CN108008038A - 测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，包括以下步骤：制备待测样品溶液；制备标准溶液；将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；将待测样品溶液作相应检测所得的数据代入标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。4种硝基呋喃类药物代谢产物为：呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AOMZ)、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)。

Description

测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的 方法

技术领域

本发明涉及一种适用于动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的分散固相萃取结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法。

背景技术

硝基呋喃类药物，是一类人工合成的抗生素，具有5-硝基呋喃母核机构，主要包括呋喃唑酮(FZD)、呋喃妥因(NFT)、呋喃西林(NFZ)、呋喃它酮(FTD)等。

硝基呋喃类药物对细菌具有广谱的抑制和杀灭作用，对大量革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、原虫均有作用；硝基呋喃类药物具有慢性毒性，可引起消化道反应，如恶心、呕吐、厌食、腹泻等，还可引起溶血性贫血和黄疸；长时间或大剂量使用硝基呋喃类药物均能对动物体产生毒性作用，还具有致癌、致畸、致突变作用。2008年，美国环境保护署环境健康风险评估办公室将呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮列入加利福利亚州65种致癌物名单(State of California Proposition 65Carcinogens List)。

硝基呋喃类药物的代谢途径大多相似，通常会在酶的作用下使呋喃开环形成丙烯腈衍生物，此衍生物再同谷胱甘肽(glutathione，GSH)、巯基乙醇、膜蛋白等进行可逆结合，在低pH环境下结合比较牢固。该结合物分别具有呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AOMZ)、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)等的完整侧链结构，在弱酸性环境下释放这些侧链结构，经过冷藏、(烘烤、油炸、微波)烹煮等处理后，这些小分子代谢物依然能维持稳定。

硝基呋喃类药物，由于价格低廉和良好的抗菌效果，被广泛应用与禽畜、水产养殖。虽然各国都对硝基呋喃类药物在食用动物的使用作了严格的限定，但是该类药物的滥用仍然屡禁不止。

动物胶类中药是以动物的皮、角、甲或骨为原料，将其中的胶质煎至水中，以豆油、黄酒等为辅料，浓缩，干燥后制成的固体胶。胶体中药含有较高含量的蛋白质，当动物原体喂以硝基呋喃类药物时，硝基呋喃类药物在动物体内的半衰期短，代谢速度快，其代谢产物能够与组织蛋白质紧密结合，以结合态形式在体内残留较长时间，甚至经过蒸煮、烘烤、磨碎和微波加热也无法有效降解，且毒性更强，所以胶体中药类中的硝基呋喃类药物残留问题尤其需要引起人们的注意。

目前，国内尚无相关动物胶类中药中硝基呋喃类药物代谢产物残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法的相关报道。近年来，我国医疗模式正由“疾病治疗”转变为“疾病预防”，“治未病”的意识越来越为大众所接受。因此，作为人们常用为滋补药的胶类中药，也随之逐渐火热，胶类中药生产企业如雨后春笋般出现。目前，仅山东省内的胶类中药生产企业就达上百家。其中，胶类中药整个行业产品及胶类复方制剂有400余种，阿胶行业发展呈现出一派“蓬勃”景象。中药胶剂是祖国传统医药宝库中重要的组成部分，使用历史悠久，原料种类来源丰富、生产工艺繁复、临床应用广泛，且外观性状、组织特征和化学组成等与其他动物源食品相比，存在很大差异，对动物胶类中药的硝基呋喃类药物代谢产物残留检测问题就显得非常棘手。本发明很好的解决了在检测动物胶类中药中硝基呋喃类药物代谢产物残留过程中的问题，为保障人类健康、提升企业自身技术发展水平、促进我国检测技术的发展，提升我国胶类中药质量安全检测技术在国际上的地位，增加就业，带动胶类中药产业的全面进步，为技术的进步、产业的转型升级都具有很大的经济社会效益，研究动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的分散固相萃取结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、定性定量，灵敏度高的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，即提供一种适用于动物源胶类中药中四种硝基呋喃类代谢产物药物残留检测的分散固相萃取结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，包括以下步骤：

1)、制备待测样品溶液：

1.1、将待测样品粉粹机粉碎后混匀，得试样；

1.2、称取试样1～5g(较佳为2g，精确至0.01g)，置于具塞离心管内，加入5～50ml(较佳为10ml)0.1～0.5mol/L(较佳为0.2mol/L)盐酸溶液，溶解(超声溶解)；

1.3、在步骤1.2所得的溶解后试样溶液中加入50～200ul(较佳为100ul)0.1～1mg/ml(较佳为0.5mg/ml)胃蛋白酶，同时加入50～200ul(较佳为100ul)2-硝基苯甲醛溶液(乙醇溶解)，37℃恒温水浴振荡6～24h(较佳为12h)；

1.4、在步骤1.3所得的样品溶液中精密加入5～20ml(较佳为10mL)含1～10％(v/v)(较佳为5％)甲酸的乙腈溶液，漩涡振荡提取5～20min(较佳为10min)，加入2～10g(较佳为5g)氯化钠和5～10g(较佳为8g)无水硫酸钠，旋涡1～5min(较佳为2min)，以4000～8000r/min(较佳为5000r/min)的速度离心2～10min(较佳为5min)，精密吸取上清液Ⅰ(5ml)全部转移至10mL聚丙烯离心管中，待净化；

1.5、在步骤1.4所得的待净化样液中加入净化剂(内含500～2000mg(较佳为1000mg)无水硫酸钠，100～500mg(较佳为300mg)C18-N以及100～500mg(较佳为250mg)NH₂-PSA)，旋涡1～5min(较佳为2min)混匀，以4000～8000r/min(较佳为5000r/min)的速度离心2～10min(较佳为5min)；

1.6、精密取步骤1.5所得的上清液Ⅱ1～5ml(较佳为3ml)置于PRiME HLB固相萃取柱(3ml，60mg)中，取滤液用0.20～0.45um过滤头过滤，得上清液Ⅲ；目的是供超高效液相色谱-串联质谱仪进行定性定量分析；

2)、制备标准溶液

2.1、用色谱纯有机溶剂(甲醇或乙腈)分别将4种硝基呋喃类药物代谢产物标准物质(如表1所示)溶解，配置成浓度均为1000ug/mL的4种硝基呋喃类药物代谢产物标准储备溶液，于-20℃保存；

2.2、各取适量上述标准储备溶液用有机溶剂(甲醇或乙腈)配制成浓度为100mg/L的混合标准储备溶液；

2.3、分别取事先已知为阴性的粉碎后的空白样品(与实际检测样品的基质一样)6份，每份取2g，分别加入适量的混合标准储备溶液，按照1)待测溶液制备基质标准溶液，使得最终6份样品溶液中四种硝基呋喃类药物代谢产物浓度分别浓度为2ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L，作为标准系列工作溶液；

3)、将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；

4)、取步骤1)所得的上清液Ⅲ按步骤3)方法测定上清液中各硝基呋喃类药物、峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。

作文本发明的改进：所述4种硝基呋喃类药物代谢产物残留：呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AOMZ)、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)。

作文本发明的进一步改进：

所述的步骤3)的色谱条件(即超高效液相色谱(UPLC)检测用的液相色谱条件)为：流速：0.3～0.8ml/min(较佳为0.5mL/min)；柱温：20～50℃(较佳为40℃)；进样量0.5～5μL(较佳为1μL)；

流动相由流动相A和流动相B组成：流动相A为乙腈；流动相B为体积浓度为0.0005mol/L乙酸铵溶液；

梯度洗脱程序为：0～3.5min，5％(v/v)A；3.5～3.51min，5～25％(v/v)A；3.51～5.80min，25％(v/v)A；5.80～5.81min，25～5％(v/v)A；5.81～8min，5％(v/v)A。

上述％为体积％。

作为本发明的进一步改进：所述液相色谱柱为：

所述步骤3)的质谱条件(即三重四级杆串联质谱(MS/MS)检测用的质谱条件)为：电喷雾离子源(ESI)，正离子检测方式(ESI+)；多反应检测(MRM模式)；干燥气温度：200℃；干燥气流速：14L/min；喷雾器压力：200KPa；毛细管电压：3.5KV；校准方法：质量轴自动调谐校正；MRM进行分段扫描：0～4.8min，SEM和AHD；4.8～5.3min，AOZ；5.3～8min，AMOZ；其他质谱分析参数详见表2。

表1、4种硝基呋喃类药物代谢产物质谱分析参数

注：*为定量离子对

表2、4种硝基呋喃类药物代谢产物的化学信息表

作为本发明方法的进一步改进：所述有机溶剂均为色谱纯甲醇、乙腈。

本发明与现有技术相比具有以下显著效果：

(1)本方法利用胃蛋白酶在0.2mol/L盐酸溶液中能酶解蛋白质，同时结合酶解技术，使得与蛋白质结合的硝基呋喃类药物代谢产物完全游离出来，更充分的提取胶类中药这类高蛋白物质中的硝基呋喃类药物代谢产物。

(2)本方法利用分散固相萃取技术与通过式固相萃取柱技术结合，可以去除胶类中药中的蛋白质、脂肪和色素，并同时通过胃蛋白酶酶解胶类中药中的蛋白质，本方法相对其他萃取技术，消除了胶类中药复杂基质带来的基质效应，节省了检测时间，提高了检测准确度。

(3)本方法利用超高效液相色谱系统特有的超高压优势和实行核颗粒色谱技术(Cortecs色谱柱)，优化了高效液相色谱仪运行背压，通过提高分离度以及峰容量实现了液相色谱仪分离效率的最大化，对目标化合物在提高分离度的同时获得更快的分析速度，两种色谱技术的结合，获得了更高的灵敏度，并大大缩短了分析时间，提高了分析效率。

(4)本发明公开的测定方法在2～100ug/L线性关系较好，线性相关系数为0.9985上，方法最低检出限为0.15ug/kg。

综上所述，本发明所述分散固相萃取结合通过式固相萃取净化胶类中药中的杂质，前处理简单，杂质干扰和基质效应较小，回收率较好，重现性较高，本发明所述的超高效液相色谱-串联质谱法能在8分钟内就能快速准确的对4种硝基呋喃类药物代谢产物进行分离、定性定量分析，操作简单，灵敏度和准确度较好。

本发明的技术创新点主要在于是：

1.现有的食品安全标准、药典以及文献中未曾有关于胶类中药中硝基呋喃类药物代谢产物的检测方法的研究，现有的食品安全标准仅适合普通的动物源食品中的硝基呋喃的检测，而中华人民共和国药典(2015年版)阿胶、龟板胶、鳖甲胶等胶类中药检查项均没有硝基呋喃类药物代谢产物的检测项，现有的文献也未曾有胶类中药中的硝基呋喃类代谢产物的检测方法的报导，本发明是一个全新的检测方法的开发。

2.现有技术告知检验硝基呋喃类药物代谢产物过程中将结合态的目标物从蛋白质中脱离出来是采用酸水解的方法，而本发明中发现采用如同本发明所述的酸水解结合胃蛋白酶酶解的前处理技术，能使本发明最终所得的胶类中药中的硝基呋喃类药物代谢产物的检验准确度更加高，并且本发明所采用的酸水解与酶解结合的前处理技术能彻底除去蛋白质等大分子物质对检测结果的基质影响。

3.现有技术告知检验硝基呋喃类药物代谢产物过程中除去杂质(包括蛋白质、脂肪、色素等)采用通过有机溶剂(如正己烷等)来除去杂质，而本发明中发现采用如同本发明所诉的分散固相萃取结合通过式固相萃取小柱进行样品净化，能使本发明最终所得的样品溶液杂质更少，基质效应明显降低，提高了检验的准确性和精确性。

附图说明

图1是4种硝基呋喃类药物代谢产物的总离子流图和定性定量离子对图。图中，1～4分别代表该4种硝基呋喃类药物代谢产物；

图中从上至下依次为总离子流图(TIC)，SEM、AOZ、AHD、AMOZ的定性定量离子图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

1试剂和材料

除非另有说明，在分析中所用试剂均为色谱纯级，所有用水均为一级水。

1.1甲醇

1.2乙腈

1.3甲酸

1.4氯化钠：分析纯

1.5无水硫酸钠：分析纯

1.6 2-硝基苯甲醛：分析纯

1.7胃蛋白酶：250U/mg

1.8十八烷基键合硅胶吸附剂(C₁₈-N)

1.9NH₂-丙基乙二胺吸附剂(NH₂-PSA)

1.10PRiME HLB固相萃取柱：3ml，60mg

1.11硝基呋喃类代谢产物标准物质：氨基脲；1-氨基乙内酰脲；3-氨基-2-噁唑酮；5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷基酮，纯度均≥99.0％。

1.12标准储备液：将上述4种硝基呋喃类药物代谢产物标准物质分别进行如下处理：用甲醇(或者其他合适有机溶剂)分别将4种硝基呋喃类药物代谢产物标准物质配置成浓度约为1mg/mL的标准储备溶液；再精密取适量上述标准储备溶液用甲醇(或者其他合适有机溶剂)配置成浓度为1mg/L的混合标准储备溶液。

1.13标准工作液：将上述混合标准储备溶液用甲醇(或者其他合适有机溶剂)配制成浓度分布为2～100ug/L的混合标准工作溶液。

注：标准储备溶液在-20℃避光保存，有效期为一年。标准工作溶液在4℃下避光保存，有效期为3个月。

2仪器和设备

2.1超高效液相色谱仪(UPLC)。

2.2三重四级杆串联质谱仪(MS/MS)。

2.3分析天平：感量为0.0001g与0.01g。

2.4漩涡振荡器。

2.5高速离心机：最大能到达到10000r/min。

2.6恒温水浴振荡仪。

2.7提取器：聚乙烯离心管，50mL。

2.8有机相过滤膜：0.22um。

实施例1：一种适用于胶类中药中4种硝基呋喃类药物代谢产物残留的分散固相萃取结合固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法，依次进行以下步骤：

1)、制备待测样品溶液：

(1.1)、取胶类中药作为待测样品，将其用中药粉碎机粉粹成粉末，混匀；

(1.2)称取上述粉末样品2g，精确至0.01g，置于聚乙烯离心管内，加入10ml0.2mol/L盐酸溶液，超声溶解；

(1.3)溶解后的试样溶液中加入100ul 0.5mg/ml胃蛋白酶，同时加入100ul 2-硝基苯甲醛溶液(2-硝基苯甲醛溶液的浓度为0.1mol/L，乙醇溶解)，37℃恒温水浴振荡12h；

(1.4)上述步骤所得的样品溶液中精密加入10ml含5％(v/v)甲酸的乙腈溶液，漩涡振荡提取10min，再加入5g氯化钠和8g无水硫酸钠，漩涡振荡提取2min，以5000r/min的速度离心5min，精密吸取上清液Ⅰ5ml全部转移至10mL聚丙烯离心管中，待净化；

(1.5)在待净化样液中加入净化剂，该净化剂由1000mg无水硫酸钠、300mgC₁₈-N(十八烷基键合硅胶吸附剂)以及250mgNH₂-PSA(NH₂-丙基乙二胺吸附剂)组成，旋涡2min混匀，以5000r/min的速度离心5min；

(1.6)精密取步骤(1.5)所得的上清液Ⅱ3ml置于PRiME HLB固相萃取柱(6ml，200mg)中，去除初滤液，取滤液用0.20～0.45um过滤头过滤，得上清液Ⅲ；目的是供超高效液相色谱-串联质谱仪进行定性定量分析；

2)、制备标准溶液

(2.1)用甲醇分别将4种硝基呋喃类药物代谢产物残留标准物质溶解，配置成浓度为1mg/mL的4种硝基呋喃类药物代谢产物标准储备溶液；

(2.2)各取适量上述4种标准储备溶液用甲醇配制成浓度均为100mg/L的混合标准储备溶液；

(3)分别取粉碎后的事先已知为阴性的空白样品(与实际检测样品的基质一样)6份，每份取2g，分别加入适量的混合标准储备溶液(加入量分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mL)，按照步骤1)的“制备待测样品溶液”制备基质标准溶液，使得最终6份样品溶液中四种硝基呋喃类药物代谢产物浓度分别浓度为2ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L，作为标准系列工作溶液；

上述按照步骤1)的“制备待测样品溶液”制备基质标准溶液，即，以“在2g空白样品粉末中加入上述相应量的混合标准储备溶液”以替代步骤1)的(2)中的“粉末样品2g”，后续步骤完全按照步骤1)的(1.2)～(1.6)进行。样品溶液，即，相对应步骤1)的(1.6)所得的上清液Ⅲ。

以0.02ml添加量为例，混合标准储备溶液浓度为1mg/L，加入量为0.02ug，样品中提取溶剂(含5％(v/v)甲酸的乙腈溶液)为10ml，最终样品溶液中的目标物的浓度为2ug/L。

动物源胶类中药包括阿胶、龟板胶、鳖甲胶等，此即为上文中所述的基质。

3)、将步骤2)所得的标准系列工作溶液分别进行以下操作：注入超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程。具体如下：

a)色谱柱：Waters Cortecs C18，50mm×2.1mm，1.6um色谱柱或相当；

b)流速：0.5ml/min；

c)柱温：40℃；

d)进样体积：1ul；

e)流动相：流动相A为乙腈；流动相B为浓度为0.0005mol/L乙酸铵水溶液；

f)梯度洗脱程序见表3

表3、梯度洗脱程序表

g)离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式(ESI+)；

h)监测模式：多反应监测模式(MRM)；进行分段扫描：0～4.8min，SEM和AHD；4.8～5.3min，AOZ；5.3～8min，AMOZ；

i)干燥气：温度：200℃；流速：14ml/min；

j)毛细管电压：3.5KV；

k)毛细管出口电压(Fragmentor)：380V；

l)其他质谱分析参数详见表4。

表4、4种硝基呋喃类药物代谢产物质谱分析参数

注：*为定量离子对。

本发明公开的超高效液相色谱-三重四级杆质谱法在浓度范围2-100ug/L时，4种硝基呋喃类药物代谢产物线性关系均较好，见表5。

表5 4种硝基呋喃类药物代谢产物的线性关系、检测限和定量限

4)、取步骤1)所得的上清液Ⅲ按步骤3)方法测定上清液Ⅲ中各硝基呋喃类药物代谢产物、峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。结果按下式进行计算：

式中：

X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ug/kg)；

c——从标准曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V——样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；即，是指含5％(v/v)甲酸的乙腈溶液的加入体积(即10ml)；

m——样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。即，样品的称样量，2g。

5)、定性分析

对应步骤4)，每一成分都有2个检测通道，每一通道对应一个监测离子对。样品检测时，若某一成分对应的多个通道中均出现与对照品保留时间一致的谱峰，并且这几个子离子的相对丰度与对照品一致，则可判定样品中检出该成分。各成分的丰度数据均符合欧盟2002/657/EC法规关于定性判断时相对离子丰度得允许偏差范围，可判断这些子离子的相对丰度一致。按上述法规的分值法(质谱分析方法鉴定点数)计算，上述定性过程如果达到4分，大于3分的要求，说明该样品中含有该种硝基呋喃类药物代谢产物残留。

6)、定量分析

对应步骤4)，本方法采用外标法定量，根据样品溶液中被测物质含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，对标准工作溶液与样液相同体积参插进样测定，标准工作溶液和待测样品溶液中4种硝基呋喃类代谢产物的响应值均应在线性范围内。

注1：如果样液的检测响应值超出线性范围，可对标准系列工作液进行适当调整。

注2：在上述色谱和质谱条件下，4种硝基呋喃类药物代谢产物的总离子流图和定性定量离子图参见图1。

7)、检测低限

以3倍信噪比(S/N＝3)确定最低检出浓度(LOD)，以10倍信噪比(S/N＝10)确定最低定量浓度(LOQ)，本方法对适用于胶类中药中4种硝基呋喃类药物代谢产物的分散固相萃取结合固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法的检测低限见表5。

实验1、样品添加回收率实验及精密度实验

分别在空白阿胶试样中加入4种硝基呋喃类药物代谢产物的标准混合溶液，添加浓度分别为15ug/kg，50ug/kg，100ug/kg每个浓度设置6个重复，按上述前处理和分析方法，测定4种硝基呋喃类药物代谢产物在胶类中药试样中的添加回收率(线性方程同表1)，见表6。

表6、试样中添加不同浓度的硝基呋喃类药物代谢产物回收率及相对标准偏差(n＝6)

实验2、实际样品检测

将实验室随机抽取的15个胶类中药(包括阿胶、龟板胶、鳖甲胶三大类常见胶类中药)，其中样品1～5号为阿胶，6～10号为鳖甲胶，11～15号为龟板胶，还设置了样品16(已确认为空白的2g阿胶中添加了0.2ml的混合标准储备溶液)、样品17(已确认为空白的2g龟板胶中添加了0.2ml的混合标准储备溶液)、样品18(已确认为空白的2g鳖甲胶中添加了0.2ml的混合标准储备溶液)。

按上述操作步骤，进行提取、衍生、净化，每个样品平行2次，同时分别用空白的阿胶、龟板胶、鳖甲胶作相应的基质标准曲线，用液质联用仪进行测定，得到的样品测定结果见表7。

表7.实际样品测定结果(ug/kg)

ND：表示未检出。

根据表7我们得知：样品2中检出AOZ和AMOZ，样品3中检出AMOZ，样品5中检出AOZ，样品8中检出SEM和AMOZ，样品15中检出SEM和AOZ，样品16～18中4种成分均验出。

验证实验1、将实验2所述的18个胶类中药按照GB/T 20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》和GB/T21311-2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法》进行检测，所得结果为：上述批次样品未检出含有四种硝基呋喃类药物代谢产物。说明本发明的检测精度高于上述现有方法。

对比例1-1、将实施例1步骤(1.3)的“溶解后的试样溶液中加入100uL0.5mg/mL胃蛋白酶，同时加入100ul 2-硝基苯甲醛溶液(乙醇溶解)，37℃恒温水浴振荡12h”改成“加入100ul 2-硝基苯甲醛溶液(乙醇溶解)，37℃恒温水浴振荡16h”；其余等同于实施例1，结果SEM、AHD、AOZ、AMOZ的回收率均低于60％，SEM、AHD、AOZ、AMOZ的检测限分别为2、5、4、3ug/kg，灵敏度和准确度明显降低。

对比例1-2、将实施例1步骤(1.4)、(1.5)及(1.6)改成“在样品溶液中加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH约为7.4，4000r/min离心10min，上清液加入5mL正己烷，振荡2min，4000r/min离心10min后弃去正己烷层，倒入活化好的OasisHLB固相萃取柱(规格：60mg，3mL)进行净化，用5mL乙酸乙酯进行洗脱，洗脱液于40℃水浴氮吹干，用1.0mL样品定容溶液(取10mL乙腈、0.3mL乙酸，用水定容至100mL)溶解，混匀后过0.2um滤膜，上机”，其余等同于实施例1，结果SEM、AHD、AOZ、AMOZ的回收率均低于50％，SEM、AHD、AOZ、AMOZ的检测限分别为4、8、4、5ug/kg，灵敏度和准确度明显降低。

对比例1-3、将实施例1步骤(1.6)去掉，其余等同于实施例1，结果SEM、AHD、AOZ、AMOZ的回收率均低于70％，SEM、AHD、AOZ、AMOZ的检测限分别为2、5、4、3ug/kg，灵敏度和准确度明显降低。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显示，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所以变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、制备待测样品溶液：

1.1、将待测样品粉粹机粉碎后混匀，得试样；

1.2、称取试样1～5g，加入5～50ml的0.1～0.5mol/L盐酸溶液，溶解；

1.3、在步骤1.2所得的溶解后试样溶液中加入50～200ul的0.1～1mg/ml胃蛋白酶，同时加入50～200ul的2-硝基苯甲醛溶液，37±1℃恒温水浴振荡6～24h；所述2-硝基苯甲醛溶液的浓度为0.1mol/L；

1.4、在步骤1.3所得的样品溶液中精密加入5～20ml含1～10％(v/v)甲酸的乙腈溶液，漩涡振荡提取5～20min，加入2～10g氯化钠和5～10g无水硫酸钠，旋涡1～5min，以4000～8000r/min的速度离心2～10min，吸取上清液Ⅰ5ml待净化；

1.5、在步骤1.4所得的待净化样液中加入净化剂，旋涡1～5min混匀，以4000～8000r/min的速度离心2～10min；

1.6、取步骤1.5所得的上清液Ⅱ1～5ml置于PRiME HLB固相萃取柱中，取滤液用0.20～0.45um过滤头过滤，得上清液Ⅲ；

2)、制备标准溶液

2.1、用有机溶剂分别将4种硝基呋喃类药物代谢产物标准物质溶解，配置成浓度均为1000ug/mL的4种硝基呋喃类药物代谢产物标准储备溶液；

2.2、各取上述标准储备溶液用有机溶剂配制成浓度为100mg/L的混合标准储备溶液；

2.3、分别取事先已知为阴性的粉碎后的空白样品，加入混合标准储备溶液后，按照步骤1)所述方法制备基质标准溶液，作为标准系列工作溶液；

3)、将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；

4)、取步骤1)所得的上清液Ⅲ按步骤3)方法测定上清液中各硝基呋喃类药物、峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。

2.根据权利要求1所述的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是：

所述4种硝基呋喃类药物代谢产物：呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物；

步骤3)的色谱条件为：

流速：0.3～0.8ml/min；柱温：20～50℃；进样量0.5～5μL；

流动相由流动相A和流动相B组成：流动相A为乙腈；流动相B为体积浓度为0.0005mol/L乙酸铵水溶液；

梯度洗脱程序为：0～3.5min，5％A；3.5～3.51min，5～25％A；3.51～5.80min，25％A；5.80～5.81min，25～5％A；5.81～8min，5％A；

上述％为体积％。

3.根据权利要求2所述的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是：

所述步骤3)的质谱条件为：电喷雾离子源，正离子检测方式；多反应检测；干燥气温度：200℃；干燥气流速：14L/min；喷雾器压力：200KPa；毛细管电压：3.5KV；校准方法：质量轴自动调谐校正；MRM进行分段扫描：0～4.8min，SEM和AHD；4.8～5.3min，AOZ；5.3～8min，AMOZ。

4.根据权利要求3所述的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是4种硝基呋喃类药物代谢产物质谱分析参数如下：

*为定量离子对。

5.根据权利要求1～4任一所述的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是：

所述步骤1.3中，2-硝基苯甲醛溶液的浓度为0.1mol/L，乙醇为溶剂；

所述步骤1.4中，净化剂由500～2000mg无水硫酸钠、100～500mgC18-N以及100～500mgNH₂-PSA组成。

6.根据权利要求1～4任一所述的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是：

所述步骤2)中，有机溶剂为色谱纯甲醇、乙腈。

7.根据权利要求1～4任一所述的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是：

步骤2.3为：分别取事先已知为阴性的空白样品6份，每份取2g，分别加入适量的混合标准储备溶液，按照步骤1)的方式制备基质标准溶液，使得最终6份样品溶液中四种硝基呋喃类药物代谢产物浓度分别浓度为2ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L，作为标准系列工作溶液。