CN104090036B - 一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法 - Google Patents
一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104090036B CN104090036B CN201410263538.1A CN201410263538A CN104090036B CN 104090036 B CN104090036 B CN 104090036B CN 201410263538 A CN201410263538 A CN 201410263538A CN 104090036 B CN104090036 B CN 104090036B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enrichment
- aloe
- emodin
- ions
- sample liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 239000000470 constituent Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 title claims abstract description 28
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 60
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 54
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 34
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 171
- YDQWDHRMZQUTBA-UHFFFAOYSA-N Aloe emodin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC(CO)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O YDQWDHRMZQUTBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 164
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 141
- LQGUBLBATBMXHT-UHFFFAOYSA-N chrysophanol Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O LQGUBLBATBMXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 86
- FFWOKTFYGVYKIR-UHFFFAOYSA-N physcion Chemical compound C1=C(C)C=C2C(=O)C3=CC(OC)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O FFWOKTFYGVYKIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 86
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 76
- UGNZSMZSJYOGNX-UHFFFAOYSA-N Isoviocristine Natural products O=C1C=C(C)C(=O)C2=CC3=CC(OC)=CC(O)=C3C(O)=C21 UGNZSMZSJYOGNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- WLXGUTUUWXVZNM-UHFFFAOYSA-N anthraglycoside A Natural products C1=C(C)C=C2C(=O)C3=CC(OC)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O WLXGUTUUWXVZNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- NZPQWZZXRKZCDU-UHFFFAOYSA-N chrysophanol Natural products Cc1cc(O)c2C(=O)c3c(O)cccc3Oc2c1 NZPQWZZXRKZCDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- PKUBGLYEOAJPEG-UHFFFAOYSA-N physcion Natural products C1=C(C)C=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O PKUBGLYEOAJPEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 42
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 40
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 27
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 abstract description 22
- 241000219061 Rheum Species 0.000 abstract description 21
- 235000009411 Rheum rhabarbarum Nutrition 0.000 abstract description 21
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 240000004980 Rheum officinale Species 0.000 description 28
- 235000008081 Rheum officinale Nutrition 0.000 description 28
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 18
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 14
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 12
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 12
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 12
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000283925 Spermophilus Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012676 herbal extract Substances 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001334 liquid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 241000205407 Polygonum Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 235000008090 Rheum palmatum Nutrition 0.000 description 1
- 240000001745 Rheum palmatum Species 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- FFSAXUULYPJSKH-UHFFFAOYSA-N butyrophenone Chemical class CCCC(=O)C1=CC=CC=C1 FFSAXUULYPJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012621 metal-organic framework Substances 0.000 description 1
- 238000001690 micro-dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical class C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法，该方法以四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)作为吸附剂，对低浓度的待检测样液进行萃取吸附，然后用解吸剂洗脱，洗脱液干燥后所得固体用溶解剂溶解，得到富集样液，富集样液用液质联用仪检测，通过标准曲线和富集倍数定量，检测得到低浓度的待检测样液中蒽醌类有效成分的浓度。本发明方法可用于检测大黄药材稀释液以及生物样本(大鼠尿样)中的低浓度蒽醌类有效成分。
Description
技术领域
本发明属于天然药物提取及检测领域。它涉及一种中药及其生物样本的提取及检测方法，具体地说，它涉及由四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)作为吸附剂，用来提取低浓度中药大黄及其生物样本(鼠尿)样品中蒽醌类有效成分并检测其含量的新方法。
背景技术
在天然产物生物样本的检测中，样品预处理在整个实验流程中至关重要。通过样品的预处理，目标分子从复杂的生物基质中得以提取，可以排除生物基质对分析结果的干扰。更为重要的是，在样品预处理的富集环节，可通过一系列技术手段将目标分子浓缩，提高了实验的灵敏度，从而实现降低检测限这一目的。
目前，中药生物样本的分析方法层出不穷。在其提取富集环节，主要以液-液萃取和固相萃取为代表，此外还包括蛋白沉淀、微透析等。而固相萃取(Solid-PhaseExtraction，简称SPE)，作为近年发展起来一种样品预处理技术，与传统的液-液萃取法相比，分析物的回收率更高，分析物与干扰组分的分离更有效，操作简单、省时、省力。广泛地应用在医药、食品、环境、商检、化工等领域。当然，柱形固相萃取也有其局限性：截面积小、流量低、易堵塞、易产生缝隙降低提取效率、重复性差等。
鉴于上述局限，诸多建立在液-液萃取和固相萃取基础上的新型提取富集方法，也如雨后春笋般应运而生。包括分散液相微萃取、单滴液相微萃取、中空纤维液相微萃取、基质分散固相萃取、分子印迹固相萃取、磁性固相萃取等。相比传统的液-液萃取和固相萃取，这类新型富集方法具有的优势也更为明显，例如使用有机溶剂量少、富集倍数明显、富集时间短等。其中具有代表性的就有磁性固相萃取(MSPE)。
所谓磁性固相萃取(MSPE)是近年来国内外研究的一个热点领域。与常规的固相萃取(SPE)柱填料相比，MSPE是一种以磁性或可磁化的材料作吸附剂基质的一种固相萃取技术，在MSPE过程中，磁性吸附剂不直接填充到吸附柱中，而是被添加到样品的溶液或悬浮液中，将目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面，在外部磁场作用下，只需使用少量的吸附剂和较短的平衡时间就能实现萃取分离。
磁性固相萃取的核心因素是磁性吸附剂。吸附剂种类的选择将直接影响实验效果。近年来的磁性纳米材料也是日新月异。目前选作磁性固相萃取的吸附剂通常包括：磁性碳材料、磁性分子印迹材料、金属-有机框架材料等。四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)这种纳米材料更是受到诸多专家学者的青睐。该材料同时具备了氧化石墨烯和四氧化三铁的优异特性：既具备了氧化石墨烯的多孔、比表面积大等优越的吸附特性，又具备了四氧化三铁的磁性。这就使得该材料在诸多领域都有广泛的应用。
大黄(RadixetrhizomaRhei)为蓼科植物掌叶大黄(RheumPalmatumL)，唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim.exBalf)或药用大黄(RheumofficinaleBaill)的干燥根和根茎。大黄在中药复方中应用相当广泛，有“泻热通畅、凉血解毒、攻积导滞、利胆退黄、逐瘀通经”之功效，《神农本草经》称大黄“主下瘀血、血闭、寒热、破症瘕积聚、留饮、宿食、荡涤肠胃、通利水谷、调中化食、安和五藏”。随着人们对大黄的研究日益加深，各类活性成分相继被发现。大黄中的有效成分有蒽醌类、芪类、苯丁酮类、有机酸、甾醇、鞣质类、色原酮类等多种成分，起主要疗效的是大黄中含有的蒽醌类成分。具有代表性的蒽醌类成分主要有芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。在诸多学者对大黄开展的研究中，以磁性固相萃取作为预处理，并且结合超高效快液相-四级杆飞行时间液质联用仪(UHPLC-Q-TOF/MS)作为其检测手段的案例尚未见报道。
截止目前，以四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)作为吸附剂在中药及其生物体液的磁性固相萃取方面应用偏少。该方法在中药或其生物样本的提取、富集环节尚未见报道，对于中药大黄这一研究领域更是一片空白。
发明内容
本发明的目的在于寻求一种比以往更加快速灵敏的提取检测技术，使其应用于大黄药材稀释液及其生物样品的提取检测。发明要点在于将磁性纳米材料制备成为纳米分散液，并应用在磁性固相萃取领域，巧妙地结合了磁性富集技术和固相萃取技术。磁性纳米材料分散液作为吸附剂与大黄药材或其生物体液中的目标分子吸附结合，使得目标分子快速提取、富集。最终可以达到360-924倍的富集效果。
本发明具体提供了一种以四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)作为吸附剂，通过萃取吸附等步骤，富集复杂体系中目标分子的方法。可用于提取检测低浓度的大黄药材提取液或生物样本(大鼠尿样)中的蒽醌类有效成分。
本发明采用的技术方案是：
一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法，所述蒽醌类有效成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚中的一种或两种以上，所述方法包括以下步骤：(1)反应容器中加入含有低浓度蒽醌类有效成分的待检测样品溶液，并加入四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)配成混合液，使混合液中四氧化三铁磁性石墨烯的浓度为0.0125mg/mL-0.4000mg/mL，混合液的pH值为4-8，震荡富集1～10min后，静置，将磁铁置于反应容器底部吸附固体，弃去液体，残留固体烘干后用解吸剂进行洗脱，所述解吸剂为甲醇、含体积分数1％乙酸的乙醇、含体积分数1％乙酸的乙腈、含体积分数1％乙酸的乙酸乙酯或含体积分数1～4％乙酸的甲醇，收集洗脱液、洗脱液干燥、所得固体用溶解剂溶解，得到富集样液，所述溶解剂为甲醇，富集样液离心，取上清液用液质联用仪(UHPLC-Q-TOF/MS)检测，得到富集样液中蒽醌类有效成分的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图；
(2)以芦荟大黄素的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照富集样液同样条件用液质联用仪检测，获得芦荟大黄素对照品的提取离子色谱图，以芦荟大黄素对照品溶液的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积为横坐标，以芦荟大黄素对照品的进样量为纵坐标制作芦荟大黄素标准曲线，按同样方法制作大黄酸标准曲线、大黄素标准曲线、大黄酚标准曲线、大黄素甲醚标准曲线；根据富集样液的各成分的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到富集样液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，
(3)计算富集倍数：
取芦荟大黄素对照品，配制成浓度为0.25μg/mL的芦荟大黄素稀释液，按照步骤(1)的相同的方法条件，加入四氧化三铁磁性石墨烯进行富集检测，得到芦荟大黄素稀释液富集后的样液的提取离子色谱图，并将芦荟大黄素稀释液以相同条件用液质联用仪检测，得到芦荟大黄素稀释液的提取离子色谱图，芦荟大黄素稀释液富集后的样液的提取离子色谱图中芦荟大黄素色谱峰的峰面积与芦荟大黄素稀释液的提取离子色谱图中芦荟大黄素色谱峰的峰面积之比，即为芦荟大黄素的富集倍数；
按照上述方法分别计算大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的富集倍数；
(4)根据芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚各自的富集倍数，富集样液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量除以各自的富集倍数，换算得到待检测样品溶液中蒽醌类有效成分的含量。
本发明所述四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)可于市场上直接购买获得，本发明实施例中所用的四氧化三铁磁性石墨烯购于NanoInnovaTechnologies公司。
所述低浓度蒽醌类有效成分是指待检测样品溶液中的蒽醌类有效成分中至少有一种成分的浓度在0.25μg/mL以下，用常规液质联用仪直接进样难以检测得到。具体的，所述低浓度蒽醌类有效成分是指芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚中至少一种成分的浓度在0.25μg/mL以下时，常规液质联用仪直接进样就难以检测定量了。本发明方法的检测下限一般为0.5pg/mL。
所述步骤(1)中，所述混合液中四氧化三铁磁性石墨烯的浓度为0.0125mg/mL-0.4000mg/mL，优选0.0250～0.0500mg/mL，最优选0.0500mg/mL。
所述混合液中调pH值为4-8，优选为5～6，最优选pH值为6。一般可用磷酸或氢氧化钠调节pH值。
所述震荡富集的时间为1-10min，优选为5～10min，最优选5min。
所述解吸剂优选为甲醇、含体积分数1％乙酸的乙醇、含体积分数1％乙酸的乙腈、含体积分数1％乙酸的乙酸乙酯或含体积分数1～4％乙酸的甲醇，最优选含体积分数1％乙酸的甲醇。
所述解吸剂的体积用量优选与待检测样品溶液的体积比为1：100～1000，最优选1：400。
所述解吸剂洗脱的次数优选1-5次，更优选洗脱3次。洗脱时可用超声、涡旋等方法促进洗脱完全，优选第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
所述溶解剂的体积用量优选与待检测样品溶液的体积比为1：1000～8000，更优选为1：4000。
所述将磁铁置于反应容器底部吸附固体，一般将磁铁置于反应容器底部吸附5～10min，保证吸附完全。
所述残留固体烘干一般可于70℃烘干。
所述洗脱液干燥一般于80℃干燥。
所述所得固体用溶解剂溶解，溶解时可用超声方式辅助加快固体溶解。
所述富集样液的离心优选在13000rpmin离心5min。
进一步，本发明方法的步骤(1)优选按以下步骤操作：
反应容器中加入含有蒽醌类有效成分的待检测样品溶液，并加入四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)配成混合液，使混合液中四氧化三铁磁性石墨烯的浓度为0.05000mg/mL，混合液的pH值为6，震荡富集5min后，静置，将磁铁置于反应容器底部吸附固体，弃去液体，残留固体烘干后用解吸剂进行洗脱，所述解吸剂为含体积分数1％乙酸的甲醇，洗脱3次，收集洗脱液、洗脱液干燥、所得固体用溶解剂溶解，得到富集样液，所述溶解剂为甲醇，富集样液离心，取上清液用液质联用仪(UHPLC-Q-TOF/MS)检测，得到富集样液中蒽醌类有效成分的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图；所述解吸剂的体积用量与待检测样品溶液的体积比为1：400；所述溶解剂的体积用量与待检测样品溶液的体积比为1：4000；
所述的富集效果，通过超高效快速液相-四级杆飞行时间液质联用仪(UHPLC-Q-TOF/MS)测定大黄药材或其生物样本中有效成分的含量来表征该富集方法的有效性。
本发明方法可检测低浓度的大黄药材提取液或生物样本(如大鼠尿样)中的蒽醌类有效成分，检测限可达芦荟大黄素0.2573pg/ml，大黄酸0.2315pg/ml，大黄素0.0028pg/ml，大黄酚0.5230pg/ml，大黄素甲醚0.5899pg/ml，对低浓度样品具有很好的富集效果。
本发明的优点在于：
1.本发明方法将氧化石墨烯磁性材料用于磁性固相萃取，并且首次应用于大黄药材及其生物样本(鼠尿样品)的检测，具有独创性。目前大黄药材的生物体液检测手段，大多以常规的液相为主，以超高效快速液相-四级杆飞行时间液质联用仪(UHPLC-Q-TOF/MS)作为检测器的案例较为少见，本发明采取超高效快速液相-四级杆飞行时间液质联用仪(UHPLC-Q-TOF/MS)作为检测器，不仅具备了超高效液相的快速、稳定、重现性良好的特点，更是具备了质谱灵敏度高、精确的分子量可用来定性、二级碎片再次可用来定性目标分子的特点，这就大大提高了本发明的灵敏度。本发明的富集倍数可达360-924倍。
2.本方法在富集环节充分结合了纳米材料的吸附特性以及磁性材料的磁性，使得在外加磁场下，吸附剂能迅速汇聚，同时保证了吸附程度，达到吸附效果高、时间短的特点。
3.本方法应用范围广泛，不论是大黄药材稀释液还是富含生物基质的大黄鼠尿样本，均可采用本方法进行检测，且本发明所述的测定大黄药材和鼠尿样本这两个方面的研究属首例。
4.本发明所涉及的试剂，以及四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)，均具备一系列优异突出的的物理化学性质：化学稳定性和热稳定性良好，对人体无毒、不污染环境，不易燃。且本发明中起至关重要的因素——四氧化三铁磁性石墨烯(rGOFe3O4)，可反复进行试验使用，节约了实验成本，提高了经济效益。
5.本发明提供的实验富集倍数高，耗时短，且操作环境安全，操作步骤简洁明了，操作人员无需额外培训即可进行试验操作。
即本发明提供了一种新的提取检测方法，该方法利用磁性固相萃取技术，能便捷高效地测定大黄药材及其生物样本(鼠尿)中的低浓度蒽醌类有效成分。
附图说明
图1为本发明检测方法的工艺流程图。
图2为考察不同吸附剂浓度下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
图3为考察不同富集时间下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
图4为考察不同稀释液pH下的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
图5为考察不同种类解吸剂下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。A、B、C、D、E代表不同的解吸剂，分别为：A：含1％乙酸的乙醇；B：含1％乙酸的乙腈；C：含1％乙酸的乙酸乙酯；D：含1％乙酸的甲醇；E：含1％乙酸的正己烷。
图6为考察不同体积溶解液的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
图7为考察解吸剂中不同乙酸含量的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
图8为考察不同洗脱次数的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
图9为大黄对照品的液相色谱-质谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。A为总离子色谱图，B、C、D为提取离子色谱图。
图10为大黄药材富集样液的液相色谱-质谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。A为总离子色谱图，B、C、D为提取离子色谱图。
图11为大黄鼠尿富集样液的液相色谱-质谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。A为总离子色谱图，B、C、D为提取离子色谱图。
具体实施方式
通过以下实例来对本发明所提供的检测方法进行更为详细的描述。由于其应用范围广，故具体实施方案也多，下面将结合几个实例的讨论对本发明的内容作进一步的阐述。
大黄对照品溶液的制备方法参照药典2010版，具体步骤为：分别取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品适量，精密称定，将固体混合至同一个棕色量瓶中，加甲醇制成每lmL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚均为50μg的溶液，即得。
实施例1
1配制200mL芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为0.25μg/mL的对照品稀释液，pH＝6，并加入不同量的rGOFe3O4纳米颗粒，得到不同吸附剂浓度的混合液，具体配制方法为：取6个干净200mL具塞锥形瓶，编号1、2、3、4、5、6，均加入50μg/mL对照品混合液1mL，1号加入2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液40mL和pH＝6的水159mL，2号加入2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液20mL和pH＝6的水179mL，3号加入2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液10mL和pH＝6的水189mL，4号加入2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL和pH＝6的水194mL，5号加入2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液2.5mL和pH＝196.5mL，6号加入2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液1.25mL和pH＝6的水197.75mL，制得1-6号混合液，其中对照品浓度均为0.25μg/mL并且1-6号混合液中吸附剂的浓度依次为：0.4000mg/mL、0.2000mg/mL、0.1000mg/mL、0.0500mg/mL、0.0250mg/mL、0.0125mg/mL。
2将装有混合液的锥形瓶均放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5取6个1.5mL规格离心管，编号1-6，将3次的洗脱液合并于离心管内，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。实施例所用仪器为Agilent1290HPLC-G6530Q-TOF/MS。色谱柱：AgilentSB-C18(1.8μm，2.1×50mm)，进样量：2.0μL，柱温：30℃，流速0.4mL/min，流动相：A：0.1v％甲酸水溶液，B：乙腈。梯度洗脱：0～1min，10％～50v％流动相B；1～2min，50％～70v％流动相B；2～3min，70％～85v％流动相B；3～5min，85％～100v％流动相B；5～8min，100％～100v％流动相B；8～9min，100％～10v％流动相B。
质谱条件：电喷雾电离；负离子模式；全扫描模式监测(TIC)；干燥气温度：350℃；干燥气流量：12L/min；喷雾器压力：45psig；毛细管电压：3500V，碰撞电压：175V；电离电压：65V；采样率：1spetra/s；质量数扫描范围：100-1100m/z。
实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积。
表1.
不同吸附剂浓度下的富集效果折线图如图2所示。随着吸附剂浓度变大，富集效果随之变大，并在0.05mg/mL达到最大值，之后随着吸附剂浓度增加，反而富集效果下降，可能的原因是随着吸附剂浓度变大，活性成分变得难以洗脱下来，因此最优条件为0.05mg/mL。
实施例2
1配制200mL芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为0.25μg/mL的对照品稀释液，pH＝6，并加入rGOFe3O4纳米颗粒，使混合液中吸附剂浓度为0.05mg/mL，配制方法为：取5个干净200mL具塞锥形瓶，编号1-5，均加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，1号震荡1min、2号震荡2.5min、3号震荡5min、4号震荡7.5min、5号震荡10min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液分别合并于1.5mL规格离心管内，对应编号1-5，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
实验结果如下表2，表2中的数据为峰面积。
表2.
不同富集时间下的富集效果折线图如图3所示。随着富集时间的增加，富集效果逐渐提升并在5min处达到饱和，往后富集时间增加后，富集倍数并未提升，反而有下降趋势，可能原因是吸附过头导致活性物质不易被洗脱，故最优条件为5min。
实施例3
1配制200mL芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为0.25μg/mL的对照品稀释液，并加入rGOFe3O4纳米颗粒，使混合液中吸附剂浓度为0.05mg/mL，但调节pH值分别为4、5、6、7、8，配制方法为：取5个干净200mL具塞锥形瓶，编号1-5，50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL，1号加入pH＝4的水194mL、2号加入pH＝5的水194mL、3号加入pH＝6的水194mL、4号加入pH＝7的水194mL、5号加入pH＝8的水194mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液分别合并于5个1.5mL规格离心管内，对应编号1-5，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
实验结果如下表3，表3中的数据为峰面积。
表3.
不同稀释液pH值下的富集效果柱状图见图4。稀释液的pH从4升至8，其富集效果先升后降，并在pH＝6处达到最大。其可能原因是酸碱性的环境对活性成分的吸附有不同影响，且弱酸性的环境(pH＝6)中更容易被吸附剂吸附，故此时为最佳条件。
实施例4
1配制200mL芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为0.25μg/mL的对照品稀释液，pH＝6，并加入rGOFe3O4纳米颗粒，使混合液中吸附剂浓度为0.05mg/mL，配制方法为：取5个干净200mL具塞锥形瓶，编号1-5，均加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4冷却后，往1号锥形瓶内加入含有体积分数1％乙酸的乙醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。2号锥形瓶用含有体积分数1％乙酸的乙腈、3号锥形瓶用含有体积分数1％乙酸的乙酸乙酯、4号锥形瓶用含有体积分数1％乙酸的甲醇、5号锥形瓶用含有体积分数1％乙酸的正己烷。洗脱次数和步骤同1号锥形瓶。
5将3次的洗脱液均合并于1.5mL规格离心管内，编号1-5，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
实验结果如下表4，表4中的数据为峰面积。
表4.
A：含1％乙酸的乙醇
B：含1％乙酸的乙腈
C：含1％乙酸的乙酸乙酯
D：含1％乙酸的甲醇
E：含1％乙酸的正己烷
不同种类解吸剂下的富集效果折线图如图5所示。不同解吸剂的种类中，非极性的环己烷效果最差，其余的解吸剂均为极性溶剂，由于大黄的活性成分均属于极性物质，根据相似相溶原理，使用极性解吸剂可以使得富集效果最大化，在所有极性溶剂中，甲醇最符合要求。
实施例5
1配制200mL芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为0.25μg/mL的对照品稀释液，pH＝6，并加入rGOFe3O4纳米颗粒，使混合液中吸附剂浓度为0.05mg/mL，配制方法为：取5个干净200mL具塞锥形瓶，编号1-5，均加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液分别合并于1.5mL规格离心管内，对应编号1-5，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往1号离心管内加入25μL甲醇、2号加入50μL甲醇、3号加入100μL甲醇、4号加入150μL甲醇、5号加入200μL甲醇，均超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
实验结果如下表5，表5中的数据为峰面积。
表5.
不同体积溶解液的富集效果折线图见图6。溶解液的体积越大，溶解效果越充分，但是其最终浓度会变小，富集倍数会降低，但是溶解液的体积过小(例如25μL)，会导致部分活性成分溶解不全，综合考虑，溶解液50μL为最优条件。
实施例6
1配制200mL芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为0.25μg/mL的对照品稀释液，pH＝6，并加入rGOFe3O4纳米颗粒，使混合液中吸附剂浓度为0.05mg/mL，配制方法为：取5个干净200mL具塞锥形瓶，编号1-5，加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4冷却后，1号加入纯甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s，2号用含有体积分数1％乙酸的甲醇、3号用含有体积分数2％乙酸的甲醇、4号用含有体积分数3％乙酸的甲醇、5号用含有体积分数4％乙酸的甲醇。洗脱次数和步骤同1号锥形瓶。
5将3次的洗脱液分别合并于1.5mL规格离心管内，对应编号1-5，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
实验结果如下表6，表6中的数据为峰面积。
表6.
解吸剂中不同乙酸含量的富集效果柱状图如图7所示。纯甲醇和加入过多乙酸都会使得富集效果下降，甲醇中加入适量的乙酸(1％)后，可以更好地将活性成分从吸附剂中解吸出来。
实施例7
1配制200mL芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为0.25μg/mL的对照品稀释液，pH＝6，并加入rGOFe3O4纳米颗粒，使混合液中吸附剂浓度为0.05mg/mL，配制方法为：取5个干净200mL具塞锥形瓶，编号1-5，加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4冷却后，1号锥形瓶加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱1次，2号锥形瓶洗脱2次，3号锥形瓶洗脱3次，4号锥形瓶洗脱4次，5号锥形瓶洗脱5次。所有组洗脱时候，每次均用500μL解吸剂，第一次洗脱时超声10s，后续洗脱时改为涡旋20s。
5将洗脱液分别置于1.5mL规格离心管内，对应编号1-5，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
实验结果如下表7，表7中的数据为峰面积。
表7.
不同洗脱次数的富集效果折线图如图8所示。从结果中可知，洗脱次数的增加将有助于把所有活性成分全部洗脱下来，洗脱的次数在3次之后，其洗脱效果达到饱和，说明洗脱3次已经基本将所有活性成分洗脱下来，此为最佳条件。
重复性考察
参照下列实验步骤，平行做7组，作为考察。
1取1个干净200mL具塞锥形瓶，加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液合并于1.5mL规格离心管内，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
日内精密度
1取1个干净200mL具塞锥形瓶，加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液合并于1.5mL规格离心管内，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果，在同一天内连续进样6次。
日间精密度
1取1个干净200mL具塞锥形瓶，加入pH＝6的水194mL、50μg/mL对照品混合液1mL、2mg/mL的rGOFe3O4纳米颗粒分散液5mL。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有体积分数1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液合并于1.5mL规格离心管内，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果，将该样品连续进样3天，每天2次。
重复性、日内、日间精密度实验结果汇总如下表8：
表8.
药材、尿液样品含量测定
本发明所述大黄尿液可按以下方法制得：
大黄药材100g，粉碎后置于1000mL圆底烧瓶中，加入500mL95％乙醇，浸泡1h，100℃下加热回流40min，纱布滤过，滤渣再加400mL95％乙醇加热回流40min，纱布滤过，混合滤液；另取大黄药材100g，重复以上步骤，合并滤渣，加500mL蒸馏水加热回流40min，纱布滤过后，合并所有滤液，蒸发浓缩至干，再加400mL蒸馏水，搅拌后即得大黄煎液(0.5g生药/mL)，于4℃储存待用。
健康雄性SD(Sprague-Dawley)系大鼠6只，体重200±20g。实验前一周将所有大鼠饲养在22±2℃，相对湿度60±10％，光照12h的环境中，喂食实验室标准饲料，自由饮水。实验前12h所有大鼠禁食，可自由饮水。实验中6只大鼠分为2组并分别标记，1号和2号为空白，不做处理；3-6号用于尿样的采集。
3-6号大鼠第一次分别灌胃2mL生理盐水(口服剂量10mL/kg)，于代谢笼中收集1.5h的尿液作为空白尿液样本。然后给4只大鼠灌服2mL大黄煎液(口服剂量10mL/kg)，收集0～0.5h、0.5～1h、1～2h、2～4h、4～7h、7～12h的尿样，记录尿量，作为含药样本。尿液样本中加入3体积的甲醇来沉淀蛋白质，4000rpm转速下离心10min，取上清液于-20℃保存备用。
10mL尿液样本中加入30mL甲醇来沉淀蛋白质，3000rpm转速下离心10min，上清液在减压浓缩至约1mL，后混合1mL甲醇，13000rpm离心10min，上清液过0.22μm微孔滤膜，用于分析。分析前，取1mL尿样，加入pH＝6的水199mL，制成尿液稀释液样品。
本发明所述大黄药材提取液可按以下方法制得：
大黄药材粉末(过四号筛)约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液10mL，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10mL，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗脱容器，并人分液漏斗中，分取三氯甲垸层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得药材提取液母液。分析前，取1mL药材提取液母液，加入pH＝6的水199mL，制成大黄药材稀释液样品。
上述采集方法已经在《RuiSong，LeiXu，FengguoXuetal.Invivometabolismstudyofrhubarbdecoctioninratusinghigh-performanceliquidchromatographywithUVphotodiode-arrayandmass-spectrometricdetectionAstrategyforsystematicanalysisofmetabolitesfromtraditionalChinesemedicinesinbiologicalsamples[J].JournalOfChromatographyA，2010，1217(45):7144-7152.》中公开，本发明作为参考引用，并且在此基础上进行改进。
1取1个干净200mL具塞锥形瓶，加入大黄药材稀释液样品(或尿液稀释液样品)200mL、rGOFe3O4纳米颗粒10mg。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液合并于1.5mL规格离心管内，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，得富集样液13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS检测，获得富集样液的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图。图10为大黄药材富集样液的液相色谱-质谱图。图中，A图为总离子色谱图，B、C、D图为提取离子色谱图，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
图11为大黄鼠尿富集样液的液相色谱-质谱图。图中，A图为总离子色谱图，B、C、D图为提取离子色谱图，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
7以芦荟大黄素的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照富集样液同样条件用液质联用仪检测，获得芦荟大黄素对照品的提取离子色谱图，以芦荟大黄素对照品溶液的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积为横坐标，以芦荟大黄素对照品的进样量为纵坐标制作芦荟大黄素标准曲线，按同样方法制作大黄酸标准曲线、大黄素标准曲线、大黄酚标准曲线、大黄素甲醚标准曲线；根据富集样液的各成分的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算得到富集样液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。
芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度均为10μg/mL的大黄对照品溶液的液相色谱-质谱图如图9所示，图中，A图为总离子色谱图，B、C、D图为提取离子色谱图。1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素、2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚。
5种成分的标准曲线以及检测限和定量限如下表9所示：
表9
8计算富集倍数：
取芦荟大黄素对照品，配制成浓度0.25μg/mL的芦荟大黄素稀释液，按照步骤1～6的相同的方法条件，加入四氧化三铁磁性石墨烯进行富集检测，得到芦荟大黄素稀释液富集后的样液的提取离子色谱图，并将芦荟大黄素稀释液以相同条件用液质联用仪检测，得到芦荟大黄素稀释液的提取离子色谱图，芦荟大黄素稀释液富集后的样液的提取离子色谱图中芦荟大黄素色谱峰的峰面积与芦荟大黄素稀释液的提取离子色谱图中芦荟大黄素色谱峰的峰面积之比，即为芦荟大黄素的富集倍数；
按照上述方法分别计算大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的富集倍数；
(4)根据芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚各自的富集倍数，富集样液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量除以各自的富集倍数，换算得到待检测样品溶液中蒽醌类有效成分的含量；
加样回收率实验
1取1个干净200mL具塞锥形瓶，加入大黄尿液稀释液样品199.5mL、0.5mL混标(50μg/mL)、rGOFe3O4纳米颗粒10mg。
2将装有混合液的锥形瓶放入回旋振荡器，震荡5min。静置，将磁铁置于锥形瓶底部5min，进行吸附富集。
3富集结束，将磁铁紧贴锥形瓶底部，倾倒弃去水层，将装有残留固体的锥形瓶置于70℃烘箱内30min，将残留固体表面的水分烘干。取出，放冷。
4往冷却后的残留固体加入含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱3次，每次500μL，第一次洗脱时超声10s，第二次第三次洗脱时涡旋20s。
5将3次的洗脱液合并于1.5mL规格离心管内，将离心管置于80℃干式恒温器中干燥。
6往离心管内加入50μL甲醇并超声5min，将干燥后的残留固体溶解，13000rpmin离心5min，装样，用UHPLC-Q-TOF/MS分析结果。
含量测定、回收率实验结果汇总如下表10：
表10
结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性高。
Claims (10)
1.一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法，所述蒽醌类有效成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚中的一种或两种以上，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)反应容器中加入含有低浓度蒽醌类有效成分的待检测样品溶液，并加入四氧化三铁磁性石墨烯配成混合液，使混合液中四氧化三铁磁性石墨烯的浓度为0.0125mg/mL-0.4000mg/mL，混合液的pH值为4-8，震荡富集1～10min后，静置，将磁铁置于反应容器底部吸附固体，弃去液体，残留固体烘干后用解吸剂进行洗脱，所述解吸剂为甲醇、含体积分数1％乙酸的乙醇、含体积分数1％乙酸的乙腈、含体积分数1％乙酸的乙酸乙酯或含体积分数1～4％乙酸的甲醇，收集洗脱液、洗脱液干燥、所得固体用溶解剂溶解，得到富集样液，所述溶解剂为甲醇，富集样液离心，取上清液用液质联用仪检测，得到富集样液中蒽醌类有效成分的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图；
(2)以芦荟大黄素的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照富集样液同样条件用液质联用仪检测，获得芦荟大黄素对照品的提取离子色谱图，以芦荟大黄素对照品溶液的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积为横坐标，以芦荟大黄素对照品的进样量为纵坐标制作芦荟大黄素标准曲线，按同样方法制作大黄酸标准曲线、大黄素标准曲线、大黄酚标准曲线、大黄素甲醚标准曲线；根据富集样液的各成分的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到富集样液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，
(3)计算富集倍数：
取芦荟大黄素对照品，配制成浓度为0.25μg/mL的芦荟大黄素稀释液，按照步骤(1)的相同的富集方法和检测条件，加入四氧化三铁磁性石墨烯进行富集检测，得到芦荟大黄素稀释液富集后的样液的提取离子色谱图，并将芦荟大黄素稀释液以步骤(1)中相同的检测条件用液质联用仪检测，得到芦荟大黄素稀释液的提取离子色谱图，芦荟大黄素稀释液富集后的样液的提取离子色谱图中芦荟大黄素色谱峰的峰面积与芦荟大黄素稀释液的提取离子色谱图中芦荟大黄素色谱峰的峰面积之比，即为芦荟大黄素的富集倍数；
按照上述方法分别计算大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的富集倍数；
(4)根据芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚各自的富集倍数，待检测样品溶液的富集样液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量除以各自的富集倍数，换算得到待检测样品溶液中蒽醌类有效成分的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述混合液中四氧化三铁磁性石墨烯的浓度为0.0500mg/mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述混合液中调pH值为6。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，震荡富集的时间为5min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述解吸剂为含体积分数1％乙酸的甲醇。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述解吸剂的体积用量与待检测样品溶液的体积比为1：100～1000。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述解吸剂的体积用量与待检测样品溶液的体积比为1：400。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述溶解剂的体积用量与待检测样品溶液的体积比为1：1000～8000。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述溶解剂的体积用量与待检测样品溶液的体积比为1：4000。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述解吸剂洗脱的次数为3次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410263538.1A CN104090036B (zh) | 2014-06-13 | 2014-06-13 | 一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410263538.1A CN104090036B (zh) | 2014-06-13 | 2014-06-13 | 一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104090036A CN104090036A (zh) | 2014-10-08 |
| CN104090036B true CN104090036B (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=51637770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410263538.1A Active CN104090036B (zh) | 2014-06-13 | 2014-06-13 | 一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104090036B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110078839A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-08-02 | 浙江海洋大学 | 一种利用磁性介孔SiO2@Fe3O4提取土大黄中多糖的制备方法 |
| CN110286177B (zh) * | 2019-08-05 | 2022-08-30 | 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 | 一种检测芦荟苷的方法 |
| CN113376063A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-09-10 | 合肥国轩高科动力能源有限公司 | 一种磁性异物的检测方法 |
| CN114076805B (zh) * | 2021-10-22 | 2022-07-26 | 浙江大学 | 一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法及其应用 |
| CN115047108B (zh) * | 2022-06-16 | 2024-01-16 | 陕西科技大学 | 一种羊肉中抗生素药物残留的快速高通量筛查方法 |
-
2014
- 2014-06-13 CN CN201410263538.1A patent/CN104090036B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Determination of Triazole Fungicides in Vegetable Samples by Magnetic Solid-Phase Extraction with Graphene-Coated Magnetic Nanocomposite as Adsorbent Followed by Gas Chromatography–Mass Spectrometry Detection;Lu Wang等;《Food Anal. Methods》;20130503;第7卷;318-325 * |
| 大黄酸磁性印迹聚合物的制备及其应用研究;刘玉楠等;《化学通报》;20121231;第75卷(第9期);842-847 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104090036A (zh) | 2014-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107149623B (zh) | 一种中药组合物的含量测定方法 | |
| CN101732607B (zh) | 一种花芪中药制剂的质量检测方法 | |
| CN104090036B (zh) | 一种富集与检测低浓度蒽醌类有效成分的方法 | |
| WO2023024322A1 (zh) | 一种中药组合物的指纹图谱的测定方法 | |
| CN107991425B (zh) | 一种治疗跌打损伤的中药组合物的检测方法 | |
| CN104297026A (zh) | 一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法 | |
| CN103800523A (zh) | 一种抗病毒中药组合物的制备方法及指纹图谱的测定方法 | |
| CN101966223A (zh) | 一种复方扶芳藤制剂的指纹图谱检测方法 | |
| CN113063885B (zh) | 用于制备保元汤的组合物，保元汤制品，及其指纹图谱测定和质量检测方法 | |
| CN106370756B (zh) | 一种防治鸡传染性支气管炎的中药制剂的检测方法 | |
| CN103655749A (zh) | 一种大黄中有效成分的磁性提取富集方法 | |
| CN101791366A (zh) | 一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法 | |
| CN101926889A (zh) | 芍杞颗粒剂的检测方法 | |
| CN102048906B (zh) | 鸡骨草胶囊的含量测定方法 | |
| CN102698083A (zh) | 一种白花益肝排毒颗粒及其制备方法和检测方法 | |
| CN104034838A (zh) | 罗汉果止咳糖浆的质量检测方法 | |
| CN104007220B (zh) | 一种同时检测血浆中复方丹蒌片主要成分的方法 | |
| CN109884199A (zh) | 一种蜂蜜中黄酮类成分的含量测定方法 | |
| CN108776183A (zh) | 大黄甘草汤的质量控制方法 | |
| CN114942291A (zh) | 潜阳育阴颗粒的质量检测方法 | |
| CN111413423B (zh) | 地骨皮uplc特征图谱的构建方法及地骨皮的检测方法 | |
| CN112526045B (zh) | 一种同时检测或鉴别舒心降脂片中有效成分的方法 | |
| CN106610406A (zh) | 一种金银花的微量提取方法 | |
| CN111595986A (zh) | 一种益心复脉颗粒质量控制方法 | |
| WO2013053187A1 (zh) | 一种治疗急、慢性前列腺炎的中药组合物的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |