CN107607643A - 鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，包括：称取4g鳗鱼肉样品，加0.2mol/L的盐酸溶液20ml，加入衍生剂1mL，手动摇匀，60℃水浴反应1h，取出冷至室温，用NaOH溶液调节至pH＝7.0～7.5，离心10min，取一半的上清液；用5ml甲醇和5ml蒸馏水，活化固相萃取柱；将所述上清液过柱，用5ml蒸馏水淋洗，弃去，再用2ml甲醇洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，40℃氮气吹干，用1mL呋喃定溶液溶解，微孔滤膜过滤，HPLC‑MS‑MS检测。本发明提取效率高，衍生时间短，灵敏度、精确度和准确性高。

Description

鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法

技术领域

本发明具体涉及一种鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法。

背景技术

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，该类药物能有效治疗人类和动物由细菌和原虫感染的疾病，因价格低廉疗效好，广泛用于畜禽及水产养殖业。在水产养殖中作为生长促进剂以及治疗和预防由细菌、原生动物感染引起的胃肠炎。在家禽养殖中硝基呋喃类药物主要用于治疗家禽的伤寒、副伤寒、鸡白痢、乳腺炎、尿路感染类疾病。硝基呋喃类药物及其代谢物的化学结构式如下所示：

尽管硝基呋喃类药物有很大的治疗价值，但硝基呋喃类药物及其代谢物具有致突变和致癌作用。最常见的硝基呋喃类药物是呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因。摄入后，原药在体内迅速代谢，硝基呋喃类药物代谢物为呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)，结构式如上述所示，这些代谢物迅速形成相应的组织束缚代谢物，形成的代谢物在体内与蛋白质结合，长时间在体内稳定存在。各个国家已经禁止使用各种硝基呋喃类药物在生产食品动物和食用动物上，尽管禁止使用这类药物，但许多国家仍然在进口食品中检测到硝基呋喃类药物残留。2003年3月13日按照欧盟委员会规定每个硝基呋喃代谢物的最低检出限为1μg/kg。

硝基呋喃类药物在动物及水产品体内代谢迅速，无法检测，而与蛋白质结合的代谢物长时间稳定存在，因此需要检测的是硝基呋喃类代谢物。

发明内容

本发明要解决的技术问题，在于提供一种鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法。

本发明是这样实现的：一种鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取：准确称取4.00g鳗鱼肉样品，加入0.2mol/L的盐酸溶液20ml，加入衍生剂1mL，手动摇匀1min，60℃水浴恒温振荡器中反应1h，取出冷至室温，用1mol/L NaOH溶液调节至pH＝7.0～7.5，10000r/min离心10min，取一半的上清液，备用；

(2)净化：用5ml甲醇和5ml蒸馏水，活化固相萃取柱；将所述上清液过柱，先用5ml蒸馏水淋洗，弃去淋洗液，再用2ml甲醇洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，40℃氮气吹干，用1mL呋喃定溶液溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，用HPLC-MS-MS检测。

具体地，所述衍生剂包括邻硝基苯甲醛和甲醇，且每0.2g邻硝基苯甲醛，甲醇用量为20mL。

具体地，所述衍生剂还包含有5mL的冰醋酸。

具体地，所述固相萃取柱为MCX柱，所述MCX柱为180mg。

具体地，所述HPLC条件如下：

色谱柱为Waters Acquity UPLCTM BEH-C18，2.1×50mm，1.7μm；

流动相：乙腈、10mmol/L乙酸铵；

柱温30℃；

进样体积：10.0μL；

流速：0.3mL/min；

流动相梯度洗脱程序如下：

具体地，所述质谱条件为：

电喷雾正离子源，多反应监测扫描方式；毛细管电压：3.3kV；样品锥孔电压：30V；二级锥孔电压：3V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：400℃；脱溶剂气流量：800L/hr；锥孔气流量：20L/hr。

本发明的优点在于：提取效率高，衍生时间短，灵敏度、精确度和准确性高，为鳗鱼中检测硝基呋喃类药物代谢物提供了高效、简便的前处理方法。

具体实施方式

一、溶液配制：

标准储备液：分别称取AOZ、AMOZ、AHD、SEM各20mg，用甲醇定容于100mL棕色容量瓶中，制成200mg/L的标准储备液，置于-18℃冷冻柜避光保存；

混合标准储备液：用甲醇稀释标准储备液，配制成AOZ、AMOZ、AHD、SEM均为1.0mg/L的混合标准溶液，置于-18℃冷冻柜避光保存；

混合标准工作液：用甲醇稀释混合标准溶液，配制成AOZ、AMOZ、AHD、SEM均为40μg/L的混合标准溶液，置于5℃冷藏柜避光保存；

衍生剂的配制：称取0.2g邻硝基苯甲醛溶于20mL甲醇中，加入5mL冰乙酸，摇匀，待用；

实验中其他溶液所需的蒸馏水均是Milli-Q超纯水纯化系统纯化的超纯水，并用0.22μm滤膜过滤后才使用的；

硝基呋喃定溶液：取448.5mL蒸馏水，加入50mL乙腈+1.5mL甲酸，超声脱气。

二、鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，包括：

(1)提取：准确称取4.00g鳗鱼肉样品，加入0.2mol/L的盐酸溶液20ml，加入衍生剂1mL，手动摇匀1min，60℃水浴恒温振荡器中反应1h，取出冷至室温，用1mol/L NaOH溶液调节至pH＝7.0～7.5，10000r/min离心10min，取一半的上清液，备用；所述衍生剂包括邻硝基苯甲醛、甲醇和冰醋酸，且每0.2g邻硝基苯甲醛，甲醇用量为20mL，冰醋酸用量为5mL。

(2)净化：用5ml甲醇和5ml蒸馏水，活化固相萃取柱；将所述上清液过柱，先用5ml蒸馏水淋洗，弃去淋洗液，再用2ml甲醇洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，40℃氮气吹干，用1mL呋喃定溶液溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，用HPLC-MS-MS检测。所述固相萃取柱为MCX柱，所述MCX柱为180mg。

所述HPLC条件如下：

色谱柱为Waters Acquity UPLCTM BEH-C18，2.1×50mm，1.7μm；

流动相：乙腈、10mmol/L乙酸铵；

柱温30℃；

进样体积：10.0μL；

流速：0.3mL/min；

流动相梯度洗脱程序如下：

所述质谱条件为：

电喷雾(ESI)正离子源，多反应监测(MRM)扫描方式；毛细管电压：3.3kV；样品锥孔电压：30V；二级锥孔电压：3V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：400℃；脱溶剂气流量：800L/hr；锥孔气流量：20L/hr。

三、硝基呋喃代谢物的线性范围与检测限

取20mL提取剂于离心管中，加入适量的混合标准工作液，使其各个组分的浓度为1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、20μg/L，按照步骤二的方法依次进行分析检测，得到四种硝基呋喃代谢物的线性方程和相关系数，如表1所示，各组分在1～20μg/L范围内线性关系良好，相关系数在0.9968～0.9994。用混合标准溶液逐级稀释，按照步骤二的方法处理，进行分析检测，检测限结果见表1。

表1四种硝基呋喃代谢物的线性方程及检测限

四、加标回收率与精密度

考察本发明的加标回收率，对四种硝基呋喃代谢物进行了高中低3个水平的加标回收实验，分别在鳗鱼肉样品中加入三个浓度的混合标准工作液，按照上述步骤二方法处理样品及检测，每一个添加浓度分别做三次加标回收率实验，取其平均值计算平均回收率和相对标准偏差。结果见表2所示，从表2可以看出，四种硝基呋喃代谢物的平均回收率在79.50％～108.13％之间，相对标准偏差在1.10～6.79％之间，表明本发明的方法准确可靠，适用于四种硝基呋喃类药物代谢物的前处理。

表2

本发明建立了一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的方法，以0.2mol/L盐酸溶液作为提取剂，快速衍生剂衍生其代谢物，MCX柱为固相萃取柱，HPLC-MS-MS同时检测鳗鱼肉中四种硝基呋喃代谢物。

本发明测定的AOZ的检测限为0.1μg/kg，SEM的检测限为0.5μg/kg，AMOZ的检测限为0.2μg/kg，AHD的检测限为0.5μg/kg，均达到国内外检测四种硝基呋喃代谢物的最低检测限。相比国家标准和行业标准中的方法，本发明方法简单、快速、成本低；衍生时间由国家标准方法的16h缩短为1h，大大的减少了样品前处理时间，步骤更为简便，结果可靠。

由于硝基呋喃类代谢物分子质量较小，无法检测，因此需要将四种硝基呋喃类代谢物进行衍生后检测。硝基呋喃代谢物的衍生剂市面上售卖的较少，且价格较贵，因此，本发明中硝基呋喃代谢物的标准工作曲线均是利用衍生剂衍生后测定的。本发明以水产品中的鳗鱼为检测样品，通过提取剂，衍生剂衍生，用固相萃取柱进行富集和净化，最后采用HPLC-MS-MS检测四种呋喃代谢物的衍生物。与现有技术相比，本发明提取效率高，衍生时间短，灵敏度、精确度和准确性更高，为鳗鱼中检测硝基呋喃类药物代谢物提供了更高效、更简便的前处理方法。

Claims (6)

1.一种鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取：称取4.00g鳗鱼肉样品，加入0.2mol/L的盐酸溶液20ml，加入衍生剂1mL，手动摇匀1min，60℃水浴恒温振荡器中反应1h，取出冷至室温，用1mol/L NaOH溶液调节至pH＝7.0～7.5，10000r/min离心10min，取一半的上清液，备用；

(2)净化：用5ml甲醇和5ml蒸馏水，活化固相萃取柱；将所述上清液过柱，先用5ml蒸馏水淋洗，弃去淋洗液，再用2ml甲醇洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，40℃氮气吹干，用1mL呋喃定溶液溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，用HPLC-MS-MS检测。

2.如权利要求1所述的鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，其特征在于：所述衍生剂包括邻硝基苯甲醛和甲醇，且每0.2g邻硝基苯甲醛，甲醇用量为20mL。

3.如权利要求2所述的鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，其特征在于：所述衍生剂还包含有5mL的冰醋酸。

4.如权利要求1所述的鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，其特征在于：所述固相萃取柱为MCX柱，所述MCX柱为180mg。

5.如权利要求1所述的鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，其特征在于：所述HPLC条件如下：

色谱柱为Waters Acquity UPLCTM BEH-C18，2.1×50mm，1.7μm；

流动相：乙腈、10mmol/L乙酸铵；

柱温30℃；

进样体积：10.0μL；

流速：0.3mL/min；

流动相梯度洗脱程序如下：

6.如权利要求1所述的鳗鱼中硝基呋喃类药物的检测方法，其特征在于：所述质谱条件为：

电喷雾正离子源，多反应监测扫描方式；毛细管电压：3.3kV；样品锥孔电压：30V；二级锥孔电压：3V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：400℃；脱溶剂气流量：800L/hr；锥孔气流量：20L/hr。