CN114487171B - 一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法和应用 - Google Patents

一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及硝基呋喃类代谢物检测的技术领域，具体公开了一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法。一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法包括样品前处理和上机分析的步骤，样品前处理：取水产品加标试样，加入内标工作液和盐酸，混匀后加入衍生化试剂进行衍生化反应，反应完成后依次加入乙酸乙酯和中性的强电解质，振荡，离心后收集有机相并用惰性气体吹干、复溶，过滤后得到上机待测液；所述衍生化试剂为带有羧基的苯甲醛类物质。本申请的硝基呋喃类代谢物的检测方法可用于水产品中硝基呋喃类代谢物的检测，其具有准确度高和灵敏度好且操作步骤简便的优点。

Description

一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法和应用
技术领域
本申请涉及硝基呋喃类代谢物检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法和应用。
背景技术
硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用，用于治疗和预防由细菌或原生动物引起的各种胃肠道感染。
水产品在养殖过程中可能非法使用硝基呋喃类药物，此类药物常见的主要包括呋喃唑酮和呋喃妥因等。硝基呋喃类药物使用后，会在水产品体内迅速代谢，其代谢物可与组织蛋白结合形成“蛋白结合代谢物”，并在整个养殖过程中始终存在。硝基呋喃类代谢物已被证实具有潜在的致癌和致突变作用，食用含有该类物质的食品易对人体健康造成威胁，因此各国禁止在食品生产动物中使用硝基呋喃类药物。我国农业农村部公告第250号修订了食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单，明确规定食品动物养殖中禁止使用硝基呋喃类药物。
目前，关于硝基呋喃类代谢物的检测方法主要有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法以及高效液相色谱串联三重四极杆质谱法等。其中酶联免疫吸附法定量准确性相对较差，且存在交叉反应的现实问题；高效液相色谱法检测灵敏度较差，检出限较高，且定性能力不足。而高效液相色谱串联三重四极杆质谱法的检测方法是将水产品肌肉组织中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，经乙酸乙酯液-液萃取净化后，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量，从而计算得出硝基呋喃类代谢物的含量。
然而，高效液相色谱串联三重四极杆质谱法的检测方法在前处理过程中由于水产品中含有较多油脂，水产品自身独特的基质会与乙酸乙酯形成凝胶状物质，从而影响液-液萃取效果和有机相的回收，增大了试样前处理过程中硝基呋喃类代谢物的提取和定性定量的难度，并且影响其检测限度。
发明内容
为了获得一种高准确度和高灵敏度且操作步骤简便的水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，本申请提供一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法。
第一方面，本申请提供一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，采用如下的技术方案：
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，包括样品前处理和上机分析的步骤，样品前处理：先在水产品试样中加入硝基呋喃类代谢物标准品溶液，混匀后得到加标试样；取水产品加标试样，加入内标工作液和盐酸，混匀后加入衍生化试剂进行衍生化反应，反应完成后依次加入乙酸乙酯和中性的强电解质，振荡，离心后收集有机相并用惰性气体吹干、复溶，过滤后得到上机待测液；
所述衍生化试剂为带有羧基的苯甲醛类物质。
通过采用上述技术方案，采用盐酸对水产品试样进行水解，使水产品中与蛋白质紧密结合的硝基呋喃类代谢物能够有效释放，成为游离态的代谢物，游离态的代谢物结构上均带有一个活性氨基，能在酸性环境中与衍生化试剂上的活性醛基进行亲核加成反应并脱水后，形成较为稳定的衍生化产物——席夫碱；
由于水产品肌肉组织被盐酸水解完全后会更加细化，游离物质增加，形成水-乙酸乙酯-脂肪-其他杂质共存的凝胶状胶体，导致萃取时乙酸乙酯无法充分提取试样中的待测组分，造成上机分析时响应强度下降。因此在萃取过程中加入中性的强电解质，强电解质的加入有助于扩大衍生化产物在乙酸乙酯中的分离程度，使目标组分能够更多的进入有机相中，有机相经过氮吹、复溶等步骤后，提高了目标组分的纯度，方便后续进行上机分析，提高产品的回收率，从而提高检测的准确性。
采用超高效液相色谱串联质谱仪进行上机分析检测，使衍生化产物经色谱柱分离后，按照先后顺序进入离子源、质量分析器，因此各物质会有特定的保留时间和相应的特征离子丰度比，以达到了对各种物质分离和定性的目的。通过硝基呋喃类代谢物衍生化产物和对应的同位素内标衍生化产物的色谱峰扫描、积分，内标法进行定量分析得到待测液中硝基呋喃类代谢物衍生物的浓度，从而得到水产品样品中硝基呋喃类代谢物的含量。
优选的，所述衍生化试剂为4-甲酰苯甲醛、3-甲酰苯甲醛或2-甲酰苯甲醛中的一种。
通过采用上述技术方案，4-甲酰苯甲醛、3-甲酰苯甲醛和2-甲酰苯甲醛均是羧基连接在苯甲醛上的衍生化试剂。带有羧基的衍生化试剂进行衍生化反应后，一方面，得到的衍生化产物能够被乙酸乙酯在酸性环境下提取，不需要改变pH值，即可快速的将衍生化产物从水产品试样中分离出来提取到乙酸乙酯中；另一方面，羧基连接在苯环上的特有结构都使其容易失去H+，符合液质联用仪负扫描的监测模式，从而提高产品的回收率。
优选的，所述衍生化试剂为4-甲酰苯甲醛。
通过采用上述技术方案，4-甲酰苯甲醛受空间位阻的影响较小，能够更好的与硝基呋喃类代谢物进行衍生化反应，从而提高衍生化产物的提取效果，提高产品的回收率，从而提高检测方法的准确度。
优选的，所述强电解质为氯化钠或氯化钾中的一种。
通过采用上述技术方案，氯化钠和氯化钾均是属于中性的强电解质，且氯化钠或氯化钾的加入均不会对体系内的pH值造成影响，使待测液的pH值始终呈弱酸性，便于后续质谱仪采用负扫描的检测模式进行检测分析。
优选的，所述强电解质为氯化钠，所述氯化钠添加至过饱和。
通过采用上述技术方案，萃取过程中加入充足质量的氯化钠，首先，氯化钠增大了水相溶液的密度；其次，在乙酸乙酯涡旋提取的过程中，由于氯化钠的添加量大于溶液的溶解度，使体系中含有未溶解的氯化钠颗粒起到了对凝胶产生破坏，打破了凝胶存在时试管内部的平衡条件；再次，加入氯化钠后，乙酸乙酯在水相溶液中溶解度的降低，在提取过程结束后，有助于更多体积的乙酸乙酯被收集。
根据氯化钠在水溶液中的溶解度进行计算得出，例如，氯化钠的重量与盐酸的体积之比为2：5时才能保证氯化钠的添加量为过饱和状态，试样中的溶液呈饱和状态，并有部分未溶解的氯化钠颗粒，未溶解的氯化钠颗粒能够在涡旋提取过程中，对凝胶产生破坏，促进衍生化产物被乙酸乙酯提取，提高硝基呋喃类代谢物的回收率。
优选的，所述样品前处理中衍生化反应温度为50-70℃，反应时间为3-5h。
通过采用上述技术方案，反应温度为50-70℃时，反应时间为3-5h，在此范围内取值，对产品性能无影响，在该反应温度下，反应时长缩短，提高操作的简便性。
优选的，所述上机分析步骤是使用高效液相色谱串联质谱法对样品前处理中得到的待测液进行上机分析，所述高效液相色谱串联质谱法的分析条件为：电喷雾离子源，采用负离子扫描模式。
通过采用上述技术方案，采用带有羧基的衍生化试剂进行衍生化反应后，使衍生化产物中带有羧基，有利于ESI负扫描模式的进行，提高检测的灵敏度，降低检出限。
第二方面，本申请提供一种硝基呋喃类代谢物的检测方法的应用，采用如下的技术方案：
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法的应用，所述硝基呋喃类代谢物的检测方法应用于水产品中硝基呋喃类代谢物含量的检测。
通过采用上述技术方案，将硝基呋喃类代谢物的检测方法应用于水产品未知试样的检测，能够同时检测出水产品未知试样中的呋喃唑酮代谢物和呋喃妥因代谢物的含量，实现对水产品未知试样的进行定性和定量分析，以达到检测水产品中硝基呋喃类代谢物的目的。
优选的，所述硝基呋喃类代谢物为呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物的一种或多种。
通过采用上述技术方案，呋喃唑酮代谢物和呋喃妥因代谢物均属于水产品中硝基呋喃类代谢物，且均带有氨基，使其能够和衍生化试剂进行亲核加成反应，脱水生成衍生化产物；通过检测方法中的前处理步骤处理后再经过上机分析得出结果进行定性和定量分析。本检测方法能够排除干扰组分从复杂基质中提取目标组分，具有适应性强、范围广的优点。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请在样品前处理中采用带有羧基的衍生化试剂，通过带有羧基的衍生化试剂与水产品进行衍生化反应，获得的衍生化产物能够在酸性条件下被乙酸乙酯充分提取，便于ESI-扫描模式的检测，提高样品的回收率，提高检测的准确度。
2、本申请中优选采用在前处理中加入充足重量的氯化钠，由于氯化钠为中性电解质，不会对试样中的酸性环境造成影响；同时由于氯化钠的添加量为过量，使试样中存在未溶解的氯化钠颗粒，氯化钠颗粒能够减少水-乙酸乙酯-脂肪-其他杂质共存的凝胶状胶体的形成，从而使乙酸乙酯能够充分提取试样中的待测组分，方便后续进行上机分析，提高产品的回收率。
3、本申请的检测方法，通过样品前处理步骤将试样中的衍生化产物充分提取后进行上机分析，通过超高效液相色谱串联质谱仪设定特定的检测条件下进行检测，通过计算得出结果，实现对水产品中硝基呋喃类代谢物进行定性和定量的目的。
4.本申请的检测方法具有灵敏度高、准确度好、操作步骤简便、应用广泛的优点。
附图说明
图1为实施例1的CPAOZ的特征离子碎片的色谱图。
图2为实施例1的CPAOZ的内标色谱图。
图3为实施例1的CPAOZ的标准曲线图。
图4为实施例4的CPAHD的特征离子碎片的色谱图。
图5为实施例4的CPAHD的内标色谱图。
图6为实施例4的CPAHD的标准曲线图。
图7为实施例1与对比例4的上机待测液的对比示意图。
具体实施方式
以下结合具体内容对本申请作进一步详细说明。
原料来源：
本申请中除特殊说明之外，各原料和助剂均为市售产品。
Figure BDA0003458881940000041
Figure BDA0003458881940000051
本申请的检测方法可以适用于不同品种的水产品中硝基呋喃类代谢物的检测，例如鱼、虾、蟹等，本申请则主要是以虾为例进行举例说明，但不应对保护范围起到限制作用。
水产品加标试样的制备例
制备例1
一种水产品加标试样的制备方法，包括以下步骤：
取100ng/mL的硝基呋喃标准品溶液50μL加入5g的虾肉肌肉组织中，混匀后得到加标试样；其中，硝基呋喃标准品溶液为3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)溶液。
制备例2
一种水产品加标试样的制备方法，包括以下步骤：
取100ng/mL的硝基呋喃标准品溶液100μL加入5g的虾肉肌肉组织中，混匀后得到加标试样；
其中，硝基呋喃标准品溶液为3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)溶液。
制备例3
一种水产品加标试样的制备方法，包括以下步骤：
取100ng/mL的硝基呋喃标准品溶液250μL加入5g的虾肉肌肉组织中，混匀后得到加标试样；
其中，硝基呋喃标准品溶液为3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)溶液。
制备例4
一种水产品加标试样的制备方法，包括以下步骤：
取100ng/mL的硝基呋喃标准品溶液50μL加入5g的虾肉肌肉组织中，混匀后得到加标试样；其中，硝基呋喃标准品溶液为1-氨基-2-内酰脲(AHD)溶液。
制备例5
一种水产品加标试样的制备方法，包括以下步骤：
取100ng/mL的硝基呋喃标准品溶液100μL加入5g的虾肉肌肉组织中，混匀后得到加标试样；
其中，硝基呋喃标准品溶液为1-氨基-2-内酰脲(AHD)溶液。
制备例6
一种水产品加标试样的制备方法，包括以下步骤：
取100ng/mL的硝基呋喃标准品溶液250μL加入5g的虾肉肌肉组织中，混匀后得到加标试样；
其中，硝基呋喃标准品溶液为1-氨基-2-内酰脲(AHD)溶液。
实施例
实施例1
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，包括以下步骤：
S1、样品前处理：取制备例1中的水产品加标试样2g放入试管中，加入100ng/mL相应的内标工作液50μL和0.2mol/L的盐酸5mL，混匀后加入0.05mol/L衍生化试剂50μL进行衍生化反应，经涡旋混匀后置于60℃水浴振荡器中进行水解、衍生化4h；反应完成后生成衍生化产物(CPAOZ)，冷却至室温，依次加入5mL乙酸乙酯和2g中性的强电解质(过饱和用量)，涡旋振荡5min进行提取，收集乙酸乙酯层；再加入5mL乙酸乙酯，再次收集乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯层后用氮气吹干，此时乙酸乙酯蒸发，待测组分附着在试管壁上，之后加入25％(v/v)的甲醇-水溶液1mL溶解试管中的待测组分，过0.22μm有机相微孔滤膜过滤后得到上机待测液；
其中，衍生化试剂为4-甲酰苯甲醛(4-CBA)；
内标工作液为3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)的同位素内标液；
中性强电解质为氯化钠；
S2、上机分析：使用超高效液相色谱串联质谱仪对S1中得到的待测液进行上机分析，超高效液相色谱串联质谱仪的分析条件为：
色谱柱：C18 100mm×2.1mm，填料粒径为1.7μm；流动相：A-水，B-甲醇。梯度洗脱，梯度洗脱程序(0～1.0min，A保持90％；1.0～2.0min，A从90％下降到5％；2.0～4.0min，A保持5％；4.0～4.1min，A从5％上升到90％；4.1～5min，A保持90％)；
流速：0.3mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃；
离子源：电喷雾负(ESI-)，扫描模式：MRM，喷雾电压：4000V，温度：500℃。
Figure BDA0003458881940000061
Figure BDA0003458881940000071
*表示定量离子
实施例1的CPAOZ的特征离子碎片的色谱图如图1所示，CPAOZ的内标色谱图如图2所示，图1、2中横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度大小。
S3、标准工作曲线的配制
分别精确吸取100ng/mL的3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)标准品溶液5μL、10μL、20μL、50μL、100μL置于5个离心管中，除不加水产品试样外按照上述步骤进行操作，反应生成0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL五个浓度梯度点的标准溶液梯度工作液；使用所得检测数据，以目标化合物浓度与其对应内标浓度的比值为横坐标，目标化合物峰面积与其对应内标峰面积的比值为纵坐标，拟合标准曲线图，如图3所示，根据标准曲线图得出线性回归方程为y＝1.875x-0.0533，R2＝0.9988；
将实施例1的目标峰面积测试值与标准曲线进行比照，得出分析试样中待测物的浓度，进而计算出试样中硝基呋喃类代谢物的含量，计算公式如下所示：
Figure BDA0003458881940000072
式中X为样品测定值，单位为微克每千克(μg/kg)；
c为样品上机浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)，用标准曲线直接得出；
m为称量样品质量，单位为克(g)；
1000/1000，单位转换系数。
最终计算出的样品测定值，详见表1。
关于本申请中衍生化试剂添加量的确定，申请人以实施例1的添加量为例进行解释：Ⅰ、实施例1中加入了0.05mol/L的衍生化试剂50μL，衍生化试剂为4-甲酰苯甲醛，加入量为0.05mol/L×50μL×10-6＝2.5×10-6mol；
Ⅱ、硝基呋喃类代谢物的分子量在200以下，以AOZ为例，AOZ为102g/mol，本申请中配置标准曲线的最高点为10ng，故10ng点的摩尔数为10ng×10-9÷102g/mol≈10-10mol；
Ⅲ、因为硝基呋喃类代谢物与衍生化试剂是按1∶1的摩尔比进行反应，由Ⅰ和Ⅱ可知，加入衍生化试剂的量比目标反应物高4个数量级，目的是保证目标反应物充分反应完全，即便实际样品中的硝基呋喃类代谢物的含量高于本申请实施例中的含量，在本申请所加的衍生化量的水平上，也能使其充分反应，减少了由于衍生化试剂的添加量不足导致硝基呋喃类代谢物最终测定值偏小的情况发生。
实施例2
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，前处理中加入由制备例2制得的水产品加标试样。
实施例3
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，前处理中加入由制备例3制得的水产品加标试样。
实施例1-3的衍生化反应的反应结构式如下所示：
Figure BDA0003458881940000081
实施例4
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与制备例1的不同之处在于，样品前处理步骤中加入由制备例4制得的水产品加标试样2g，且其相应的内标工作液为1-氨基-2-内酰脲(AHD)的同位素内标液；
上机分析步骤中，超高效液相色谱串联质谱仪的分析条件为：
色谱柱：C18 100mm×2.1mm，填料粒径为1.7μm；流动相：A-水，B-甲醇。梯度洗脱，梯度洗脱程序(0～1.0min，A保持90％；1.0～2.0min，A从90％下降到5％；2.0～4.0min，A保持5％；4.0～4.1min，A从5％上升到90％；4.1～5min，A保持90％)。
流速：0.3mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃。
离子源：电喷雾负(ESI-)，扫描模式：MRM，喷雾电压：4000V，温度：500℃。
Figure BDA0003458881940000082
*表示定量离子
实施例4的CPAHD的特征离子碎片的色谱图如图4所示，CPAHD的内标色谱图如图5所示，图4、5中横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流相应信号强度大小。
S3、标准工作曲线的配制
分别精确吸取100ng/mL的1-氨基-2-内酰脲(AHD)标准品溶液5μL、10μL、20μL、50μL、100μL置于5个离心管中，除不加水产品试样外按照上述步骤进行操作，反应生成0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL五个浓度梯度点的标准溶液梯度工作液；
使用所得检测数据，以目标化合物浓度与其对应内标浓度的比值为横坐标，目标化合物峰面积与其对应内标峰面积的比值为纵坐标，拟合标准曲线图，如图6所示，根据标准曲线得出线性回归方程为y＝1.0308x-0.0305，R2＝0.9990；
将实施例4的目标峰面积测试值与标准曲线进行比照，得出分析试样中待测物的浓度，进而计算出试样中硝基呋喃类代谢物的含量，计算公式如下所示：
Figure BDA0003458881940000091
式中X为样品测定值，单位为微克每千克(μg/kg)；
c为样品上机浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)，用标准曲线直接得出；
m为称量样品质量，单位为克(g)；
1000/1000，单位转换系数。
最终计算出的样品测定值，详见表1。
实施例5
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例4的不同之处在于，前处理中加入由制备例5制得的水产品加标试样。
实施例6
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例4的不同之处在于，前处理中加入由制备例6制得的水产品加标试样。
实施例4-6的衍生化反应的反应结构式如下所示：
Figure BDA0003458881940000092
实施例7
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，衍生化试剂为3-甲酰苯甲醛。
实施例8
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，衍生化试剂为2-甲酰苯甲醛。
实施例9
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，强电解质为氯化钾。
实施例10
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，氯化钠的用量为1g(未过饱和用量)。
实施例11
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，样品前处理中衍生化反应温度为40℃，反应时间为9h。
对比例
对比例1
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，衍生化试剂为4-硝基苯甲醛。
对比例2
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，以等量的磷酸钠替代氯化钠。
对比例3
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，以等量的硫酸钠替代氯化钠。
对比例4
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，与实施例1的不同之处在于，氯化钠的用量为0g。
对比例5
一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，采用DB33/T 599-2006《水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定--液相色谱-串联质谱法》中规定的前处理方法进行处理，其衍生化反应时间为16h，反应温度为37℃。
应用例1
一种水产品中硝基呋喃类代谢物检测方法的应用，基于实施例1的基础上，除不添加标准品外，其余均按照实施例1中的步骤进行前处理、上机分析和标准曲线的绘制，对水产品中硝基呋喃类代谢物进行定性和定量分析，并计算出水产品中硝基呋喃类代谢物的含量。
本应用例中的水产品选用为草鱼的肌肉组织，前处理步骤中分别添加呋喃唑酮代谢物和呋喃妥因代谢物的内标工作液。
性能检测试验
测试包括：
1.回收率与精密度测试
将实施例1-3和实施例4-6的样品分别进行加标回收试验，根据分析获得的图谱和相应信息，根据标准品系列梯度仪器分析得到的标准曲线，分别计算出实施例1-3的AOZ含量及其回收率、实施例4-6的AHD含量及其回收率；每个实施例均平行测量3次，计算平均回收率和相对标准偏差。
表1水产品中AOZ、AHD的加标回收试验结果
Figure BDA0003458881940000111
本检测方法的AOZ和AHD的检出限均为0.5μg/kg，定量限均为1.0μg/kg，说明本申请的检测方法具有较高的灵敏度。
根据实施例1-6并结合表1可以看出样品的平均回收率均在90％左右，说明本检测方法的准确度较好；
通过对每个实施例分别做出3个平行样品得出的检测结果计算出相对标准偏差，实施例1-6的相对标准偏差均在5％以内说明本检测方法的精密度较高。
本检测方法具有高准确度、高精密度以及高灵敏度的特点，且均符合水产品中硝基呋喃类代谢物的检测标准，适宜对未知水产品试样中硝基呋喃类代谢物的定性和定量的检测。
2.感官以及回收率测试
将实施例1与实施例7-11和对比例1-4的前处理得到上机待测液进行感官测试，并对其上机分析结果进行回收率测试，计算出回收率测试结果，如表2所示。
感官测试：找5个视觉健康、无色觉障碍的人组成评价组，对上机待测液进行观察，观察上机待测液的状态并给出评价。
表2感官及回收率测试
Figure BDA0003458881940000121
*表示仪器测定无响应值导致无法计算回收率
将实施例1与对比例5的上机待测液进行对比，如图7所示，图中左侧试样瓶为对比例5得到的上机待测液，明显浑浊且带有红色色素存在，图中右侧为本申请实施例1试验方法得到的上机待测液，可见澄清透明且无色的效果；说明本申请实施例1的检测方法具有操作步骤简便，且提取效果好的优点。
结合实施例1、实施例7-8并结合表2可以看出，实施例1与实施例7-8的待测液评价相同且实施例1的回收率测试略优于实施例7-8，说明本申请中4-甲酰苯甲醛、3-甲酰苯甲醛和2-甲酰苯甲醛均是羧基连接在苯甲醛上的衍生化试剂，带有羧基的衍生化试剂进行衍生化反应后，一方面，得到的衍生化产物能够被乙酸乙酯在酸性环境下提取，不需要改变pH值，即可快速的将衍生化产物从水产品试样中分离出来提取到乙酸乙酯中，另一方面，羧基连接在苯环上的特有结构都使其容易失去H+，符合液质联用仪负扫描的监测模式，从而提高产品的回收率。
结合实施例1、实施例9并结合表2可以看出，实施例1和实施例9的上机待测液均呈澄清透明状态，但实施例1的回收率测试略高于实施例9，说明本申请中氯化钠和氯化钾均是属于中性的强电解质，且氯化钠或氯化钾的加入均不会对体系内的pH值造成影响，使待测液的pH值始终呈弱酸性，便于后续质谱仪采用负扫描的检测模式进行检测分析。
结合实施例1和对比例1并结合表2可以看出，实施例1的上机待测液的感官评价优于对比例1，说明本申请选用4-甲酰苯甲醛作衍生化试剂得到的衍生化产物能够在酸性环境下被乙酸乙酯提取，不需要对体系内的pH值进行改变，操作步骤简便，提取效果好；对比例1由于采用4-硝基苯甲醛作衍生化试剂，在上机分析中没有响应值，故无法计算回收率，且4-硝基苯甲醛作衍生化试剂，其衍生化产物在酸性环境下的提取效果差。
结合实施例1和对比例2-3并结合表2可以看出，实施例1均优于对比例2-3，由于对比例2中的磷酸钠属于碱性的弱电解质，对比例3中的硫酸钠属于碱性的强电解质，磷酸钠或硫酸钠的加入会对体系内的pH值造成影响，导致衍生化产物从乙酸乙酯中的提取效果不佳，且不利于后续的上机分析，故本申请中采用氯化钠或氯化钾属于中性的强电解质，不会对体系内的pH值造成影响，使待测液的pH值始终呈弱酸性，便于后续质谱仪采用负扫描的检测模式进行检测分析，提高硝基呋喃类代谢物的回收率，保证检测结果的准确度。
结合实施例1、实施例10和对比例4并结合表2可以看出，实施例1的上机待测液评价和回收率均优于实施例10和对比例4，且实施例10优于对比例4，由于实施例10中的氯化钠的添加量并非过量，加入的氯化钠全部溶解，氯化钠仅能起到有利于乙酸乙酯在水相溶液中溶解度的降低，在提取过程结束后，有助于更多体积的乙酸乙酯被收集的效果，而对比例4中没有添加氯化钠；故说明本申请萃取过程中加入充足质量的氯化钠，首先，氯化钠增大了水相溶液的密度；其次在乙酸乙酯涡旋提取的过程中，由于氯化钠的添加量大于溶液的溶解度，使体系中含有未溶解的氯化钠颗粒起到了对凝胶产生破坏，打破了凝胶存在时试管内部的平衡条件；再次，加入氯化钠后，有利于乙酸乙酯在水相溶液中溶解度的降低，在提取过程结束后，有助于更多体积的乙酸乙酯被收集。
根据氯化钠在水溶液中的溶解度进行计算得出，例如，氯化钠的重量与盐酸的体积之比为2：5时才能保证氯化钠的添加量为过饱和状态，试样中的溶液呈饱和状态，并有部分未溶解的氯化钠颗粒，未溶解的氯化钠颗粒能够在涡旋提取过程中，对凝胶产生破坏，促进衍生化产物被乙酸乙酯提取，提高硝基呋喃类代谢物的回收率。
结合实施例1和实施例11并结合表2可以看出，实施例1的回收率优于实施例11，说明反应温度为50-70℃时，反应时间为3-5h，在该反应温度下，反应时长缩短，提高操作的简便性；而实施例11的反应温度降低，为保证衍生化反应的充分进行，其反应时间增长，同时由于反应时间增长会导致水产品肌肉组织更加细化，增大了衍生化产物的分离难度，导致回收率有所降低的情况。
3.应用例1的定性和定量分析结果
(1)定性分析
将应用例1的水产品试样的检测结果进行定性分析，应用例1的水产品试样完成前处理后进入超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪分析检测，其衍生化产物经过C18色谱柱分离后，依次进入离子源、质量分析器，应用例1中目标化合物的保留时间与内标工作液的保留时间相同或接近，且应用例1检测到的特征离子碎片的丰度比与内标工作液的丰度比相同或者接近，根据其特定的保留时间和相应的特征离子丰度比这两个条件进行定性，从而确定应用例1中的水产品试样中存在硝基呋喃类的代谢物。
(2)定量分析
将应用例1的水产品试样的检测结果进行定量分析，通过硝基呋喃类代谢物的衍生化产物和对应的同位素内标的衍生化产物的色谱峰扫描、积分，根据内标法进行定量分析得到待测液中硝基呋喃类代谢物的衍生物的浓度，从而得到应用例1的水产品试样中硝基呋喃类代谢物的含量。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (7)

1.一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，包括样品前处理和上机分析的步骤，其特征在于：
样品前处理：先在水产品试样中加入硝基呋喃类代谢物标准品溶液，混匀后得到加标试样；
取水产品加标试样，加入内标工作液和盐酸，混匀后加入衍生化试剂进行衍生化反应，反应完成后依次加入乙酸乙酯和中性的强电解质，振荡，离心后收集有机相并用惰性气体吹干、复溶，过滤后得到上机待测液；
所述衍生化试剂为4-甲酰苯甲醛、3-甲酰苯甲醛或2-甲酰苯甲醛中的一种；
所述强电解质为氯化钠或氯化钾中的一种。
2.根据权利要求1所述的水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，其特征在于：所述衍生化试剂为4-甲酰苯甲醛。
3.根据权利要求1所述的水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，其特征在于：所述强电解质为氯化钠，所述氯化钠添加至过饱和。
4.根据权利要求1所述的水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，其特征在于：所述样品前处理中衍生化反应温度为50-70℃，反应时间为3-5h。
5.根据权利要求1所述的水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，其特征在于：所述上机分析步骤是使用高效液相色谱串联质谱法对样品前处理中得到的待测液进行上机分析，所述高效液相色谱串联质谱法的分析条件为：电喷雾离子源，采用负离子扫描模式。
6.一种权利要求1-5任一项所述的水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法的应用，其特征在于：所述硝基呋喃类代谢物的检测方法应用于水产品中硝基呋喃类代谢物含量的检测。
7.根据权利要求6所述的一种水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法的应用，其特征在于：所述硝基呋喃类代谢物为呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物的一种或多种。
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