CN115078587A - 一种基于氮同位素gc-irms分析的动物源水产品中sem源解析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于氮同位素GC‑IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，涉及水产品检测技术领域。本发明包括待测样品粉末和上清液的制备；向上清液中加入萃取剂萃取浓缩获得浓缩SEM；在70℃的0.1mol·L^‑1氢氧化钠溶液中加入乙醛溶液并保持20min，随后将0.1mol·L^‑1氢氧化钠溶液温度调整为60℃并加入溴甲烷溶液并保持30～60min进行衍生化反应；准确称取待测样品粉末以及多个分析标准品各2mg，并放入到锡囊包裹以进行稳定氮同位素分析并计算稳定氮同位素比值，随后再进行GC‑MS/MS及GC‑C‑IRMS分析测定。本发明首次建立了基于氮同位素GC‑IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，该方法对开展动物源水产品中硝基呋喃类抗生素滥用监测的研究，保障水产品质量安全有重要意义。

Description

一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析 方法

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，特别是涉及一种基于氮同位素 GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法。

背景技术

氨基脲(Semicarbazide，SEM)是硝基呋喃类物质的代谢产物，在生物体内能够与蛋白质形成稳定的结合物，对人体具有神经毒害和生理毒害作用，也是食品中潜在的致癌和致畸污染物。目前，我国水产养殖中通常以SEM作为动物源水产品中硝基呋喃类抗生素非法使用的检测指标，但根据现有的研究结果发现，除使用硝基呋喃类抗生素会形成外源性SEM外，生物体内各种含氮化合物或组织蛋白的代谢，如次氯酸盐、蛋白质加热或油炸加工等使氨基酸氧化时也会形成内源性SEM。基于此，动物源水产品中内源性SEM的天然存在给硝基呋喃类抗生素的检测造成严重干扰，进而无法准确判断SEM的来源。

目前，关于动物源水产品中SEM检测领域的研究较少，已报道的文献主要采用高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、免疫学测定方法等手段对 SEM进行检测。并且液相色谱串联质谱分析是检测复杂基质食品中SEM含量的标准方法，该方法能准确检测到0.01μg·kg^-1的极低浓度水平。国内基于动物源水产品中SEM分析测定的研究有：辛少平(高效液相色谱法测定硝基呋喃类药物代谢物及其在对虾体内的代谢[J].食品科学，2014，(24):7.)等以高效液相色谱-紫外法测定4种硝基呋喃类药物代谢物在虾肉组织中残留量，在0.1～50nmol/mL范围内，SEM的线性相关系数为0.9984，检出限为0.75ug/kg；李剑等研究建立了测定水产品中硝基呋喃类代谢物的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，准确定量检测水产品中SEM等多种硝基呋喃类代谢物；黄登宇等建立了动物源食品中呋喃西林代谢物间接竞争化学发光酶免疫检测方法，方法的检测范围为0.123～2.398ug/kg，IC₅₀值为0.544ug/kg，相对标准偏差为1.9％～5.3％，该方法具有较高的准确度；舒秀君等(日本沼虾养殖过程中SEM存在特征研究[J].淡水渔业,2020,(3):11-16.)研究了日本沼虾中SEM 的存在形式，结果证明SEM有结合态和游离态两种形态；彭婕等(中华绒螯蟹中内源性SEM的产生途径研究[J].淡水渔业,2019,49(3):108-112)探究了中华绒鳌蟹内源性SEM的产生途径，证实甲壳类水产品中甲壳素、蛋白质及水解氨基酸与SEM的形成密切相关；于慧娟等(液相色谱-串联质谱法测定甲壳类水产品中SEM的含量[J].分析化学，2012，40(10):1530-1535)利用液相色谱串联质谱技术测定甲壳类水产品中中SEM的含量，证实内源性SEM在动物体内普遍存在。目前虽有诸多研究表明动物源水产品中存在内源性SEM，但在判别样品中外源性和内源性SEM来源的方法上仍存在空白。

液相色谱法具有高效灵敏的特点，但是无法实现对样品的准确定量，并且样品前处理中必须将与SEM保留时间接近的杂质除去，操作繁琐，易出现假阳性结果；液相色谱串联质谱法可提高目标化合物的定性和定量结果的准确性，排除高效液相色谱的假阳性结果，进行代谢物的确证，但是由于外源性和内源性SEM分子的理化性质完全相同，导致在分析特征离子碎片时无法区分这两种分子，从而不能判别生物体内SEM的来源；免疫分析法操作简单，灵敏度高，适用于快速筛查，但是测定结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系，使用不同来源亲和力的单抗，对同一样品测到的结果可能不同。为此，我们提供了一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，用以解决上述中的技术问题。

发明内容

本发明针对现有分析检测技术仅能定量水产品中SEM含量，而缺乏对 SEM的来源确证的缺陷，提供了一种利用EA-IRMS、GC-MS/MS、GC-C-IRMS 分析定量检测动物源水产品中外源性和内源性SEM含量及百分比，结合 ANOVA分析、RSM分析等数据分析方法优化NSIRA分析实验条件，建立了一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，用于判别水产养殖中是否滥用硝基呋喃类抗生素。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，包括如下步骤：

步骤一、取待测样品自然解冻并于低温下粉碎，准确称取50g样品匀浆后，经干燥研磨过筛得到样品粉末，保存待EA-IRMS分析用；

步骤二、准确称取50g样品匀浆后，加入萃取剂在超声环境下进行萃取，经离心处理后获取上清液，保存待GC-MS/MS和GC-C-IRMS分析用；

步骤三、为满足稳定同位素比率质谱最低的响应强度(100nA)，需要对当前青虾和大闸蟹检测样本中极低的氨基脲进行浓缩，以提高同位素比率质谱的响应强度，提升检测方法的精度。将100ml上清液以每秒2滴的速度洗脱过氨基亲和固相萃取柱，再以20ml50％的乙腈溶液淋洗用以除去非目标含氮化合物，最后以每秒1滴的速度加入5ml1％盐酸水溶液将氨基亲和固相萃取柱上的SEM洗脱下来，获得浓缩SEM；

步骤四、由于氨基脲气化压极高，难以直接用于GC-C-IRMS分析，为解决氨基脲GC-C-IRMS分析，首先需要解决的就是其气相化问题，氨基脲的气相衍生化过程分两步进行，第一步是氨基酰基化，在70℃的0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液中加入乙醛溶液，用乙醛溶液与浓缩SEM中的氨基发生羰氨亲核反应并保持20min，第二步是将0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液温度调整为 60℃并加入溴甲烷溶液，溴甲烷溶液与浓缩SEM中另外两个酰氨基进一步发生N-烷基化反应并保持30～60min，两步反应的的主要目的，即对氨基脲中的氨基进行掩蔽，降低其与溶剂的氢键作用，从而提升其衍生化产物的气化能力，能够使得其适合GC-C-IRMS分析。同时衍生化试剂采用的乙醛和溴甲烷在羰氨亲核反应和烷基化反应过程中都不引入N元素，能够确保测定氨基脲中氮同位素比率不受外来衍生化试剂的影响，分析结果可靠；

步骤五、准确称取待测样品粉末以及作为分析标准品的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和甘氨酸各2mg，分别一式三份，并放入到5mm×9mm锡囊包裹以进行稳定氮同位素分析并计算稳定氮同位素比值，随后再进行 GC-MS/MS及GC-C-IRMS分析测定，稳定氮同位素比值的计算方式为：

δ(‰)＝(R_样品/R_标准品-1)×1000

式中δ为样品的稳定氮同位素，R为重同位素与轻同位素丰度比值，即¹⁵N/¹⁴N；分析物的δ¹⁵N值采用内标多点校准，选用一系列已知δ¹⁵N值的IAEA 标准内标物进行校准。

步骤六、由于外源性SEM的氮同位素(¹⁴N和¹⁵N)在生物体内由硝基呋喃前体直接降解，因此前者的δ¹⁵N值可被后者的δ¹⁵N值所代替，即δ¹⁵N _外源性SEM＝δ¹⁵N_硝基呋喃，同理，内源性SEM的δ¹⁵N值也可被体内氨基酸的δ¹⁵N值代替，即δ¹⁵N_内源性SEM＝δ¹⁵N_{生物体内氨基酸}，此外，由于氨基酸的稳定氮同位素的GC-C-IRMS分析比较困难，将生物体内氨基酸的δ¹⁵N值用组织蛋白的δ¹⁵N值代替测定，即δ¹⁵N_{生物体内氨基酸}＝δ¹⁵N_蛋白质，因此可通过以下计算公式计算外源性和内源性SEM的百分比：

步骤七、按照以下公式计算外源性和内源性SEM的含量，外源性SEM 含量用C_外源性SEM表示，内源性SEM含量用C_内源性SEM表示：

C_外源性SEM＝％SEM_外源性×C_{生物体内SEM总量}

C_内源性SEM＝％SEM_内源性×C_{生物体内SEM总量}。

作为本发明一种优选技术方案，所述步骤一的具体步骤为：取待测样品自然解冻并于低温下粉碎，准确称取50g样品匀浆后，置于-80℃真空冷冻箱干燥48h，干燥样品经研磨过200目筛得到样品粉末，保存待EA-IRMS分析用。

作为本发明一种优选技术方案，所述步骤二的具体萃取条件为：萃取溶剂CH₃CN比例为10％，水浴温度为60℃，超声功率为400Hz。

作为本发明一种优选技术方案，所述步骤五中稳定氮同位素分析通过 EA-IRMS分析仪进行，在C/N模式下对样品连续流动分析，燃烧炉和还原炉温度分别为950℃和600℃，载气流速为230mL·min^-1，以高纯氮气作参比气。

作为本发明一种优选技术方案，所述步骤五中的GC-MS/MS及 GC-C-IRMS分析测定具体条件为：

GC条件：载气为高纯氦气，升温程序为：0～5min，50℃；5～10min，150℃；15～20min，230℃，保持5min；

MS条件：SEM、甲基氨基脲、二甲基氨基脲的质谱监测离子对分别为 100.1→100.1，114.4→100.1和129.3→114.5。

作为本发明一种优选技术方案，外源性和内源性SEM的δ¹⁵N值均基于国际初始标准的δ¹⁵N值(即大气氮气，δ¹⁵N＝0‰)计算，所述步骤六中的生物体内SEM总量的δ¹⁵N值通过如下公式计算：

δ¹⁵N_{生物体内SEM总量}＝δ¹⁵N_外源性SEM×％SEM_外源性+δ¹⁵N_内源性SEM×％SEM_内源性。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明首次建立了基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中 SEM源解析方法，该方法对开展动物源水产品中硝基呋喃类抗生素滥用监测的研究，保障水产品质量安全有重要意义。

2、本发明能够将生物体内的外源性SEM和内源性SEM完全区分开来，进而有效确证动物源水产品中SEM的来源，应用构建的GC-C-IRMS分析方法监督水产养殖中硝基呋喃类抗生素的非法使用，以期为水产品质量安全监督提供技术支撑。

3、本发明分别通过利用GC-MS/MS及GC-C-IRMS、EA-IRMS分析测定SEM的稳定氮同位素值，同时探索最佳实验条件，基于NSIRA分析制定可行的SEM源解析策略，确证分析动物源水产品中SEM来源。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为外源性和内源性SEM产生机制及两步衍生化步骤的流程图。

图2为CK组与实验组中SEM的平均含量与δ¹⁵N值的差值比较图。

图3为两种水产品对照组与实验组中SEM与Gly、组织蛋白的δ¹⁵N值方差分析与比较图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1样品制备

样品的提取：取青虾和大闸蟹样品自然解冻，于低温下粉碎。匀浆后准确称取50g样品，置于-80℃真空冷冻箱干燥48h，干燥样品经研磨，过200 目筛后保存待EA-IRMS分析用。此外，准确称取50g匀浆样品于250mL锥形瓶，设置水浴温度为60℃，超声功率为400Hz，以溶剂CH₃CN比为10％的萃取剂超声萃取，离心后取上清液，保存待GC-MS/MS和GC-C-IRMS分析用。

样品的浓缩：将100mL提取液以2滴·s^-1过氨基亲和固相萃取柱，以 20mL50％乙腈溶液淋洗除去非目标含氮化合物，加5mL1％盐酸水溶液以1 滴·s^-1洗脱SEM。

样品浓缩液的衍生：衍生化步骤如图1B所示。第一步是于70℃的 0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液中，乙醛溶液与SEM中氨基发生羰基氨亲核反应，保持20min；第二步是于60℃的0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液中，溴甲烷溶液与SEM中另外两个氨基进一步发生N-烷基化反应，保持30～60min。

实施例2水产养殖实验

对青虾和大闸蟹进行为期一个月的室内养殖实验。将青虾和大闸蟹样本分为十二组，每组至少包含20只成年个体青虾和大闸蟹，将各组样品分别放入1m×1m的玻璃鱼缸中，并以相同的无硝基呋喃饲料喂养。其中三组样品标记为对照组(CK)，不使用硝基呋喃类抗生素喂养。其余九组样品一式三份，每一份设置三个平行实验组，并按照1mg·d^-1的添加量向玻璃鱼缸中投入呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因抗生素以引入外源性SEM。经10d喂养后，收集各组青虾和大闸蟹，并置于-20℃冷冻保存。上述养殖实验一个月重复三次，分别采集了9个CK样品和27个以呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因抗生素饲喂的青虾和大闸蟹样品。

实施例3同位素测定与分析

EA-IRMS分析测定：将经处理的青虾和大闸蟹样品及呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等分析标准品各准确称取2mg，分别一式三份，并放入 5mm×9mm锡囊包裹以进行稳定氮同位素分析。在EA-IRMS分析仪的C/N 模式下，对样品连续流动分析，燃烧炉和还原炉温度为950℃和600℃，载气流速为230mLmin^-1，以高纯氮气(纯度>99.99％)作参比气。根据如下公式计算稳定同位素比值：

δ(‰)＝(R_样品/R_标准品-1)×1000

式中δ为样品的稳定氮同位素，R为重同位素与轻同位素丰度比值，即¹⁵N/¹⁴N。

分析物的δ¹⁵N值采用内标多点校准，选用一系列已知δ¹⁵N值的IAEA标准内标物进行校准，采用热乙酰苯胺的工作标准曲线进行精密度测定(以内标重复量的标准差为基准)，结果显示，δ¹⁵N的分析精密度小于±0.2‰，所有分析结果见如下表1。

实施例4数据分析与源解析策略构建

动物源水产品中SEM的δ¹⁵N含量及其与前体的关系：基于GC-MS/MS 和GC-C-IRMS对衍生化的终产物进行分析，准确测定了青虾和大闸蟹样品的SEM含量和δ¹⁵N值，GC-MS/MS及GC-C-IRMS分析测定具体条件为：

GC条件：载气为高纯氦气，升温程序为：0～5min，50℃；5～10min， 150℃；15～20min，230℃，保持5min；

MS条件：SEM、甲基氨基脲、二甲基氨基脲的质谱监测离子对分别为 100.1→100.1，114.4→100.1和129.3→114.5。

该水产养殖试验中CK样品及饲喂硝基呋喃样品的GC-MS/MS和 GC-C-IRMS分析结果如表2所示。从中可知，青虾和大闸蟹的CK组样品中 SEM平均含量分别约为12.2μg·kg^-1和23.6μg·kg^-1，而饲喂硝基呋喃组样品中青虾和大闸蟹的SEM含量均显著增加，分别为64.5～158.8μg·kg^-1和104.2～260.3μg·kg^-1，这说明在水产养殖中使用硝基呋喃类抗生素将造成代谢物SEM增加甚至超标。CK组青虾和大闸蟹样品的SEM平均δ¹⁵N值分别高于7.55‰和8.65‰，而三组饲喂硝基呋喃组样品的平均δ¹⁵N值分别在 1.11‰～1.99‰和1.33‰～2.46‰之间；ANOVA比较显示两种动物源水产品CK 组与饲喂硝基呋喃组的SEMδ¹⁵N值差异极显著(即表2中“**”标记)，这表明由硝基呋喃输入而降解产生外源性SEM将比生物体内含氮化合物(如氨基酸)代谢产生内源性SEM消耗更多的¹⁵N。与CK组的分析结果相比较，水产养殖中输入硝基呋喃增加了SEM含量，而δ¹⁵N值却明显降低，这种现象称为¹⁵N缺失。各实验组青虾和大闸蟹样品中SEM平均含量及其δ¹⁵N值如图2所示，该图直观反映了各CK组的SEM含量均处于最低水平，而δ¹⁵N 值却高于饲喂硝基呋喃组。基于此，GC-C-IRMS分析SEM的δ¹⁵N值可作为动物源水产品中SEM源解析和水产养殖中滥用硝基呋喃类抗生素的单体化合物。

表2 GC-MS/MS、GC-C-IRMS和EA-IRMS分析分别对3个CK和27个呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因呋喃内源样品的SEM 含量、δ¹⁵N值、Gly和组织蛋白的δ¹⁵N值分析结果表

注：“***”和“ns”表示两组之间的值差异极显著或不显著

进一步地，分别研究了外源性硝基呋喃前体和内源性氨基酸与SEMδ¹⁵N 值的关系。从多家试剂公司购买的三种硝基呋喃前体的δ¹⁵N值在0.3‰～0.7‰之间(见表1)。此外，采用GC-C-IRMS测定了青虾和大闸蟹样品的δ¹⁵N值和Gly值。CK样品组和饲喂硝基呋喃样品组的Gly的值均在7.10‰～8.28‰和8.63‰～9.34‰之间，而两组间的SEM值差异较大(即表2中“**”标记)。线性回归分析和方差分析比较以解释SEM的差异性和相关性如图3所示，从中可知，CK组中两种水产品的SEM和Gly的δ¹⁵N值高度一致，R²分别为 0.9737(图3(1))和0.9341(图3(3))，然而，SEM的δ¹⁵N值与Gly的相关性与硝基呋喃类药物的投入量呈负相关，其回归系数(R²)分别为0.0044 和0.2933。CK样品组中SEM和Gly的δ¹⁵N值的方差分析p值高于1.103和 0.977，而饲喂硝基呋喃样品组低至0.001和0.005以下(如表2所示)，表明内源性SEM的δ¹⁵N值可由生物体内Gly的δ¹⁵N值估计。

以EA-IRMS分析直接测定组织蛋白样品的δ¹⁵N值以预测其SEM的δ¹⁵N 值的结果如图3所示，CK样品中青虾和大闸蟹的SEM和组织蛋白δ¹⁵N值具较高一致性，R²分别为0.9666(图3(2))和0.9485(图3(4))，方差分析比较p值分别为0.994和0.892，R²低至分别为0.0011和0.4848。CK样品中 SEM和组织蛋白的δ¹⁵N值的方差分析p值均高于1.007和0.822，而饲喂硝基呋喃样品组中均低于0.001和0.009(表2)，说明内源性SEM的δ¹⁵N值也可由组织蛋白值来预测。

进一步地，外源性SEM的δ¹⁵N值取决于其硝基呋喃前体，而内源性SEM 的δ¹⁵N值与青虾和大闸蟹的氨基酸及组织蛋白高度相关。外源性和内源性 SEM的δ¹⁵N值可以通过硝基呋喃前体和组织蛋白的δ¹⁵N值间接预测。

动物源食品中SEM的源解析：外源性和内源性SEM的δ¹⁵N值均基于国际初始标准的δ¹⁵N值(即大气氮气，δ¹⁵N＝0‰)计算，则动物体内SEM的总δ¹⁵N值可由外源性和内源性SEM的δ¹⁵N值及百分比表示，见下式：δ¹⁵N_{生物体内SEM总量}＝δ¹⁵N_外源性SEM×％SEM_外源性+δ¹⁵N_内源性SEM×％SEM_内源性内源性和外源性SEM的百分比可由下式计算：

外源性和内源性SEM含量用C_外源性SEM和C_内源性SEM表示：

C_外源性SEM＝％SEM_外源性×C_{生物体内SEM总量}

C_内源性SEM＝％SEM_内源性×C_{生物体内SEM总量}

实施例5市场盲样检测

基于上述研究，应用该源解析策略对洞庭湖地区随机采集的5批青虾和5批大闸蟹盲样进行SEM源解析。C_{生物体内SEM总量}，δ¹⁵N_{动物体内SEM总量}及δ¹⁵N_蛋白质采用GC-MS/MS、GC-C-IRMS和EA-IRMS分析测定，外源性与内源SEM性的百分比及含量结果如表3所示。从中可知，2/5的青虾和3/5的大闸蟹中SEM含量相对较高(即表3中“√”标记)。因此，该样本结果反映了硝基呋喃类药物在水产养殖中非法滥用的结论。此外，SEM源解析表明，仅1个青虾样品和1个大闸蟹样品疑似使用硝基呋喃类化合物，％SEM_外源性值分别为73.03％和45.53％，C_外源性SEM分别为84.5μg·kg^-1和69.6μg·kg^-1(即表3中“√”标记)。另有1 个青虾和2个大闸蟹样品不含硝基呋喃类物质，即％SEM_外源性值小于5％， C_外源性SEM小于2.5μg·kg^-1，在实验误差范围内可忽略不计。因此，证明基于SEM的GC-CIRMS氮同位素源解析策略可以清楚地阐述其在青虾和大闸蟹中的来源。

表3洞庭湖地区5批青虾和5批大闸蟹盲样的SEM来源确证结果表

注：“√”表示判定水产养殖中非法使用硝基呋喃类抗生素

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (7)

1.一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一、取待测样品自然解冻并于低温下粉碎，准确称取50g样品匀浆后，经干燥研磨过筛得到样品粉末，保存待EA-IRMS分析用；

步骤二、准确称取50g样品匀浆后，加入萃取剂在超声环境下进行萃取，经离心处理后获取上清液，保存待GC-MS/MS和GC-C-IRMS分析用；

步骤三、将100ml上清液以每秒2滴的速度洗脱过氨基亲和固相萃取柱，再以20ml 50％的乙腈溶液淋洗用以除去非目标含氮化合物，最后以每秒1滴的速度加入5ml 1％盐酸水溶液将氨基亲和固相萃取柱上的SEM洗脱下来，获得浓缩SEM；

步骤四、在70℃的0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液中加入乙醛溶液，用乙醛溶液与浓缩SEM中的氨基发生羰氨亲核反应并保持20min，随后将0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液温度调整为60℃并加入溴甲烷溶液，溴甲烷溶液与浓缩SEM中另外两个酰氨基进一步发生N-烷基化反应并保持30～60min；

步骤五、准确称取待测样品粉末以及多个分析标准品各2mg，并放入到锡囊包裹以进行稳定氮同位素分析并计算稳定氮同位素比值，随后再进行GC-MS/MS及GC-C-IRMS分析测定，稳定氮同位素比值的计算方式为：

δ(‰)＝(R_样品/R_标准品-1)×1000

式中δ为样品的稳定氮同位素，R为¹⁵N/¹⁴N；

步骤六、以δ¹⁵N_硝基呋喃代替δ¹⁵N_外源性SEM，δ¹⁵N_蛋白质代替δ¹⁵N_内源性SEM，

通过以下计算公式计算外源性和内源性SEM的百分比：

步骤七、按照以下公式计算外源性和内源性SEM的含量，外源性SEM含量用C_外源性SEM表示，内源性SEM含量用C_内源性SEM表示：

C_外源性SEM＝％SEM_外源性×C_{生物体内SEM总量}

C_内源性SEM＝％SEM_内源性×C_{生物体内SEM总量}。

2.根据权利要求1所述的一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，其特征在于，所述步骤一的具体步骤为：取待测样品自然解冻并于低温下粉碎，准确称取50g样品匀浆后，置于-80℃真空冷冻箱干燥48h，干燥样品经研磨过200目筛得到样品粉末，保存待EA-IRMS分析用。

3.根据权利要求1所述的一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，其特征在于，所述步骤二的具体萃取条件为：萃取溶剂CH₃CN比例为10％，水浴温度为60℃，超声功率为400Hz。

4.根据权利要求1所述的一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，其特征在于，所述步骤五中稳定氮同位素分析通过EA-IRMS分析仪进行，在C/N模式下对样品连续流动分析，燃烧炉和还原炉温度分别为950℃和600℃，载气流速为230mL·min^-1，以高纯氮气作参比气。

5.根据权利要求1所述的一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，其特征在于，所述步骤五中的GC-MS/MS及GC-C-IRMS分析测定具体条件为：

GC条件：载气为高纯氦气，升温程序为：0～5min，50℃；5～10min，150℃；15～20min，230℃，保持5min；

MS条件：SEM、甲基氨基脲、二甲基氨基脲的质谱监测离子对分别为100.1→100.1，114.4→100.1和129.3→114.5。

6.根据权利要求1所述的一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，其特征在于，所述步骤六中的生物体内SEM总量的δ¹⁵N值通过如下公式计算：

δ¹⁵N_{生物体内SEM总量}＝δ¹⁵N_外源性SEM×％SEM_外源性+δ¹⁵N_内源性SEM×％SEM_内源性。

7.根据权利要求1所述的一种基于氮同位素GC-IRMS分析的动物源水产品中SEM源解析方法，其特征在于，所述步骤五中分析标准品包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和甘氨酸。

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