CN109813774B - 一种光致电化学传感器检测瘦肉精雷托帕明的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学与光致电化学传感器领域,具体涉及一种光致电化学传感器检测瘦肉精雷托帕明的方法。用g‑C3N4/CuPPcs修饰金电极,孵育上分子探针,构建光致电化学传感器,在经过雷托帕明与适体DNA作用,以及与捕获复合物CP反应后,以光致电化学信号变化为分析信号,以实现对雷托帕明的测定。
Description
技术领域
本发明属于分析化学与光致电化学传感器领域,具体为一种光致电化学传感器检测瘦肉精雷托帕明的方法。
背景技术
瘦肉精是一种肾上腺类神经兴奋剂,我国不允许在动物的饲料、饮用水中添加瘦肉精。瘦肉精的残留会通过食物链的作用蓄积于人体内,造成人体心率过速、心率失常、肌肉疼痛和晕眩等症状,甚至会导致死亡。因此,建立快速、有效的瘦肉精检测方法具有重要意义。由于食品基质复杂,动物源食品中瘦肉精残留的含量低,因此在仪器检测之前,食品样品需要进行前处理。动物源食品中瘦肉精的样品前处理方法主要有固相萃取、固相微萃取和液相微萃取。雷托帕明是属于瘦肉精的一种,是一种β型肾上腺素兴奋剂,如果在动物饲养中非法使用它来减少动物脂肪组织,增加蛋白质的含量,就会引起人类食物中毒,产生一些不良的反应,如肌肉震颤、心动过速、头痛等。现有的检测方法有胶体金免疫层析试纸法(陈莲英.三种常用“瘦肉精”多联胶体金免疫层析检测试纸的研发[D].华南农业大学,2012;王亚宾.检测硝基咪唑类药物、莱克多巴胺和安定残留的酶联免疫法的建立[D].山东大学,2011;励炯,林伟杰,王红青,等.HPLC-MS/MS测定动物源性中药中的3种β-受体激动剂残留[J].中国现代应用药学,2018,35(4):501-505;新型瘦肉精多残留胶体金检测卡的研制[J].现代食品科技,2018(1):233-238;郭艳琼,张晓光,邬杰,等.高效液相色谱—串联质谱法测定畜肉组织中四环素及3种β-受体激动剂的研究[J].畜牧与饲料科学,2018,241(4):16-20.)等,这些方法一定程度上能够满足市场需要,但是,方法复杂,操作繁琐。
发明内容
鉴于现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种光致电化学传感器检测瘦肉精雷托帕明的方法。
本发明的目的是这样实现的:用g-C3N4/CuPPcs修饰金电极,孵育上分子探针,构建光致电化学传感器,在经过雷托帕明与适体DNA作用,以及与捕获复合物CP反应后,以实现对雷托帕明的测定;一种光致电化学传感器,包括如下步骤:
(1)g-C3N4/CuPPcs的合成
A、称取12g尿素于坩埚中,以5℃/min的升温速率,在550℃下煅烧4h。加热结束后,将坩埚自然冷却至室温,并将所得的产物g-C3N4收集,捻碎成粉末,供进一步使用。
B、在反应釜中加入0.24g的CuCl2·2H2O、1.00g的1,2,4,5-苯四甲腈、0.076g的(NH4)2Mo2O7和3.50g的尿素,在200℃下加热5h。加热完毕后自然冷却至室温,将反应物分别用超纯水、丙酮、甲醇清洗数次。真空干燥后,再分别用丙酮、甲醇和三氯甲烷回流12h。然后将得到的固体吸滤后得到聚合酞菁铜CuPPcs。将g-C3N4粉末和CuPPcs组成的一定量混合物分散在水中,在超声波下混合2h,得到g-C3N4/CuPPcs。
(2)3D DNA的合成
将四条DNA单链(P1,P2,P3,P4)一起溶解在缓冲液(10mM的Tris-盐酸,50mM的MgCl2,pH 8.0)中,得终浓度为分别为50μM的DNA混合溶液。随后,将得到的混合物在95℃下加热2min,然后立即冷却至4℃,得到3D DNA结构。
(3)捕获复合物CP的制备
将OB、SB、LB各5ng放置于200μL的3D DNA结构溶液中,37℃下反应30min,得捕获复合物CP,4℃保存备用。
(4)探针probe的制备
用柠檬酸钠法制备粒径为20nm的胶体金溶液。将100nM的pDNA和AuNPs溶液混合,形成体积为200μL混合溶液,在37℃下在摇床中孵育24h。然后在15000rpm的转速下离心30min,将沉淀重新分散在200μL的超纯水中。将制备出的pDNA/AuNPs复合物标记为探针probe。
(5)g-C3N4/CuPPcs/GE电极的制备
在每步修饰电极之前,裸金电极进行预处理:分别用1.0、0.3和0.05μm的氧化铝进行抛光,然后分别在无水乙醇和超纯水中超声5min,备用。将上述制备的20μL浓度为1mg/mL的g-C3N4/CuPPcs溶液均匀滴涂在处理好的GE的表面,在自然环境下干燥。将干燥后的修饰电极记为g-C3N4/CuPPcs/GE。
(6)probe/g-C3N4/CuPPcs/GE的制备
将制备的40μL的探针滴涂在准备好的g-C3N4/CuPPcs/GE表面,记为probe/g-C3N4/CuPPcs/GE,得光致电化学传感器。
(7)目标物的检测
一种光致电化学传感器检测瘦肉精雷托帕明的方法,当光致电化学传感器在没有目标物雷托帕明的时候,探针无法脱落,进行光致电化学测试,得光致电化学信号I0;当有目标物雷托帕明的时候,雷托帕明与双链DNA中的适体链特异性结合,将另一条链C释放。释放的C链与捕获复合物CP作用发生反应,SB链被取代下来,取代下来的SB链与电极表面吸附的probe作用,使得probe从电极表面脱落,使得光致电化学信号恢复;在F的作用下,C和OB被F取代从而被释放,所以C参与到下一个循环中释放出更多的SB。SB进一步与探针中的pDNA相结合,将探针从所构造的g-C3N4/CuPPcs/GE电极的表面拽下。在此过程中依次形成中间体M1、M2、M3和M4,以及废料W。没有了AuNPs和g-C3N4/CuPPcs之间的能量共振转移,PEC信号得以恢复,测得信号为I。因此,一种基于熵驱动3D DNA放大器的信号恢复型PEC生物传感器构建形成。以I-I0为分析信号,进行雷托帕明的测定,包括如下步骤:
取100μL雷托帕明样品溶液,加入到200μL浓度为1μM的由适体DNA和C链组成的双链DNA溶液中,37℃下反应30min。再将(3)所得的100μL CP溶液、浓度为1μM的燃料F溶液加入,37℃下反应120min。再把(6)制得的probe/g-C3N4/CuPPcs/GE插进溶液中进行孵育,室温下反应0.5h。随后将电极拿出并冲洗再进行光致电化学检测。
(8)光致电化学检测:光致电化学检测是在室温下条件下进行的,电解液是含有1μM多巴胺的0.1M的pH 7.4磷酸缓冲溶液,其中多巴胺作为电子供体增加电子转移的数量。以上述(7)所得的电极为工作电极,白LED灯作为激发光源,每10s开一次。设置的偏压是0.1V。
由于上述方法制备的光致电化学传感器可以检测雷托帕明,因此,本发明提供了上述的光致电化学传感器在检测雷托帕明含量中的应用。
与现有技术相比,本发明涉及的光致电化学传感器具有如下优点和显著地进步:CuPPcs与g-C3N4通过形成异质结,有效地增强了单纯g-C3N4的光致电化学信号。将pDNA与AuNPs相连,设计了一种探针,利用AuNPs与g-C3N4/CuPPcs材料之间的能量共振转移猝灭g-C3N4/CuPPcs的PEC信号,在有目标物存在的条件下,探针从电极表面脱落,使得此时的光致电化学信号的恢复。同时引入循环放大反应提高检测信号,以及3D DNA结构起到一定的稳定作用。因此,本发明涉及的一种g-C3N4/CuPPcs修饰电极光致电化学传感器制备方法及检测雷托帕明的方法和应用及应用有良好的发展前景。
DNA从北京赛百盛基因技术有限公司获得。它们的核苷酸序列如下,从左到右为5’到3’方向。
Aptamer AGTTAATCACTTGCCATACTAGTTTTGAAAATCATCTCTG
C GATTAACTCAGAGATGATTTTCAAAACTAGTATGGCAAGT
OB GCATCCACATCCTTTC
SB CAGAGATGATTTTCAAAACTAGTATGGCAAGTTCCCTTATACTACATACACC
LB GGATGCGGGAACTTGCCATACTAGTTTTGAAAATCATCTCTGAGTTAATC
F CAGAGATGATTTTCAAAACTAGTATGGCAAGTTCCCGCATCC
pDNA GGTGTATGTAGTATAA
P1 ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCAT AGTATTAGCTCAGGATGCGGGAACTTGCCATACTAGTTTTGA AAATCATCTCTGA GTTA ATC
P2 TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC
P3 TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT
P4 TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC
当利用其它相应的适体时,结合对应的DNA序列,这种检测技术还可以测量其他分析物,因此,这样一种简便的技术将会变成一种新的光致电化学传感器。这种传感器具有高灵敏度和选择性的特点。
有益效果:在优选的试验条件下,目标物雷托帕明的浓度在0.1pM到1000pM范围内与光致电化学信号成线性函数关系式。线性函数关系式为:I(μA)=0.448+0.056logc(c,pM,雷托帕明浓度),相关系数R2=0.996,当浓度为1pM时,相对标准偏差RSD(n=7)为2.85%。同时,方法具有高的选择性。
附图说明
图1实验原理图。
图2透射电镜图。(A)g-C3N4;(B)CuPPcs;(C)g-C3N4/CuPPcs。
图3不同电极的光致电化学信号。金电极(曲线a、a’);g-C3N4(曲线b、b’)、CuPPcs(曲线c、c’)、g-C3N4/CuPPcs(曲线d、d’)修饰金电极分别在不含DA的0.1M的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)和含有0.1M DA的磷酸缓冲溶液中的光致电化学信号。
图4电极表面不同状态的电化学阻抗图。(a)金电极;(b)g-C3N4/CuPPcs/GE;(c)probe/g-C3N4/CuPPcs/GE;(d)probe/g-C3N4/CuPPcs/GE与雷托帕明作用后的电化学阻抗图。
图5 pH优化。
图6光致电化学信号与雷托帕明浓度关系图。
图7选择性
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明,但不构成对发明的进一步限制。
实施例1 g-C3N4/CuPPcs的PEC表征
g-C3N4、CuPPcs、g-C3N4/CuPPcs的PEC响应如图3所示。通过图3可知,金电极在磷酸缓冲溶液中几乎没有PEC信号,但是在含有DA的磷酸缓冲溶液中产生了将近-20nA的光电流信号。这证明了DA能在电解液中作为电子供体,增强电极的PEC信号。g-C3N4修饰金电极有很好的PEC响应;CuPPcs修饰金电极信号和裸金电极信号相比没有显著的提高;但是g-C3N4与CuPPcs复合之后,g-C3N4/CuPPcs修饰金电极的信噪比达到了11,比单独g-C3N4和CuPPcs修饰金电极的信噪比有所提高。因此,能够证明所合成的g-C3N4/CuPPcs复合材料有好的PEC响应。
实施例2 pH优化
将电极分别在含10-4M的多巴胺的溶液中,pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下测定光致电化学信号。图5为在电位0.1V条件下,在不同pH条件下测定的光致电化学信号响应。以pH作为实验变量,可以看出,当pH从6.0增加到7.4的时候,对应的PEC信号是逐渐增加的;但是当pH从7.4增加到8.0的时候,对应的PEC信号确实逐渐降低的,并在pH为7.4的时候,对应的PEC信号达到最大值。
实施例3电化学阻抗对光致电化学生物传感器构建的表征
为了进一步表征传感器的构建过程,还进行了电化学阻抗(EIS)的检测。如图4所示,与裸电极(曲线a)的电荷转移电阻数(Ret)相比,g-C3N4/CuPPcs/GE(曲线b)的明显减小,这是因为g-C3N4/CuPPcs能快速传递电子进行转移。而probe/g-C3N4/CuPPcs/GE的Ret(曲线c)又有所增加,证明探针确实固定在了修饰电极的表面。并且,这么高的Ret的原因是pDNA和AuNPs都是带负电荷的。当雷托帕明存在的时候,熵驱动的循环放大反应被驱动,probe/g-C3N4/CuPPcs/GE表面的探针发生脱落,使Ret增加(曲线d)。这些数据证明了PEC生物传感器的成功构建。
实施例4方法灵敏度试验
考察了方法测定的灵敏度和线性范围等分析特性(图6)。在优选的试验条件下,目标物雷托帕明的浓度在0.1pM到1000pM范围内与光致电化学信号成线性函数关系式。线性函数关系式为:I(μA)=0.448+0.056logc(c,pM,雷托帕明浓度),相关系数R2=0.996,当浓度为1pM时,相对标准偏差RSD(n=7)为2.85%。
实施例5方法的选择性
为了考察所构建的传感器的选择性,设计了克伦特罗、沙丁胺醇、肾上腺素、多巴胺、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和亲和素等物质对雷托帕明的干扰性实验。图7中a组雷托帕明浓度是1nM,7种干扰物的浓度10倍于雷托帕明浓度时,probe/g-C3N4/CuPPcs/GE生物传感器分别在8种单独的物质中的PEC信号。b组是分别将10倍高于雷托帕明浓度的7种干扰物与雷托帕明混合后,probe/g-C3N4/CuPPcs/GE生物传感器的PEC信号。可以看出,所设计的传感器在检测雷托帕明时对这些干扰物有很好的抗干扰能力。所以,所构建的PEC生物传感器对雷托帕明具有很好的选择性。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 一种光致电化学传感器检测瘦肉精雷托帕明的方法
<130> 11
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
agttaatcac ttgccatact agttttgaaa atcatctctg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gattaactca gagatgattt tcaaaactag tatggcaagt 40
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gcatccacat cctttc 16
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
cagagatgat tttcaaaact agtatggcaa gttcccttat actacataca cc 52
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
ggatgcggga acttgccata ctagttttga aaatcatctc tgagttaatc 50
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
cagagatgat tttcaaaact agtatggcaa gttcccgcat cc 42
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
ggtgtatgta gtataa 16
<210> 8
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagtattagc 60
tcaggatgcg ggaacttgcc atactagttt tgaaaatcat ctctgagtta atc 113
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
Claims (2)
1.一种光致电化学传感器的制备方法,其特征包括如下步骤:
(1)g-C3N4/CuPPcs的合成
A、称取12g尿素于坩埚中,以5℃/min的升温速率,在550℃下煅烧4h;加热结束后,将坩埚自然冷却至室温,并将所得的产物g-C3N4收集,捻碎成粉末,供进一步使用;
B、在反应釜中加入0.24g的CuCl2·2H2O、1.00g的1,2,4,5-苯四甲腈、0.076g的(NH4)2Mo2O7和3.50g的尿素,在200℃下加热5h;加热完毕后自然冷却至室温,将反应物分别用超纯水、丙酮、甲醇清洗数次;真空干燥后,再分别用丙酮、甲醇和三氯甲烷回流12h;然后将得到的固体吸滤后得到聚合酞菁铜CuPPcs;将g-C3N4粉末和CuPPcs组成的一定量混合物分散在水中,在超声波下混合2h,得到g-C3N4/CuPPcs;
(2)3D DNA的合成
将四条DNA单链P1、P2、P3、P4一起溶解在10mM的Tris-盐酸含50mM的MgCl2 pH8.0缓冲液中,得终浓度分别为50μM的DNA混合溶液;随后,将得到的混合物在95℃下加热2min,然后立即冷却至4℃,得到3D DNA结构;
(3)捕获复合物CP的制备
将OB、SB、LB各5ng放置于200μL的3D DNA结构溶液中,37℃下反应30min,得捕获复合物CP,4℃保存备用;
(4)探针probe的制备
用柠檬酸钠法制备粒径为20nm的胶体金溶液;将100nM的pDNA和AuNPs溶液混合,形成体积为200μL混合溶液,在37℃下在摇床中孵育24h;然后在15000rpm的转速下离心30min,将沉淀重新分散在200μL的超纯水中;将制备出的pDNA/AuNPs复合物标记为探针probe;
(5)g-C3N4/CuPPcs/GE电极的制备
在每步修饰电极之前,裸金电极进行预处理:分别用1.0、0.3和0.05μm的氧化铝进行抛光,然后分别在无水乙醇和超纯水中超声5min,备用;将上述制备的20μL浓度为1mg/mL的g-C3N4/CuPPcs溶液均匀滴涂在处理好的GE的表面,在自然环境下干燥;将干燥后的修饰电极记为g-C3N4/CuPPcs/GE;
(6)probe/g-C3N4/CuPPcs/GE的制备
将制备的40μL的探针滴涂在准备好的g-C3N4/CuPPcs/GE表面,记为probe/g-C3N4/CuPPcs/GE,得光致电化学传感器;
所述的DNA部分序列为:
Aptamer AGTTAATCACTTGCCATACTAGTTTTGAAAATCATCTCTG
C GATTAACTCAGAGATGATTTTCAAAACTAGTATGGCAAGT
OB GCATCCACATCCTTTC
SB CAGAGATGATTTTCAAAACTAGTATGGCAAGTTCCCTTATACTACATACACC
LB GGATGCGGGAACTTGCCATACTAGTTTTGAAAATCATCTCTGAGTTAATC
F CAGAGATGATTTTCAAAACTAGTATGGCAAGTTCCCGCATCC
pDNA GGTGTATGTAGTATAA
P1 ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTAGCTCAGGATGCGGGAACTTGCCATACTAGTTTTGA AAATCATCTCTGA GTTAATC
P2 TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC
P3 TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT
P4 TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC
以上序列从左到右为5’到3’方向。
2.一种利用权利要求1所述方法制备的光致电化学传感器检测瘦肉精雷托帕明的方法,包括如下步骤:
取100μL雷托帕明样品溶液,加入到200μL浓度为1μM的由适体DNA和C链组成的双链DNA溶液中,37℃下反应30min;再将所述(3)所得的100μL CP溶液、浓度为1μM的燃料F溶液加入,37℃下反应120min;再把所述(6)制得的probe/g-C3N4/CuPPcs/GE插进溶液中进行孵育,室温下反应0.5h;随后将电极拿出并冲洗再进行光致电化学检测;
光致电化学检测:光致电化学检测是在室温下条件下进行的,电解液是含有1μM多巴胺的0.1M的pH 7.4磷酸缓冲溶液,其中多巴胺作为电子供体增加电子转移的数量;白LED灯作为激发光源,每10s开一次;设置的偏压是0.1V;有目标物瘦肉精雷托帕明存在时产生信号I,没有目标物瘦肉精雷托帕明存在时产生信号I0,以I-I0为分析信号,进行雷托帕明的测定。
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CN109813774A (zh) | 2019-05-28 |
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