CN103698435B - 硝基呋喃类代谢产物的超高效液相色谱-三重四级杆质谱的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种水或沉积物中硝基呋喃类化合物的超高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱联用检测方法。该方法包括下述的步骤：衍生：取水样，加入浓盐酸和衍生试剂于30-45℃水浴振荡；提取：调pH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取两次；浓缩： 45-55℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，滤膜过滤，上机测定。本发明的有益效果在于，采用本发明的方法对水或沉积物中硝基呋喃类化合物进行检测，灵敏度高，衍生反应时间短，为国家制定相关的环境监测标准提供一定的参考和依据。

Description

硝基呋喃类代谢产物的超高效液相色谱-三重四级杆质谱的检测方法

技术领域

  本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种水或沉积物中硝基呋喃类药物代谢物的超高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱联用技术检测方法。

背景技术                          

随着人民物质生活水平提高，对食品安全关注也越来越多。然而，目前食品安全问题不容乐观，特别是动物源性食品安全问题，已成为全球性议题。兽药的残留是导致食品安全性下降的一个主要原因。兽药（Veterinary Drugs）是指用于预防、治疗和诊断禽畜等动物疾病，有目的地调节其生理机能并规定作用、用途、用法、用量的物质（含饲料药物添加剂），包括血清制品、疫苗、诊断制品、微生态制品、中药材、中成药、化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及外用杀虫剂、消毒剂等。兽药在保障动物健康、动物疾病预防和治疗以及促进动物生长等方面发挥着重要作用。养殖业中使用兽用药物具有几个方面的好处：保障动物健康、提高动物生产力；降低动物的发病率和致死率；同时为人类提供了大量营养丰富的产品。因此，随着集约化养殖业的快速发展，兽药及其添加剂被广泛应用于畜牧养殖业和水产养殖业。但是，兽药的大量使用所带来的生态和健康风险成为了目前一项新型的研究课题。兽药的种类众多，除抗生素和抗寄生虫药物外，还有抗霉剂、抗氧化剂和抗病毒剂和激素等不同类型的化学药物，如抗生素类，杀寄生虫类，抗真菌类、抗水产病害类，激素类，生长剂类。

抗生素是世界上应用范围最广、用量最大的一类兽用药物，同时也是我国兽药品种中极其重要并且用量较大的一类药物。硝基呋喃类药物是一类广谱抗生素，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因。该类药物被广泛用作饲料添加剂来预防和治疗由沙门菌和埃希杆菌引起的猪、牛及家禽的胃肠道疾病。研究表明，呋喃唑酮可能导致基因变异而具有遗传毒性；尽管呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的药理毒性数据不如呋喃唑酮充分，但出于食品安全的考虑,欧盟从1997年1月1日起,禁止在动物饲料中添加任何硝基呋喃类抗生素。我国也于2002年颁布了“食品动物禁用的兽药及其它化合物清单” ，呋喃唑酮、呋喃它酮列在禁用清单上。由于有些农户片面追求经济效应,目前非法使用屡有发生，如2006年国内影响较大的多宝鱼、桂花鱼中检出硝基呋喃事件。

近年来，我国发生多起因硝基呋喃类药物残留超标的出口贸易事件。2005年和2006年日本曾在我国出口的烤鳗鱼中检测出3- 氨基-2- 恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)超标，造成严重的经济损失。2010年5月24日，日本厚生劳动省医药食品局食品安全部监视安全课发布食安输发0524第1号：加强对中国产蚬贝及其加工品中呋喃唑酮的监控检查。随后，韩国食品医药安全厅称，从出口到韩国的中国产冷冻蚬肉汤里检出AOZ，并决定在确定中国产冷冻蚬肉汤安全之前停止该产品进口以及在韩国市场销售。2011年3月22日我国出口韩国的炭烧鸡肉串中检出5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)，含量为2.3μg/kg。2011年3月和4月日本连续两次从我国某省出口的养殖活鳗鱼和蒲烧鳗鱼中检出呋喃唑酮。2011年8月1日，日本厚生劳动省发布的食安输发0801第1号通知，厚生省在监控监控检查出中国产养殖活杂色鲍中含有呋喃唑酮。2011年9月14日欧盟从我国的冷冻对虾中检出硝基呋喃，含量为1.62μg/kg。由此可见，在食用性动物中使用硝基呋喃类药物的现象仍然存在，我国对其的监督和管理力度需进一步加强。

目前还没有相对完善的硝基呋喃类药物在水和沉积物中的检测分析方法和质量控制标准。全球对它们污染状况调查研究工作也刚刚展开，而我国在这方面的工作基础更加薄弱，起步也更晚，因此更加急需通过建立高灵敏度的检测技术，大规模开展其在不同流域中的污染水平调查，研究其在环境中的污染水平，进行环境健康风险评估，更好地服务于我国环境管理工作。鉴于此，本文研究了硝基呋喃类药物的检测方法，为国家制定相关的环境监测标准提供一定的参考和依据。

硝基呋喃类抗生素在动物体内代谢快，半衰期短。血浆、尿不能用于呋喃类代谢物检测，一般选用禽肉、鸡蛋、肝脏等动物性食品为检测对象，原药代谢后以蛋白结合物形态存在于机体组织中，根据试验目的可分为硝基呋喃代谢物总量和结合态代谢物检测。ConneelyA等测定结合态呋喃唑酮代谢物时样品先用甲醇、水、乙醇、乙醚洗涤，以除去游离态代谢物。结合态代谢物只有在适当的酸性条件下才能释放出来,硝基呋喃检测中常用稀盐酸溶液解离结合态代谢物。4种硝基呋喃代谢物分子质量均在75g/ mol～201g/ mol ，进行液相色谱串联质谱测定时必须进行衍生化，衍生化是为了增加分子质量，使化合物不在高噪音背景下，增加特征碎片离子的选择性提高质谱响应。常采用22硝基苯甲醛(22NBA)衍生化氨基增加代谢物的离子化效率，水解后生成硝基苯衍生物，衍生化一般在37 ℃过夜进行，亲核基团R2NH2酸性催化环境很快游离出来与22NBA碳酰基发生化学作用。Mottier P等在鸡肉中添加5μg/ kg硝基呋喃代谢物进行衍生化时发现12氨基222内酰腺 (AHD)和氨基脲(SEM)最稳定，而32氨基222唑烷基酮(AOZ) 和52甲基吗啉232氨基222唑烷基酮 (AMOZ)损失40%。Leitner A等等采用不同衍生化试剂对代谢物衍生化效率及稳定性进行比较，结果表明，22NBA是呋喃类代谢物最有效的衍生化试剂,衍生化效率大于70%。李耀平等建立在亲核加成反应机理的基础上，采用新衍生剂22氯苯甲醛衍生硝基呋喃代谢物，提高了灵敏度，缩短了衍生反应时间。

呋喃类液液萃取一般是在pH6～7水溶液与乙酸乙酯进行两相分配，在液液萃取操作过程中,样品溶液的pH对萃取效率有很大的影响，丁涛等试验不同pH对回收率的影响,发现pH为7～7. 5时, AHD、AOZ、SEM和AMOZ代谢物的衍生产物提取效率最高,分别为92. 1%、95. 1%、91. 4%和94. 3%。液液萃取易产生乳化现象，特别对含高蛋白、高脂肪、高淀粉的样品，需要加入冗长的去乳步骤,延长了试验操作时间。

为了更有效地净化动物源性食品中硝基呋喃类代谢物，常采用阴离子交换混合机理柱(MAX) 、聚苯乙烯2二乙烯苯柱(LiChrolut EN)和亲水2亲脂平衡料固相萃取柱(HLB)净化样品 ，利用pH7时分子间π2π作用力保留硝基芳香化合物,有机溶剂如乙酸乙酯或甲醇破坏这种作用力而洗脱被测物，ConneelyA等分别试验了溶液pH为3、6和10时HLB小柱净化时的回收率，数据表明pH6时HLB柱回收率最高。林黎明等评价了MAX与HLB串联柱、LiChrolut EN柱、HLB柱净化时的回收率,最后得出HLB柱与EN柱获得相同的回收率。

呋喃类结构化合物紫外吸收不明显,因此在紫外检测时灵敏度很低,不能满足代谢物0.5μg/ kg限量要求；同时毛细管电泳和薄层色谱因其灵敏度低，在呋喃类代谢物检测中应用很少 ，其代谢物残留检测常用液相色谱串联质谱法和酶联免疫法。

液质联用技术同时利用了液相色谱较强的分离能力与质谱检测器丰富的结构信息,为目标化合物提供了可靠的定性和定量结果。由于硝基呋喃类药物代谢物具有较低的离子化效率并缺少特征离子， 22NBA衍生物增加了相对分子质量,提高了离子化效率。欧盟EEC/ 657/ 2002指令规定对于禁用药物的质谱确证方法必须达到4个确证点。在串联质谱分析时，检测1个母离子和2个子离子能达到4个确证点的要求。液质联用测定呋喃类代谢物液相分离时流动相中常用有机溶剂(甲醇，乙腈)与弱酸(甲酸，乙酸，甲酸铵，乙酸铵)的混合液。正离子时加入酸能促使目标物的离子化，增强检测灵敏度。目前液相色谱2串联质谱联用已用于测定动物组织、牛奶、鲶鱼等动物性食品基质中硝基呋喃类代谢物残留量，检出限在0.1μg/ kg～2μg/ kg。

酶联免疫法(ELISA)是一种特异性强、灵敏度高的技术,常作为筛选方法用于残留分析中。该方法能快速、简单地测定1种硝基呋喃代谢物残留，灵敏度取决于制备抗体的选择性。Vass M等采用ELISA快速测定鸡蛋中呋喃西林代谢物，样品经酸衍生化后酶联免疫反应，方法EEC/ 657/ 2002验证，检出限(CCα)0. 13μg/ kg,定量限(CCβ)0. 3μg/ kg，回收率在77. 8%～110%，阳性测定结果与液质比较，表明该方法测定结果准确；ChangC等采用ELISA测定可食性动物组织呋喃唑酮代谢物时以苯甲醛作为衍生化试剂,生成苯AOZ的衍生物进行检测，回收率55. 8%～99. 6%。PimpitakU等采用ELISA测定虾中AMOZ，检出限为0.16μg/ kg。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种水或沉积物中硝基呋喃类化合物的超高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱联用检测方法。

本发明水或沉积物中硝基呋喃类代谢物的超高效液相-三重四级杆/复合线性离子阱质谱检测方法是通过下述的技术方案来实现的：

水或沉积物中硝基呋喃类代谢物的超高效液相-三重四级杆/复合线性离子阱质谱检测方法，包括下述的步骤：

当所检测的硝基呋喃类化合物来源于水中时，其步骤如下：

衍生：取水样，加入浓盐酸和衍生试剂于30-45℃水浴振荡；

提取：调pH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取两次；

浓缩： 45-55℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，滤膜过滤，上机测定；

当所检测的硝基呋喃类化合物来源于沉积物时，其步骤如下：

称取样品于离心管中，加盐酸和衍生试剂，30-45℃水浴振荡；

提取：调pH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取两次；

浓缩：45-55℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，滤膜过滤，上机测定。

上述的衍生试剂为2-硝基苯甲醛。

水或沉积物中硝基呋喃类化合物的超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用检测方法， 

当所检测的硝基呋喃类化合物来源于水中时，其具体步骤如下：

衍生：30ml水样，加入0.8ml浓盐酸和1.0ml衍生试剂37℃水浴振荡16小时；提取：调pH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取两次；

浓缩： 50℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，过0.22um膜，上机测定。

水或沉积物中硝基呋喃类化合物的超高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱联用检测方法，当所检测的硝基呋喃类化合物来源于沉积物时，其具体步骤如下：

称取样品1.0于离心管中，加 30ml 0.125mol/ml盐酸和1.0ml衍生试剂，37℃水浴振荡16小时；

提取：调pH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取两次；

浓缩： 50℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，过0.22um膜，上机测定。

上机测定的仪器条件如下：

HPLC测定条件：色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 柱(1.7um，2.1mm×50mm； Waters)；柱温：30℃，流动相：硝基呋喃类药物分析使用甲醇（A）和0.1% 甲酸/水（V/V）（B），流速0.4mL/min；测定时采用的流动相梯度如下表：

MS检测条件：电喷雾离子源，离子源温度为120℃，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速为600L.h^-1，锥孔气流速为50 L.h^-1，碰撞气为高纯氩气，采用多反应监测模式检测，测定硝基呋喃类药物使用采用ESI正离子模式，进样10μL，测定时采用的多反应监测模式参数如下表：

本发明的有益效果在于，采用本发明的方法对水或沉积物中硝基呋喃类化合物进行检测，灵敏度高，衍生反应时间短，为国家制定相关的环境监测标准提供一定的参考和依据。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

（1）仪器与试剂

超高效液相色谱ACQUITY UPLC（美国Waters公司）；

AB SCIEX QTRAP 5500 质谱仪（美国 AB公司）；

Analyst质谱工作站软件；固相萃取装置（美国Supelco公司）；

固相萃取仪（美国Supelco公司）；

固相萃取柱Oasis MCX 150 mg/ 6 cc（美国 Waters公司）；

快速溶剂萃取仪ASE 200（美国Dionex公司），

氮吹浓缩仪（美国Zymark公司）；

0.22μm针头式尼龙膜；

Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；

涡旋混合器（日本 LMS公司）；

移液枪（法国 Gilson公司）；

电子天平（瑞士梅特勒-托利多）；

GM-0.33B隔膜真空泵（天津津腾实验设备有限公司）；

KQ-250DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

容量瓶；量筒；烧杯；2 mL注射器；自动进样小瓶。

（2）标准品的准备：

呋喃唑酮代谢物（AOZ,纯度98.0%）、呋喃它酮代谢物（AMOZ,纯度98.0%）、呋喃西林代谢物（SEM,纯度98.0%）和呋喃妥因代谢物（AHD,纯度98.0%）及其各自的2-硝基苯甲醛衍生物2-NP-AOZ、2-NP-AMOZ、2-NP-SEM和2-NP-AHD，上述标准品均购自美国Sigma公司。

化学试剂：

乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国Merck试剂）；

实验用水Millipore超纯水（电阻率：18.2MΩ·cm25℃，TOC：<1 ppb）。

溶液配制：

10g/L2-硝基苯甲醛溶液：称取0.01g2-硝基苯甲醛，加水溶于10 mL容量瓶中；

HPLC测定条件:色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 柱(1.7um,2.1mm×50mm; Waters)；柱温：30℃,流动相：硝基呋喃类药物分析使用甲醇（A）和0.1% 甲酸/水（V/V）（B），流速0.4mL/min；测定时采用的流动相梯度下表：

MS检测条件：电喷雾离子源(ESI)，离子源温度为120℃，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速为600L.h^-1，锥孔气流速为50 L.h^-1，碰撞气为高纯氩气，采用多反应监测模式(MRM)检测。测定硝基呋喃类药物使用采用ESI正离子模式，进样10μL，测定时采用的主要MRM参数如下表：

当样品取自于水时，样品预处理的步骤如下：

衍生：30ml水样，加0.8ml浓盐酸和1.0ml衍生试剂（2-硝基苯甲醛）37℃水浴振荡16小时（过夜）。提取：调pH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取两次。（此步骤可用SPE代替)浓缩： 50℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，过0.22um膜，上机测定。

实施例2

当样品取自于底泥时，样品预处理的步骤如下：

称取样品1.0于离心管中，加 30ml 0.125mol/ml盐酸和1.0ml衍生试剂，37℃水浴振荡16小时（过夜）。提取：调pH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取两次。（此步骤可用SPE代替)浓缩： 50℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，过0.22um膜，上机测定。

其余条件同实施例1。

Claims (3)

1.水或沉积物中硝基呋喃类代谢物的超高效液相-三重四级杆/复合线性离子阱质谱检测方法，包括下述的步骤：

当所检测的硝基呋喃类化合物来源于水中时，其步骤如下：

衍生：取水样，加入浓盐酸和衍生试剂于30-45℃水浴振荡；

提取：调pH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取两次；

浓缩： 45-55℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，滤膜过滤，上机测定；

当所检测的硝基呋喃类化合物来源于沉积物时，其步骤如下：

称取样品于离心管中，加盐酸和衍生试剂，30-45℃水浴振荡；

所述的衍生试剂为2-硝基苯甲醛；

提取：调pH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取两次；

浓缩：45-55℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，滤膜过滤，上机测定；

上机测定的仪器条件如下：

HPLC测定条件：色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 柱，所述色谱柱的规格为1.7μm，2.1mm×50mm； Waters；柱温：30℃，流动相：硝基呋喃类药物分析使用甲醇（A）和0.1% 甲酸/水（V/V）（B），流速0.4mL/min；测定时采用的流动相梯度如下表：

MS检测条件：电喷雾离子源，离子源温度为120℃，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速为600L.h^-1，锥孔气流速为50 L.h^-1，碰撞气为高纯氩气，采用多反应监测模式检测，测定硝基呋喃类药物采用ESI正离子模式，进样10μL，测定时采用的多反应监测模式参数如下表：

。

2.如权利要求1所述的水或沉积物中硝基呋喃类代谢物的超高效液相-三重四级杆/复合线性离子阱质谱检测方法，其特征在于，

当所检测的硝基呋喃类化合物来源于水中时，其具体步骤如下：

衍生：30ml水样，加入0.8ml浓盐酸和1.0ml衍生试剂37℃水浴振荡16小时；提取：调pH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取两次；

浓缩： 50℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，过0.22μm膜，上机测定。

3.如权利要求1所述的水或沉积物中硝基呋喃类代谢物的超高效液相-三重四级杆/复合线性离子阱质谱检测方法，其特征在于，

当所检测的硝基呋喃类化合物来源于沉积物时，其具体步骤如下：

称取样品1.0于离心管中，加 30ml 0.125mol/L盐酸和1.0ml衍生试剂，37℃水浴振荡16小时；

提取：调pH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取两次；

浓缩： 50℃氮吹至干，用初始流动相定容至1ml，过0.22μm膜，上机测定。