述动物源食品为生牛乳、鸡肉、猪肝、鸡蛋、鸡肝、猪肉和猪脂肪。
生牛乳与乙腈的用量比(g/mL)为1：1-1：10；鸡肉或猪肝与乙腈的用量比(g/mL)为1：6-1：10。
优选的，生牛乳与乙腈的用量比(g/mL)为1：2；优选的，鸡肉或猪肝与乙腈的用量比(g/mL)为1：8。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明首次建立动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的检测方法，通过建立一种高效液相色谱串联质谱法快速检测动物源性食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量，进而计算出精吡氟禾草灵的残留量。本方法简单方便、易于操作，能够满足吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在动物源性食品中的快速检测和精准确证的要求。
2.本发明前处理过程相对简单，过程中仅使用一种有机试剂，且毒性较低、用量较少，对操作人员相对安全，符合节约性和安全性的要求，适合推广使用。
3.本发明具有分析快速的特点，有效提高了试验效率，本发明通过对液相条件和质谱条件的优化，提高了分离效率，缩短了样品分析周期，每个试验样品分析时间仅为3.5min。在此条件下，吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的出峰时间分别为1.778min和1.378min。
4.本发明的选择性好，准确度、精密度和灵敏度均较高。动物源性食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在1.0～100.0ng/mL范围内均具有良好的线性相关性，相关系数R2均大于0.996，添加回收试验的平均回收率均不低于83％，相对标准偏差(RSD)均不高于5.4％，定量限均为0.01mg/kg。
5.动物源性食品与植物源性食品物质组成有较大差异。本发明的动物源性食品是指可食用的动物组织以及蛋和奶，该食品中脂肪和蛋白含量较高，而脂肪和蛋白的存在对检测结果影响明显，因此本发明通过待测样品的前处理，可以去除相关的杂质，保证方法的准确性。
附图说明
图1为动物源性食品中吡氟禾草灵和吡氟禾草酸检测流程图；
图2为1.0ng/mL吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液在生牛乳基质中色谱图，其中1.378min为吡氟禾草酸，1.778为吡氟禾草灵；
图3为1.0ng/mL吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液在鸡肉基质中色谱图，其中1.378min为吡氟禾草酸，1.778为吡氟禾草灵；
图4为1.0ng/mL吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液在猪肝基质中色谱图，其中1.378min为吡氟禾草酸，1.778为吡氟禾草灵；
图5为吡氟禾草灵在生牛乳基质中标准曲线；
图6为吡氟禾草酸在生牛乳基质中标准曲线；
图7为吡氟禾草灵在鸡肉基质中标准曲线；
图8为吡氟禾草酸在鸡肉基质中标准曲线；
图9为吡氟禾草灵在猪肝基质中标准曲线；
图10为吡氟禾草酸在猪肝基质中标准曲线。
具体实施方式
以下将结合附图与具体的实施方式对本发明进行详细的解释说明。
实施例1
1.材料与方法：
1.1试剂和材料
吡氟禾草灵标准品(1000mg/L，北京坛墨质检科技有限公司)；吡氟禾草酸标准品(1000mg/L，北京坛墨质检科技有限公司)；乙腈(色谱纯，SIGMA-ALDRICH,Co)；甲酸(ACS，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；娃哈哈纯净水(沈阳娃哈哈启力食品有限公司)；氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；PSA(40-60μm，Agela Technologies)；C18(40-60μm，/>Agela Technologies)。
1.2主要仪器设备
Agilent 1290InfinityⅡ液相色谱-G6470A三重四级杆质谱联用仪(美国安捷伦公司)、JJ300电子天平(d＝0.01g，常熟市双杰测试仪器厂)、BP211D分析天平(d＝0.01mg，美国赛多利斯)、ST-300搅拌机(广东卓良有限公司)、KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、CK2000高通量组织研磨仪(北京托摩根生物科技有限公司)、H/T16MM台式高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)、涡旋混合仪(德国IKA公司)、移液器(200μL、1mL、5mL，德国艾本德)。
1.3仪器检测条件
液相部分条件：
液相色谱柱：Agilent Extend-C18 50×2.1mm 3.5um；柱温：35.0℃；流速：0.400mL/min；进样量：5.00μL；流动相：A相为水(含0.1％甲酸)溶液，B相为乙腈。梯度洗脱条件如表1所述。
表1梯度洗脱条件
质谱部分条件：
离子源：电喷雾离子源AJS ESI；扫描方式：正离子模式(吡氟禾草灵)和负离子模式(吡氟禾草酸)；干燥气温度：280℃；干燥气流速：7L/min；雾化气：氮气；正离子喷雾电压和负离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：35psi；鞘气温度：325℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；检测方式：多重反应监测(MRM)；吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的质谱参数如表2所述。
表2吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的质谱参数
1.4储备液的配制
取1mL浓度为1000mg/L的吡氟禾草灵标准品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配得浓度为100mg/L吡氟禾草灵储备液。
取1mL浓度为1000mg/L的吡氟禾草酸标准品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配得浓度为100mg/L吡氟禾草酸储备液。
1.5样品前处理
生牛乳：称取5g(精确至0.01g)待测样品于50mL离心管中，加入10mL乙腈，放入6粒15mm研磨珠，先超声提取10min，再于高通量组织研磨仪以1000次/min研磨5min，加入约6g氯化钠，漩涡混匀约30秒，5000r/min，离心3min，后吸取3.00mL上清液于已加入100mg PSA和100mg C18的样品瓶中，漩涡混匀约30秒，上清液过0.22μm有机系滤膜，待高效液相色谱串联质谱检测。
鸡肉和猪肝：称取5g(精确至0.01g)粉碎后待测样品于50mL离心管中，加入40mL乙腈，放入6粒15mm研磨珠，先超声提取10min，再于高通量组织研磨仪以1000次/min研磨5min，加入约6g氯化钠，漩涡混匀约30秒，5000r/min，离心3min，后吸取3.00mL上清液于已加入100mg PSA和100mg C18的样品瓶中，漩涡混匀约30秒，上清液过0.22μm有机系滤膜，待高效液相色谱串联质谱检测。
1.6标准工作溶液的配制及标准曲线的绘制
分别准确移取1.4配制的吡氟禾草灵储备液与吡氟禾草酸储备液1mL于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配得浓度为1mg/L吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，将动物源食品空白样品按上述1.5前处理提取、净化后，用于稀释吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，配制得1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0ng/mL系列吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，按“1.3”的条件测定，以吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准溶液质量浓度与监测离子峰面积作标准曲线。标准溶液色谱图及标准曲线如图2-图10所示。
1.7精吡氟禾草灵残留量的检测
采用外标法标准曲线定量，将处理后的生牛乳样品按照1.3仪器检测条件进行检测，得到生牛乳样品色谱图，再通过外标法按线性回归方程计算即可实现对吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的定量检测，将吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量，带入下述公式计算得到精吡氟禾草灵残留量。具体计算公式为：
精吡氟禾草灵残留量＝吡氟禾草灵残留量+吡氟禾草酸残留量×1.17
式中：转换系数1.17为吡氟禾草灵(383.4)与吡氟禾草酸(327.3)分子量之比根据上述的方式分别对鸡肉和猪肝样品进行检测。
2.结果与分析：
2.1仪器条件
吡氟禾草灵和吡氟禾草酸以乙腈和水(含0.1％甲酸)溶液作为洗脱溶剂，选择C18色谱柱进行分离。在选择的色谱条件下2种化合物受基质提取物影响较小，且取得了较好峰形。吡氟禾草灵和吡氟禾草酸分析时间为3.5min，在上述条件下，吡氟禾草灵的出峰时间为1.778min，吡氟禾草酸的出峰时间为1.378min。
2.2样品前处理方法的确定
本发明考察了乙腈，乙腈(含0.5％乙酸)及不同体积的乙腈对目标化合物吡氟禾草灵的提取，结果见表3。当样品基质为生牛乳时，单纯乙腈的提取效果好于乙腈(含0.5％乙酸)，考虑到节约成本，选择10mL乙腈为生牛乳样品的提取溶剂。本发明未考虑甲醇作为提取溶剂，因甲醇为提取溶剂时生牛乳样品除水过程复杂，不符合经济性与节约性。当样品基质为鸡肉或猪肝时，20mL乙腈提取效果好于20mL乙腈(含0.5％乙酸)，但回收率结果均不符合要求，继而加大提取溶剂含量，结果发现提取溶剂为40mL乙腈时，鸡肉和猪肝样品中吡氟禾草灵的添加回收率均满足分析方法的要求。将优化得到的吡氟禾草灵提取方法应用于吡氟禾草酸，发现生牛乳、鸡肉和猪肝样品中吡氟禾草酸均具有较好的提取效果，结果见表4。
在提取溶剂确定的前提下，本发明还对比了超声研磨与超声振荡不同的提取过程，发现当提取过程为超声振荡时，目标化合物回收率较低，不满足农药残留分析要求，继而选择超声研磨提取过程。提取液经PSA和C18净化后，样品中杂质量降低，目标化合物峰型得到改善。
本发明前处理过程不需要抽滤、旋蒸(氮吹)、SPE等操作，提取净化步骤相对简便，适用于动物源性食品中吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留分析。
表3不同提取溶剂吡氟禾草灵的添加回收率
注：添加质量分数为0.01mg·kg-1。
表4吡氟禾草酸的添加回收率
注：添加质量分数为0.01mg·kg-1。
2.3方法的线性范围和灵敏度
本发明采用外标法标准曲线定量。在“1.3”仪器检测条件下，分别在样品检测前后进行标准溶液测定。采用1/x2加权，以标准溶液的浓度对响应值(峰面积)进行线性回归。如表5所示，吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在1.0～100ng/mL范围内有良好的线性关系，相关系数均大于0.996。以添加回收试验最小添加浓度作为方法的定量限，吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在生牛乳、鸡肉和猪肝样品中的定量限均为0.01mg/kg。
表5动物源性食品中吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的线性
2.4方法的准确度和精密度
取不含待测农药的生牛乳、鸡肉和猪肝样品，加入一定量的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准溶液，使其添加水平均为0.01、0.1和1.0mg/kg，每个水平设置5个重复。按上述记载的前处理方法和仪器检测条件进行添加回收试验，考察本发明的准确度和精密度，结果见表6和表7。
表6吡氟禾草灵添加回收试验结果
表7吡氟禾草酸添加回收试验结果
从表6和表7可以看出，吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在生牛乳、鸡肉和猪肝样品中的添加水平为0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg，平均回收率在83％～94％之间，相对标准偏差(RSD)在0.9％～5.4％之间，符合农药残留试验准则的要求，可用于实际残留分析。
Claims (9)
1.一种快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，通过检测动物源食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量，进一步计算得到精吡氟禾草灵残留量；所述动物源食品中的吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的残留量检测方法为：向待检测动物源食品中加入乙腈，超声研磨后再离心得上清液，取上清液净化后过有机滤膜，而后将过滤后上清液经高效液相色谱串联质谱定量和/或定性来完成对样品中吡氟禾草灵和吡氟禾草酸的检测。
2.根据权利要求1所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，高效液相色谱串联质谱测定数据由吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准曲线获得其含量；其中，标准曲线的绘制以吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准品混合配得吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，而后配制成不同浓度的一系列混合标准溶液，对所得不同浓度的混合标准溶液采用色谱条件进样检测，而后以混合标准溶液质量浓度为横坐标、对应的监测离子峰面积为纵坐标，作标准曲线。
3.根据权利要求1所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱检测条件为：
高效液相色谱条件：Agilent Extend-C18 50×2.1mm 3.5um色谱柱，洗脱液为乙腈和水(含0.1％甲酸)溶液，柱温为35.0℃，流速为0.400mL/min，进样量为5.00μL；
质谱条件为：电喷雾离子源AJS ESI，干燥气温度为280℃，干燥气流速为7L/min，正、负离子喷雾电压为3500V，雾化气(氮气)压力为35psi，鞘气温度为325℃，鞘气流速为11L/min，毛细管电压为3500V，多重反应监测(MRM)。
4.根据权利要求1所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，高效液相色谱串联质谱检测，正离子模式扫描吡氟禾草灵，保留时间为1.778min；负离子模式扫描吡氟禾草酸，保留时间为1.378min。
5.根据权利要求1所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，向待检测动物源食品中加入乙腈，放入研磨珠，先超声提取，再研磨，然后加入氯化钠，漩涡混匀后离心，取上清液加入PSA和C18，漩涡混匀后，取上清液过0.22μm有机系滤膜，待用。
6.根据权利要求1所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于：
(1)储备液的配制：分别取吡氟禾草灵和吡氟禾草酸标准品用乙腈溶解配得吡氟禾草灵和吡氟禾草酸储备液；
(2)样品前处理：取待检测动物源食品加入乙腈，放入研磨珠，先超声提取，再于高通量组织研磨仪研磨，然后加入氯化钠，漩涡混匀后离心，取上清液加入PSA和C18，漩涡混匀后取上清液过0.22μm有机系滤膜，待高效液相色谱串联质谱检测；
(3)标准工作溶液的配制：取吡氟禾草灵储备液和吡氟禾草酸储备液混合，配得吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，将动物源食品空白样品按上述步骤(2)前处理提取、净化后，用于稀释吡氟禾草灵和吡氟禾草酸混合标准溶液，对所得不同浓度的混合标准溶液采用液质条件进样检测，而后以混合标准溶液质量浓度为横坐标、对应的监测离子峰面积为纵坐标，作标准曲线；
(4)将步骤(2)处理后的待检测动物源食品溶液经高效液相色谱串联质谱检测，由标准曲线得到吡氟禾草灵和吡氟禾草酸在待检测动物源食品中的残留量，通过计算得到精吡氟禾草灵的残留量。
7.根据权利要求1-6任一项所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，所述动物源食品为生牛乳、鸡肉、猪肝、鸡蛋、鸡肝、猪肉和猪脂肪。
8.根据权利要求7所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，生牛乳与乙腈的用量比(g/mL)为1：1-1：10，；鸡肉或猪肝与乙腈的用量比(g/mL)为1：6-1：10。
9.根据权利要求8所述的快速检测动物源性食品中精吡氟禾草灵残留量的方法，其特征在于，生牛乳与乙腈的用量比(g/mL)为1：2；鸡肉或猪肝与乙腈的用量比(g/mL)为1：8。
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