CN106124653A - 虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法，属于水产品检测技术领域，所述方法为用盐酸水解样品，2‑硝基苯甲醛衍生化硝基呋喃类代谢物，调节pH值至6.5～7.5，加入乙腈，再加入萃取盐包，用乙腈液‑液萃取目标化合物，上清液经净化、浓缩后，经液相色谱‑串联质谱仪测定，内标法定量。本发明首次采用一种新型的样品提取和净化方式，同时分析测定虾中检出率最高的两大类禁用药物，克服了现有检测方法将两类药物分开测定的局限，提高了实际阳性样品中氯霉素的提取效率，极大的提高了工作效率，缩短了工作时间，节约了试剂消耗和人力成本。本发明采用同位素内标法定量，测定结果更加准确可靠，灵敏度高，结果重现性好，定量准确。

Description

虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，是一种用高效液相色谱-串联质谱法(LC/-MS/MS)检测虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的方法。

背景技术

硝基呋喃类药物是一类人工合成的具有5-硝基结构的广谱抗菌药，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和硝呋索尔等，曾被广泛用于治疗和预防由埃希氏菌和沙门氏菌引起的畜、禽及水生动物的胃肠道疾病。硝基呋喃类药物在动物体内的半衰期短，但其代谢物能与蛋白质紧密结合，残留时间长。研究证明，硝基呋喃类药物及其代谢物可诱导有机体基因突变，特别是其代谢物具有强致癌性。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)又叫左旋霉素，具有广谱抗菌能力，广泛地应用于水产养殖业，在低浓度时即可抑制多种细菌的生长，但其对人体造血机能有较大的毒副作用。因此欧美等发达国家和我国规定动物性食品中硝基呋喃类药物和氯霉素均不得检出。

硝基呋喃类代谢物由于需要衍生化前处理，而氯霉素类药物则可以直接提取，因此目前硝基呋喃类代谢物和氯霉素这两类药物是分别进行检测。硝基呋喃类代谢物主要监测呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因4种药物，硝呋索尔是继这4种药物之后又一硝基呋喃类药物。国内外关于硝基呋喃类代谢物和氯霉素类药物的检测方法有免疫分析法、高效液相色谱法，液质联用法等，液质联用法由于其高选择性和灵敏度，国际上多采用此法进行监测和确证。

本发明首次采用同一前处理方法，同时分析测定虾中检出率最高的两大类禁用药物(硝基呋喃类代谢物和氯霉素)，克服了现有检测方法将两类药物分开测定的局限，并有效提高了实际阳性样品中氯霉素的提取效率，同时极大的提高了工作效率，缩短了工作时间，节约了试剂消耗和人力成本，该方法对于重新制定水产品中有害物质的新标准具有非常重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法，检测虾中5种硝基呋喃类代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、氨基脲(SEM)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-内酰脲(AHD)、3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH)和氯霉素(CAP)的残留量。本发明以目标化合物相应的同位素为内标，37℃水解和衍生化12～16h后，将溶液pH调节为6.5～7.5之间，进行提取净化浓缩，最后用含20％～80％有机相的乙腈水溶液定容。本方法5种硝基呋喃类代谢物AOZ、SEM、AMOZ、AHD、DNSAH的检出限均为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg，氯霉素CAP的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。5种硝基呋喃类代谢物AOZ、SEM、AMOZ、AHD、DNSAH在0.5μg/kg～10μg/kg、氯霉素(CAP)在0.3～5μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均≤15％。

本发明是按照以下操作方法完成的：

一种虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法，用盐酸水解样品，2-硝基苯甲醛衍生化硝基呋喃类代谢物，调节pH值至6.5～7.5，加入乙腈，再加入萃取盐包，用乙腈液-液萃取目标化合物，上清液经净化、浓缩后，经液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。

一种虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法，它包括样品水解和衍生化、提取和净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件和定性与定量，具体步骤如下：

(1)样品水解和衍生化

样品中加入盐酸、衍生化试剂、同位素内标，37℃水解和衍生化12～16h，取出放置至室温；

进一步，所述步骤(1)中的衍生化试剂为2-硝基苯甲醛。

(2)提取和净化

将步骤(1)溶液的pH值调节至6.5～7.5，加入乙腈和萃取盐包，涡旋混匀后4℃离心，取上清液转入QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管中净化，涡旋混匀后4℃离心，上清液全部转入QuEChERS Final Polish EMR-Lipid盐析管中，涡旋混匀后4℃离心，取上清液在40℃下氮气吹干；加入20％～80％(体积比)乙腈水溶液，涡旋振荡溶解残留物，过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；

(3)标准曲线的绘制

分别移取一定浓度的标准溶液，除不加样品外，按照上述(1)和(2)的操作步骤进行衍生化、提取和净化，进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线；

进一步，所述步骤(3)标准曲线的绘制时5种硝基呋喃类代谢物最终溶液的浓度均分别为以下浓度梯度：0.0002μg/mL、0.0005μg/mL 0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.005μg/mL、0.010μg/mL和0.020μg/mL，氯霉素最终溶液的浓度分别为以下浓度梯度：0.0001μg/mL、0.0002μg/mL 0.0005μg/mL、0.0010μg/mL、0.0002μg/mL、0.005μg/mL、0.010μg/mL。

(4)实验所用的仪器条件

色谱条件如下：

a)色谱柱：C₁₈反相色谱柱，2.1mm×100mm，2.6～5μm；

b)柱温：室温；

c)流速：0.3mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序见表1。

表1流动相梯度洗脱条件

时间/(min)	A/(％)	B/(％)
			0	10	90
5	90	10
			7	10	90
10	10	90

质谱条件如下：

电喷雾离子源；喷雾电压：5500V，-4500V，正负离子切换扫描；离子源温度：550℃，碰撞气：Medium；气帘气：30psi；雾化气：35psi；辅助加热气：35psi；离子模式：多反应选择监测，选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数见表2；

表2选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量

注：*代表定量碎片离子

(5)定性与定量

①定性测定

在同样测试条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中定性离子相对丰度一致，其偏差应符合表3要求。

表3基峰与次强碎片离子丰度比要求

次强碎片离子相对丰度/(％)	允许偏差/(％)
		＞50	±20
20～50(不含20)	±25
		10～20(不含10)	±30
≤10	±50

②定量测定

取试样溶液和相应的标准工作液，作多点校准，按内标法定量。标准溶液及试样溶液中目标化合物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素以各自的同位素为内标进行定量；

③空白实验

除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。

④结果计算和表述

按式(a)计算试样中目标化合物的残留量：

$X=\frac{C\×V\×f}{m}\mathrm{...}\left(a\right)$

式中：

X—试样中目标化合物的残留量，μg/kg；

C—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/mL；

V—最终样液定容体积，mL；

f—稀释倍数；

m—试样量，g。

注：计算结果需扣除空白值。测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

⑤方法灵敏度、准确度和精密度

灵敏度：5种硝基呋喃类代谢物AOZ、SEM、AMOZ、AHD、DNSAH的检出限均为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg，氯霉素(CAP)的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。

准确度：本方法5种硝基呋喃类代谢物AOZ、SEM、AMOZ、AHD、DNSAH在0.5μg/kg～10μg/kg、氯霉素(CAP)在0.3～5μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％。

精密度：本方法的批内相对标准偏和批间相对标准偏差均≤15％。

本发明与现有技术相比的有益效果是

1.现有的硝基呋喃类代谢物和氯霉素残留量的测定方法是将这两类药物分别进行测定，而本发明首次将虾中检出率最高的两类禁用药物硝基呋喃类药物和氯霉素采用同一前处理方法同时进行测定；针对实际阳性样品中氯霉素类药物提取效率低的问题，本发明将氯霉素类药物采用盐酸水解的方式将其转变为游离态，再提取净化，显著提高了实际阳性样品中氯霉素类药物的提取效率；将虾中检出率最高的两大类禁用药物(硝基呋喃类代谢物和氯霉素)同时进行测定，克服了现有检测方法将两类药物分开测定的局限，极大的提高了工作效率，缩短了工作时间，节约了试剂消耗和人力成本。

2.现有检测5种硝基呋喃类代谢物中3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH)的方法或采用外标法定量，或采用硝基呋喃同类药物水解衍生化产物作为内标进行定量，其结果很容易受回收率、外源物质、操作人员素质等多方面的影响。而本发明采用同位素内标法定量，消除了由于操作条件、操作人员因素和外源物质的干扰对分析结果产生的影响，使测定结果更加准确可靠，灵敏度高，结果重现性好，定量更加准确。

3.本发明采用一种新型的样品提取和净化方法对样品进行处理，该样品前处理方法操作简便，采用EMR新型净化材料，尤其对样品中的油脂具有非常好的除杂净化效果。

4.按照农业部783号公告-1-2006中的定容溶剂(5％甲醇水溶液)定容，硝基呋喃类代谢物中3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH)会出现测定结果不稳定的现象，甚至有时出峰，有时不出峰。而本发明提高了定容溶剂中有机相所占的比例，在保证峰形的前提下，用20～80％乙腈水溶液定容，可以使5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素获得良好的测定结果。

附图说明

图1：AMOZ、SEM、AHD、AOZ、DNSAH和CAP的同位素内标及外标的选择离子流色谱图：a、AMOZ IS(340.0/296.3)，b、AMOZ(335.1/291.2)c、SEM IS(212.0/168.0)，d、SEM(209.0/192.0)，e、AHD IS(252.0/134.0)，f、AHD(249.0/134.0)，g、AOZ IS(240.0/134.0)，h、AOZ(236.0/134.0)，i、DNSAH IS(376.2/182.8)，j、DNSAH(374.2/182.8)，k、CAP IS(326.0/157.2)，l、CAP(321.0/152.1)。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的技术内容：

本发明为利用高效液相色谱-串联质谱法分析虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的方法，样品肌肉组织中残留的硝基呋喃类蛋白结合态代谢物和氯霉素用盐酸水解，硝基呋喃类代谢物与2-硝基苯甲醛进行衍生化，硝基呋喃类代谢物衍生化产物和氯霉素经乙腈液-液萃取、净化、浓缩后，用配有ESI源的液相色谱-串联质谱仪采用正负离子切换方式扫描，测定虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留，内标法定量。

虾种类繁多，如中国对虾、南美白对虾、罗氏沼虾、日本沼虾等，在其生长过程中由于受到饲料、水体、土壤等环境因素及人为用药等因素的影响而有药物残留，硝基呋喃类药物和氯霉素是虾中检出率最高的两类禁用药物，是影响其食用安全性评价的关键因素。因此，我们选择虾中最具有代表性的南美白对虾作为验证的实施例。

实施例1南美白对虾中硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的测定

1.本实施例选用的仪器及设备：LC-MS/MS液相色谱-串联质谱仪

(1)HPLC部分(岛津公司，型号LC-20A)，使用Kinetex EVO C₁₈反相色谱柱，100mm×2.1mm,2.6μm。

(2)AB Qtrap 5500质谱仪(美国AB公司)：配有ESI离子源，三重四极杆，碰撞池，真空系统，气路控制系统；

(3)超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-600DE)；

(4)高速离心机:8000r/min(Thermo Fisher公司)；

(5)涡旋混合器(美国Talboys公司)；

(6)氮吹仪(美国Organomation公司，型号N-EVAP 112)；

(7)小型高速离心机：14000r/min(德国Sigma公司)；

(8)分析天平：感量0.00001g(德国赛多利斯公司，型号CP225D)；

(9)天平：感量0.01g(德国赛多利斯公司，型号CPA1003P)；

(10)0.22μm尼龙微孔滤膜(艾杰尔)；

(11)恒温振荡器(美国精骐有限公司，型号IS-RDS3)；

(12)Milli-Q超纯水仪(美国Milipore公司)。

2.配制标准溶液与试剂

(1)乙腈、甲醇：色谱纯(德国Merck公司)。

(2)乙酸铵(德国Merck公司)。

(3)2-硝基苯甲醛(美国Sigma公司)

(4)盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾：优级纯(国药集团化学试剂有限公司)。

(5)萃取盐包(美国Agilent科技有限公司)

(6)QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管(美国Agilent科技有限公司)

(7)QuEChERS Final Polish EMR-Lipid管(美国Agilent科技有限公司)

(8)2mmol/L乙酸铵溶液：准确称取0.154g乙酸铵，用水溶解并定容至1L，混匀后备用。

(9)5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素标准储备液：分别称取AOZ、SEM、AMOZ、AHD、DNSAH、CAP标准品各约10.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，配成浓度分别为1.0mg/mL的标准储备液，-20℃冷冻保存。

(10)5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素同位素内标标准储备液：分别称取AOZ-D₄、SEM-¹³C,¹⁵N₂、AMOZ-D₅、AHD-¹³C₃、DNSAH-¹⁵N₂、CAP-D₅标准品各约10.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，配成浓度分别为1.0mg/mL的内标标准储备液，-20℃冷冻保存。

(11)5种硝基呋喃类代谢物混合标准工作液：分别准确移取5种硝基呋喃类代谢物适量标准储备液，用甲醇稀释并定容，配成5种硝基呋喃类代谢物浓度均为10μg/mL的混合标准工作液，2℃～8℃冷藏保存。

(12)氯霉素标准工作液：准确移取适量氯霉素标准储备液，用甲醇稀释并定容，配成浓度为10μg/mL的标准工作液，2℃～8℃冷藏保存。

整个实验过程中用水均为超纯水。

3.样品处理的步骤

(1)水解和衍生化

称取2g试样于50mL离心中，加入50μL内标，静置5min，加入5mL 0.5mol/L HCl，再加入150μL 100mmol/L 2-硝基苯甲醛，涡旋1min，置于37℃避光恒温振荡16h。

(2)提取和净化

取出离心管冷却至室温，加入适量1mol/L磷酸氢二钾溶液，调节pH值至6.5～7.5，加入10mL乙腈，再加入萃取盐包，涡旋混匀后4℃8000r/min离心5min，取6mL上清液转入QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管(预先用6mL水活化)，涡旋混匀后4℃8000r/min离心5min，将上清液全部转入QuEChERS Final Polish EMR-Lipid管中，涡旋混匀后4℃8000r/min离心5min，取5mL上清液在40℃下氮气吹干。准确加入1.0mL 20％乙腈水溶液，涡旋振荡溶解残留物，过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；

(3)标准曲线的绘制

分别准确移取适量混合标准工作液于50mL离心管中，除不加样品外，按照上述(1)和(2)的步骤操作，使5种硝基呋喃类代谢物最终溶液浓度均分别为以下浓度梯度：0.0002μg/mL、0.0005μg/mL、0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.005μg/mL、0.010μg/mL和0.020μg/mL，氯霉素最终溶液浓度分别为以下浓度梯度：0.0001μg/mL、0.0002μg/mL、0.0005μg/mL 0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.005μg/mL和0.010μg/mL，进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线。

4.实验所用的仪器条件

色谱条件如下：

a)色谱柱：Kinetex EVO C₁₈反相色谱柱，2.1mm×100mm，2.6μm；

b)柱温：室温；

c)流速：0.3mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序见表1。

质谱条件如下：

a)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)；

b)扫描方式：正负离子切换扫描；

c)离子源温度：550℃；

d)碰撞气(CAD)：Medium；

气帘气(Curtain gas)：30psi；

雾化气(Gas1)：35psi；

辅助加热气(Gas2)：35psi；

扫描模式：选择反应监测(SRM)，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；

5)样品检测与结果计算

(1)定性测定

在同样测试条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中定性离子相对丰度一致，其偏差应符合表3要求。

(2)定量测定

取试样溶液和相应的标准工作液，作多点校准，按内标法以峰面积定量。标准溶液及试样溶液中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液特征离子质量色谱图参见图1。

(3)空白实验

除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。

(4)结果计算和表述

采用MultiQuant软件对数据进行处理，以浓度为横坐标，以外标和相应内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，然后对样品峰进行分析处理，即可得到待测样液中目标化合物的浓度，按式(a)计算试样中目标化合物残留量：

$X=\frac{C\×V\×f}{m}\mathrm{...}\left(a\right)$

式中：

X—试样中目标化合物的残留量，μg/kg；

C—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/mL；

V—最终样液定容体积，mL；

f—稀释倍数；

m—试样量，g。

注：计算结果需扣除空白值。测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

6.结果

本方法5种硝基呋喃类代谢物AOZ、SEM、AMOZ、AHD、DNSAH的检出限均为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg，氯霉素(CAP)的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。5种硝基呋喃类代谢物AOZ、SEM、AMOZ、AHD、DNSAH在0.5μg/kg～10μg/kg、氯霉素(CAP)在0.3～5μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均≤15％。

南美白对虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素残留量的加标回收率和精密度的测定结果见表4。

表4南美白对虾加标回收率和精密度的测定结果

Claims (4)

1.一种虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法，其特征在于所述方法为用盐酸水解样品，2-硝基苯甲醛衍生化硝基呋喃类代谢物，调节pH值至6.5～7.5，加入乙腈，再加入萃取盐包，用乙腈液-液萃取目标化合物，上清液经净化、浓缩后，经液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。

2.一种虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法，其特征在于它包括样品水解和衍生化、提取和净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件和定性与定量，具体步骤如下：

(1)样品水解和衍生化

样品中加入盐酸、衍生化试剂、同位素内标，37℃水解和衍生化12～16h，取出放置至室温；

(2)提取和净化

将步骤(1)溶液的pH值调节至6.5～7.5，加入乙腈和萃取盐包，涡旋混匀后4℃离心，取上清液转入QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管中净化，涡旋混匀后4℃离心，上清液全部转入QuEChERS Final Polish EMR-Lipid盐析管中，涡旋混匀后4℃离心，取上清液在40℃下氮气吹干；加入20％～80％体积比的乙腈水溶液，涡旋振荡溶解残留物，过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；

(3)标准曲线的绘制

分别移取一定浓度的标准溶液，除不加样品外，按照上述(1)和(2)的操作步骤进行衍生化、提取和净化，进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线；

(4)实验所用的仪器条件

色谱条件如下：

a)色谱柱：C₁₈反相色谱柱，2.1mm×100mm，2.6～5μm；

b)柱温：室温；

c)流速：0.3mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序见表1；

表1流动相梯度洗脱条件

时间/(min) A/(％) B/(％) 0 10 90 5 90 10 7 10 90 10 10 90

质谱条件如下：

电喷雾离子源；喷雾电压：5500V，-4500V，正负离子切换扫描；离子源温度：550℃，碰撞气：Medium；气帘气：30psi；雾化气：35psi；辅助加热气：35psi；离子模式：多反应选择监测，选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数见表2；

表2选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量

注：*代表定量碎片离子

(5)定性与定量

①定性测定

在同样测试条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中定性离子相对丰度一致，其偏差应符合表3要求；

表3基峰与次强碎片离子丰度比要求

次强碎片离子相对丰度/(％) 允许偏差/(％) ＞50 ±20 20～50，不含20 ±25 10～20，不含10 ±30 ≤10 ±50

②定量测定

取试样溶液和相应的标准工作液，作多点校准，按内标法定量；

③空白实验

除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；

④结果计算和表述

按式(a)计算试样中目标化合物的残留量：

$X=\frac{C\×V\×f}{m}...\left(a\right)$

式中：

X—试样中目标化合物的残留量，μg/kg；

C—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/mL；

V—最终样液定容体积，mL；

f—稀释倍数；

m—试样量，g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中的衍生化试剂为2-硝基苯甲醛。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)标准曲线的绘制时5种硝基呋喃类代谢物最终溶液的浓度均分别为以下浓度梯度：0.0002μg/mL、0.0005μg/mL 0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.005μg/mL、0.010μg/mL和0.020μg/mL，氯霉素最终溶液的浓度分别为以下浓度梯度：0.0001μg/mL、0.0002μg/mL 0.0005μg/mL、0.0010μg/mL、0.0002μg/mL、0.005μg/mL、0.010μg/mL。