CN109884199A

CN109884199A - 一种蜂蜜中黄酮类成分的含量测定方法

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Publication number: CN109884199A
Application number: CN201910108126.3A
Authority: CN
Inventors: 楚楚; 王珊; 江璐依; 唐谊平; 颜继忠
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-02-02
Filing date: 2019-02-02
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2039-02-02
Also published as: CN109884199B

Abstract

本发明为一种蜂蜜中黄酮类成分的含量测定方法，提供一种蜂蜜中黄酮类成分的提取分析方法，所述黄酮类成分为槲皮素、山奈酚、异鼠李素的一种或两种以上的混合，所述方法包括为：取蜂蜜样品与纯水混合后，用超声萃取仪萃取，得到的混合溶液经离心后，取上清液作为蜂蜜提取液；将蜂蜜提取液与含吸附剂的分散溶液涡旋混合后，经固相萃取仪弃去滤液，取下含吸附剂的有机滤膜，用洗脱溶剂洗脱，收集滤液，离心取上清液装入液相小瓶，用高效液相色谱仪对分析物进行检测分析。本发明是采用蟹壳粉作为吸附剂，结合分散微固相萃取技术和高效液相色谱技术，来富集并检测食品蜂蜜中黄酮类成分含量的新方法。相比于传统方法，本发明具有更高的灵敏度，且省时、简便、环保，提取过程中消耗极少的有机试剂，实验人员在操作验过程中更安全。

Description

一种蜂蜜中黄酮类成分的含量测定方法

技术领域

本发明属于天然药物含量测定技术领域，涉及一种蜂蜜中黄酮类成分的提取富集分析方法，具体地说，它涉及以蟹壳粉为吸附剂的分散微固相萃取技术，结合高效液相色谱技术，来检测食品蜂蜜中黄酮类成分含量的新方法。

背景技术

在蜂蜜样品中，黄酮类化合物是最重要的活性成分，其中包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素等。已有临床研究发现，这些黄酮类成分具有可能在预防和治疗人类疾病中发挥重要作用的生物学特性，具有抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒作用，同时对心血管疾病具有保护作用。蜂蜜中黄酮类化合物的种类和含量是重要的指标，反映了其内在的品质。然而，真实蜂蜜样品中黄酮类化合物的浓度极低，基质的干扰很复杂，这阻碍了蜂蜜中黄酮类化合物的直接分析。因此，有必要开发能够灵敏、准确并同时量化复杂基质样品中许多痕量黄酮类化合物的可靠分析方法。

但目前蜂蜜样品的前处理方法主要集中在超声提取、微波萃取、以及回流提取技术。然而，这些方法在应用过程中，提取时间长，对目标成分的提取率低，且会用到大量有毒有害的有机试剂，对环境污染严重，对操作人员也有毒害危险，不符合“绿色化学”的理念。因此，针对以上几种活性成分建立灵敏度高、操作快速简单以及绿色环保的含量测定方法对评估蜂蜜的质量有很重要的意义。

近年来，分散微固相萃取(DMSPE)作为一种有效的样品预处理方法，引起了广泛的关注。该方法是将萃取、浓缩和萃取物引入分析系统一步到位，将萃取剂分散到样品溶液中，使萃取剂与样品之间的接触面最大化，从而提高传质，提高萃取效率，用于分离和富集目标分析物。与传统的固相萃取方法相比，该方法使用固体吸附剂少，且使用的有机溶剂量少，对环境污染少，操作简单快速，提取效率高，已经被广泛地应用于天然产物分析检测领域。有研究表明，合适的吸附剂有助于实现最大的提取效率。目前，多种吸附剂已被应用于DMSPE，如微晶纤维素、壳聚糖包裹的多壁碳纳米管、壳聚糖等。然而，这些吸附剂的合成耗时长，且合成过程中需要消耗大量有机试剂。

蟹壳粉(CSP)是一种金属去除生物吸附剂，可从海产品螃蟹中大量获得。蟹壳粉的主要成分为几丁质及其脱乙酰形式(壳聚糖)。由于其非常好的机械稳定性和易于解吸的特性，使这种生物吸附剂能够重复使用5个循环。此外，日常生活中，大部分蟹壳被视作垃圾并被随意丢弃，造成了蟹壳资源的浪费及环境污染。因此，合理有效地利用蟹壳资源，符合绿色环保的理念。作为一种生物吸附剂，蟹壳粉不仅具有良好的吸附性能，而且绿色环保，制备成本低，适合用作DMSPE的吸附剂。

目前蟹壳粉作为吸附剂结合分散微固相萃取技术用于黄酮类成分的测定尚未见报道。本发明采用蟹壳粉作为吸附剂，可高效提取黄酮类成分。

综上，本发明建立了以蟹壳粉为吸附剂的分散微固相萃取技术结合高效液相色谱技术的方法，来提取和定量蜂蜜中三种黄酮类成分，以期为复杂样品中三种黄酮类成分的分析测定提供一种更加绿色、快速、灵敏度高的新方法。

发明内容

本发明目的在于建立一种比常规方法更高灵敏度、更绿色环保、更简单快速的黄酮类成分提取检测技术。

本发明具体提供了以一种蟹壳粉作为新型吸附剂的分散微固相萃取技术，结合高效液相色谱的方法，可用于富集及分析测定蜂蜜中黄酮类成分。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种蜂蜜中黄酮类成分的含量测定方法，所述黄酮类成分为槲皮素、山奈酚或异鼠李素的一种或两种以上的混合，所述方法包括以下步骤：

(1)制备蜂蜜提取液：将蜂蜜样品溶于纯水中得到浓度为0.1-1.0g/mL的蜂蜜水溶液，将所述的蜂蜜水溶液超声10-40min后，在4000-13000rpm条件下离心5-15min取上清液，上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，取滤液即为蜂蜜提取液；

(2)配制十二烷基硫酸钠-吸附剂分散液：将十二烷基硫酸钠与吸附剂混合，加入纯水至十二烷基硫酸钠终浓度为10-25mM，超声2-15min混合均匀，配制得到吸附剂浓度为0.05-0.40mg/mL的吸附剂分散液；所述吸附剂为蟹壳粉；所述的十二烷基硫酸钠与吸附剂的质量比为50:1；

(3)向步骤(1)所述蜂蜜提取液中加入步骤(2)所述的吸附剂分散液，加水稀释，配成吸附剂浓度为1-8μg/mL混合溶液，并用1M甲酸或1M氢氧化钠调节溶液pH至3-11，将混合溶液涡旋1～8min，过滤，所得固体用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，即为富集样液，4000-13000rpm离心5-20min后，取上清液用高效液相色谱进行采样分析，得到富集样液中黄酮类成分的提取色谱图；所述洗脱剂为乙腈、甲醇、乙醇或丙酮；

所述的高效液相色谱分析的条件为：色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)，进样量：10μL，柱温：35℃，流速1mL/min，流动相：体积比为55:45的甲醇和体积分数为0.4％的磷酸水的混合液，等度洗脱12min；

(4)将步骤(3)所得富集样液的各成分的色谱图中色谱峰的峰面积值分别代入槲皮素、山奈酚和异鼠李素的标准曲线，计算得到蜂蜜中槲皮素、山奈酚、异鼠李素的含量。

进一步，步骤(2)中，所述吸附剂优选为蟹壳粉。

再进一步，本发明所述蟹壳粉按以下方法制备：

蟹壳用纯净水洗涤后，置于60～70℃的烘箱中干燥至恒重；然后将干燥好的蟹壳粉碎成粉末并过100目筛，然后将过筛后的蟹壳粉末在100℃下，用质量分数为20％的氢氧化钠水溶液处理1小时，然后用纯净水洗涤后，置于60～70℃的烘箱中干燥12小时，将干燥后的蟹壳粉末再次粉碎并过200目筛，即得作为吸附剂的蟹壳粉末。

进一步，所述的槲皮素、山奈酚和异鼠李素的标准曲线按照如下方法进行制备：

a、以甲醇为溶剂，以槲皮素为对照品配制浓度范围为0.27-10⁴ng/mL的槲皮素对照品溶液，按照步骤(3)中所述富集样液的同样条件用高效液相色谱进行检测，获得槲皮素对照品的色谱图，以所述的槲皮素对照品溶液的色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，以槲皮素对照品的浓度为横坐标，制作槲皮素对照品标准曲线；

b、将步骤a的对照品槲皮素分别换成山奈酚和异鼠李素，按步骤a所述的方法分别制作山奈酚对照品标准曲线以及异鼠李素对照品标准曲线。

进一步，步骤(3)中，所述吸附剂浓度优选为：1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL或8μg/mL，最优选为2μg/mL。

进一步，步骤(3)中，所述涡旋时间为：1min，2min，4min，6min，8min，优选为2min。

进一步，步骤(3)中，所述pH为：3、5、7、9或11，优选为7。

进一步，步骤(3)中，所述洗脱剂优选为甲醇。

进一步，步骤(3)中，所述洗脱剂体积为：80μL、100μL、150μL或200μL，优选为100μL。

本发明的有益效果是：本发明采用分散微固相萃取技术提取富集蜂蜜提取液中黄酮类成分，具有高灵敏度、操作快速简便，有机溶剂消耗量少等优点。本发明首次将蟹壳粉与其他传统吸附剂进行对比，结果发现自制的蟹壳粉对黄酮类成分的富集效果最为显著，具有吸附性能好，安全无毒，绿色环保，可循环利用等特点，提高了分析方法的可靠性和选择性。最后，本发明以高效液相色谱作为检测器，具有快速、稳定、准确的特点。

附图说明

图1为本发明分散微固相萃取方法的工艺流程图。

图2为样品的表征。(a)蟹壳粉的扫描电镜图像；(b)含蟹壳粉的分散液的扫描电镜图像；(c)涡旋溶液的扫描电镜图像；(d)洗脱滤液的扫描电镜图像；

图3为考察分散微固相萃取效果的柱状图和折线图。图中，1、2、3分别代表槲皮素、山奈酚、异鼠李素。(a)吸附剂种类；(b)蟹壳粉浓度，单位μg/mL；(c)涡旋时间，单位min；(d)pH值；(e)洗脱剂种类；(f)洗脱剂体积，单位μL。

具体实施方式

通过以下实例来对本发明所提供的提取检测方法进行更为详细的描述。由于其应用范围广，故具体实施方案也多，下面将结合几个实例的讨论对本发明的内容作进一步的阐述。

本发明实施例所用弗罗里硅土，优选购自上海麦克林生化科技有限公司。

本发明实施例所用硅胶，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。

本发明实施例所用Al₂O₃，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。

本发明实施例所用C₁₈，优选购自上海正亚化工有限公司。

温郁金对照品混合液的制备方法具体步骤为：分别精密称取适量槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品，用甲醇混合溶解定容至1mL容量瓶中，制成上述各种对照品终浓度分别为1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL的对照品混合液。

实施例1

蟹壳用纯净水多次洗涤后，置于60～70℃的烘箱中干燥至恒重。然后，将其粉碎成粉末并过100目筛。为除去对于蛋白质，将上述过筛后的蟹壳粉末在100℃下，用20(wt)氢氧化钠碱处理1小时。再次用纯净水洗涤后，置于60～70℃的烘箱中干燥12小时。将干燥后的蟹壳粉末再次粉碎并过200目筛，即得作为吸附剂的蟹壳粉末。

实施例2

准确称取不同种类吸附剂(蟹壳粉，弗罗里硅土，Al₂O₃，硅胶，C₁₈)各1mg于5组平行的50mL规格的具塞锥形瓶中，分别加入0.0505g十二烷基硫酸钠，分别加水至10mL，超声5min混合均匀，即制得五种吸附剂分散液。平行取5份1mg/mL对照品混合液10μL分别加入到5组50mL规格的离心管中，分别加入配制得到的五种吸附剂分散液200μL，分别加水至10mL，用1M甲酸或者1M氢氧化钠调节混合溶液pH值为7。将5组离心管置于涡旋振荡器上，涡旋2min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下。用100μL甲醇洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。实施例所用仪器为Agilent 1260 HPLC。

HPLC 1260色谱条件：

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)，进样量：10μL，柱温：35℃，流速1mL/min，流动相：甲醇：0.4v％磷酸水(55:45,V/V)，等度洗脱12min。

后续实施例中的色谱条件和实施例2相同。

图3a显示了不同吸附剂种类下的萃取效果柱状图。图中1、2、3分别代表不同黄酮类成分，分别为槲皮素、山奈酚、异鼠李素。

吸附剂的不同结构和吸附性能会对化合物有不同的提取效率，结果显示，相比于其他四种吸附剂，蟹壳粉对三种目标倍半萜类成分的提取回收率均最高。其原因可能是蟹壳粉表面具有丰富的能与羟基结合的位点，能更好的吸附黄酮类成分。另一种可能是目标化合物的芳香部分和蟹壳粉的C-H键之间的CH/π相互作用使得蟹壳粉能更好的吸附在蟹壳粉表面。

实施例3

取0.0505g十二烷基硫酸钠和1mg蟹壳粉加入到50mL规格具塞锥形瓶中，加水至10mL，超声5min混合均匀，即制得蟹壳粉分散液。平行取5份1mg/mL对照品混合液10μL分别加入到5组50mL规格的离心管中，分别加入配制得到的蟹壳粉分散液100μL、200μL、400μL、600μL、800μL，分别加水至10mL，即5组混合溶液中蟹壳粉的浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL，然后用1M甲酸或者1M氢氧化钠调节混合溶液pH值为7。将5组离心管置于涡旋振荡器上，涡旋2min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下。用100μL甲醇洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。

图3b显示了蟹壳粉不同浓度下的萃取效果柱状图。图中1、2、3分别代表不同黄酮类成分，分别为槲皮素、山奈酚、异鼠李素。

结果显示，随着蟹壳粉的浓度增加至2μg/mL，三个目标成分的提取回收率均增加，这可能是随着蟹壳粉的增加，吸附位点增加，溶液中的黄酮类化合物能更多地与吸附剂吸附，从而实现完全吸附。然而，当蟹壳粉浓度从2μg/mL增加至8μg/mL，提取回收率显著降低，这可能是由于蟹壳粉浓度增加使得目标化合物与蟹壳粉之间的吸附能力过强，导致后续洗脱过程困难。所以，最优的蟹壳粉的浓度选为2μg/mL。

实施例4

取0.0505g十二烷基硫酸钠和1mg蟹壳粉加入到50mL规格具塞锥形瓶中，加水至10mL，超声5min混合均匀，即制得蟹壳粉分散液。平行取5份1mg/mL对照品混合液10μL分别加入到5组50mL规格的离心管中，分别加入配制得到的蟹壳粉分散液200μL，分别加水至10mL，用1M甲酸或者1M氢氧化钠调节混合溶液pH值为7。将5组离心管置于涡旋振荡器上，分别涡旋1min、2min、4min、6min、8min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下。用100μL甲醇洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。

图3c显示了不同涡旋时间下的萃取效果柱状图。图中1、2、3分别代表不同黄酮类成分，分别为槲皮素、山奈酚、异鼠李素。

结果显示，当涡旋时间为2min时，所有分析物的提取回收率达到最高，其原因是分散的蟹壳粉和目标化合物在该涡旋时长内能够充分接触，使得两者之间的吸附快速达到平衡。然而，随着涡旋时间的继续增加，所有分析物的提取回收率均慢慢降低。该结果可能归因于目标化合物和蟹壳粉之间的结合作用太强，导致洗脱过程不顺利。综合考虑，选择2min作为最佳涡旋时间。

实施例5

取0.0505g十二烷基硫酸钠和1mg蟹壳粉加入到50mL规格具塞锥形瓶中，加水至10mL，超声5min混合均匀，即制得蟹壳粉分散液。平行取5份1mg/mL对照品混合液10μL分别加入到5组50mL规格的离心管中，分别加入配制得到的蟹壳粉分散液200μL，分别加水至10mL，用1M甲酸或者1M氢氧化钠分别调节混合溶液pH值为3、5、7、9、11。将5组离心管置于涡旋振荡器上，涡旋2min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下。用100μL甲醇洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。

图3d显示了不同pH值下的萃取效果折线图。图中1、2、3分别代表不同黄酮类成分，分别为槲皮素、山奈酚、异鼠李素。

结果显示，当涡旋溶液的pH值从3升至7时，三个目标分析物的提取回收率逐渐提高，该现象可能的原因是随着溶质离子化程度的增加，黄酮类化合物与蟹壳粉之间的静电相互作用增加。然而，随着涡旋溶液的pH值从7继续升至11，提取率则降低，这可能是随着pH值的增加，蟹壳粉变为带负电，由于静电排斥，静电相互作用减弱。

实施例6

取0.0505g十二烷基硫酸钠和1mg蟹壳粉加入到50mL规格具塞锥形瓶中，加水至10mL，超声5min混合均匀，即制得蟹壳粉分散液。平行取4份1mg/mL对照品混合液10μL分别加入到4组50mL规格的离心管中，分别加入配制得到的蟹壳粉分散液200μL，分别加水至10mL，用1M甲酸或者1M氢氧化钠调节混合溶液pH值为7。将4组离心管置于涡旋振荡器上，涡旋2min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下。分别用100μL洗脱剂(乙腈、甲醇、乙醇、丙酮)洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。

图3e显示了不同洗脱剂种类的萃取效果折线图。图中1、2、3分别代表不同黄酮类成分，分别为槲皮素、山奈酚、异鼠李素。

结果显示，相对于乙腈、乙醇和丙酮三种洗脱剂，甲醇对三个目标化合物的洗脱效果最好。

实施例7

取0.0505g十二烷基硫酸钠和1mg蟹壳粉加入到50mL规格具塞锥形瓶中，加水至10mL，超声5min混合均匀，即制得蟹壳粉分散液。平行取4份1mg/mL对照品混合液10μL分别加入到4组50mL规格的离心管中，分别加入配制得到的蟹壳粉分散液200μL，分别加水至10mL，用1M甲酸或者1M氢氧化钠调节混合溶液pH值为7。将4组离心管置于涡旋振荡器上，涡旋2min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下。分别用80μL、100μL、150μL、200μL甲醇洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。

图3f显示了不同洗脱剂浓度下的萃取效果折线图。图中1、2、3分别代表不同黄酮类成分，分别为槲皮素、山奈酚、异鼠李素。

使用的洗脱剂体积也影响分析物的提取回收率，结果显示，随着洗脱剂体积从80μL增加至100μL时，目标分析物的提取回收率提高。然而当体积继续增加至200μL时，提取回收率逐渐减少，这可能因为过多的洗脱剂体积产生了稀释作用，洗脱得到的目标分析物浓度降低，因此，最优洗脱剂体积为100μL。

实施例8

1、蜂蜜样品提取步骤：精密称取5g蜂蜜样品于50mL规格离心管中，加10mL纯水溶解，将离心管置于超声仪中超声提取30min后，13000rpm离心10min取上清液，上清液过0.22μm滤膜过滤，取滤液即为蜂蜜提取液。最佳分散微固相萃取步骤：取0.0505g十二烷基硫酸钠和1mg蟹壳粉加入到50mL规格具塞锥形瓶中，加水至10mL，超声5min混合均匀，即制得蟹壳粉分散液。取蜂蜜提取液100μL和配制得到的蟹壳粉分散液200μL于50mL规格的离心管中，加水至10mL，用1M甲酸或者1M氢氧化钠调节混合溶液pH值为7。将离心管置于涡旋振荡器上，涡旋2min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下。用100μL甲醇洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。对购自杭州泰通食品有限公司的蜂蜜进行提取和定量分析，结果显示，该批次蜂蜜中，槲皮素含量为0.28μg/g，山奈酚含量为7.3μg/g，异鼠李素由于样品中含量太少未检测到。

2、标准曲线的制定：

分别精密称取槲皮素对照品1mg、山奈酚对照品1mg、和异鼠李素对照品1mg，用甲醇溶解并定容至1mL，配制成上述各种对照品终浓度分别为1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL的对照品混合液。加甲醇分别稀释配制得到100μg/mL、50μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.0007μg/mL、0.00027μg/mL、0.00025μg/mL、0.00009μg/mL、0.00008μg/mL浓度的对照品混合溶液，分别吸取10μL的对照品混合溶液注入液相色谱仪进行分析，测得峰面积。以分析物的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

槲皮素、山奈酚、异鼠李素的标准曲线、线性相关系数、线性范围和检测限如下表1。

表1各成分标准曲线方程、线性相关系数、线性范围和检测限

3、精密度考察

在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液同一天内重复进样6次，为日内精密度。在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液，连续3天每天进样3次，为日间精密度。结果见表2。

表2重复性、精密度、稳定性实验结果

4、称取5g蜂蜜样品于50mL规格离心管中，加10mL纯水(含0.070μg/mL槲皮素、1.825μg/mL山奈酚、0.500μg/mL异鼠李素)溶解，将离心管置于超声仪中超声提取30min后，13000rpm离心10min取上清液，上清液过0.22μm滤膜过滤，取滤液即为加标蜂蜜提取液。将得到的加标蜂蜜提取液按实施例8中最优分散微固相萃取步骤进行萃取后，用HPLC分析结果。

称取5g蜂蜜样品于50mL规格离心管中，加10mL纯水(含0.14μg/mL槲皮素、3.65μg/mL山奈酚、1.00μg/mL异鼠李素)溶解，将离心管置于超声仪中超声提取30min后，13000rpm离心10min取上清液，上清液过0.22μm滤膜过滤，取滤液即为加标蜂蜜提取液。将得到的加标蜂蜜提取液按实施例8中最优分散微固相萃取步骤进行萃取后，用HPLC分析结果。

称取5g蜂蜜样品于50mL规格离心管中，加10mL纯水(含0.28μg/mL槲皮素、7.30μg/mL山奈酚、2.00μg/mL异鼠李素)溶解，将离心管置于超声仪中超声提取30min后，13000rpm离心10min取上清液，上清液过0.22μm滤膜过滤，取滤液即为加标蜂蜜提取液。将得到的加标蜂蜜提取液按实施例8中最优分散微固相萃取步骤进行萃取后，用HPLC分析结果。

在最佳检测条件下(实施例1所示)，对空白蜂蜜提取液及加标蜂蜜提取液进样分析，根据其峰面积和标准曲线方程，计算得到槲皮素、山奈酚、异鼠李素的加标回收率及其相对标准偏差，结果见表3。

加样回收率实验结果如下表3：

表3加样回收率实验

表中数据显示，本发明方法回收率高。

实施例9蟹壳粉吸附其他类天然成分试验

他类天然成分对照品溶液的制备方法为：分别精密称取适量桂皮醛、毛蕊花糖苷、酸枣仁苷A、斯皮诺素、大黄素对照品，用甲醇混合溶解定容至1mL容量瓶中，制成上述各种对照品浓度为1mg/mL的对照品溶液。取实施例7中制得得蟹壳粉分散液，分别取上述其他类成分对照品混合溶液10μL加入到50mL规格的离心管中，加入配制得到的蟹壳粉分散液200μL，加水至10mL，用1M甲酸或者1M氢氧化钠调节混合溶液pH值为7。将离心管置于涡旋振荡器上，涡旋2min，用10mL一次性注射器吸取离心管中的溶液。移除针头，装上0.22μm孔径的有机过滤头，将注射器置于固相萃取仪上进行抽滤，直至无水滴为止，将含有吸附剂的过滤头取下，用100μL甲醇洗脱过滤头，洗脱液收集于1.5mL规格离心管内，13000rpm离心5min，取上清液装入液相小瓶，用HPLC分析结果。

桂皮醛色谱条件：

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)，进样量：10μL，检测波长：285nm，柱温：25℃，流速：1mL/min，流动相：A：甲醇，B：0.1v％磷酸水。梯度洗脱：0～5min，90％～72v％流动相B；5～15min，72％～68v％流动相B；15～20min，68％～50v％流动相B；20～25min，50％～0v％流动相B。

毛蕊花糖苷色谱条件：

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)，进样量：10μL，检测波长：330nm，柱温：35℃，流速：1mL/min，流动相：A：乙腈，B：0.1v％磷酸水。梯度洗脱：0～10min，95％～85v％流动相B；10～30min，85％～70v％流动相B。

酸枣仁苷A色谱条件：

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)，进样量：10μL，检测波长：203nm，柱温：30℃，流速：1mL/min，流动相：乙腈：水(40:60,V/V)

斯皮诺素色谱条件：

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)，进样量：10μL，检测波长：335nm，柱温：30℃，流速：1mL/min，流动相：乙腈：水(40:60,V/V)

大黄素色谱条件：

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)，进样量：10μL，检测波长：410nm，柱温：25℃，流速：1mL/min，流动相：A:95％乙腈5％水(0.1％甲酸)、B:95％水5％乙腈(0.1％甲酸)，梯度洗脱：0～30min，0％～100v％流动相A。

结果如下表4所示：

表4蟹壳粉吸附其他类天然成分实验

天然成分	保留时间	富集前峰面积	富集后峰面积
				桂皮醛	23.733min	187.094	142.138
毛蕊花糖苷	21.212min	98.556	102.10
				酸枣仁苷	19.921min	25.736	26.169
斯皮诺素	13.075min	69.285	64.734
				大黄素	20.711min	88.254	89.548

表中数据显示，本发明中的蟹壳粉吸附剂并不是对所有天然成分有吸附富集效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蜂蜜中黄酮类成分的含量测定方法，所述黄酮类成分为槲皮素、山奈酚或异鼠李素的一种或两种以上的混合，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)制备蜂蜜提取液：将蜂蜜样品溶于纯水中得到浓度为0.1-1.0g/mL的蜂蜜水溶液，将所述的蜂蜜水溶液超声10-40min后，然后在4000-13000rpm条件下离心5-15min取上清液，然后将所述的上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，取滤液即为蜂蜜提取液；

(2)配制十二烷基硫酸钠-吸附剂分散液：将十二烷基硫酸钠与吸附剂混合，加入纯水至十二烷基硫酸钠终浓度为10-25mM，超声2-15min混合均匀，配制得到吸附剂浓度为0.05-0.40mg/mL的吸附剂分散液；所述吸附剂为蟹壳粉；所述的十二烷基硫酸钠与吸附剂的质量比为50：1；

(3)向步骤(1)所述蜂蜜提取液中加入步骤(2)所述的吸附剂分散液，加水稀释，配成吸附剂浓度为1-8μg/mL混合溶液，并调节溶液pH至3-11，然后将所述的混合溶液涡旋1～8min，过滤，所得固体用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，即为富集样液，4000-13000rpm离心5-20min后，取上清液用高效液相色谱进行采样分析，得到富集样液中黄酮类成分的提取色谱图；所述洗脱剂为乙腈、甲醇、乙醇或丙酮；

2.如权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)中，所述吸附剂为蟹壳粉。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于：所述蟹壳粉按以下方法制备：

4.如权利要求1所述方法，其特征在于：所述的槲皮素、山奈酚和异鼠李素的标准曲线按照如下方法进行制备：

5.如权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)中，所述吸附剂浓度为：1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL或8μg/mL。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于：所述的pH通过1M甲酸或1M氢氧化钠进行调节。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)中，所述涡旋时间为：1min、2min、4min、6min或8min。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)中，所述pH为：3、5、7、9或11。

9.如权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)中，所述洗脱剂为甲醇。

10.如权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)中，所述洗脱剂体积为80μL、100μL、150μL或200μL。