CN103954721B - 测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测肉类残留药物的方法，特别是涉及同时测定肉类中多个镇静剂类药物的方法。所述的残留镇静剂类兽药为唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、盐酸异丙嗪、硝西泮、盐酸氯丙嗪、奋乃静、盐酸氟奋乃静、氯硝西泮、盐酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌隆。本发明的优点是通过高分辨液相色谱-串联质谱法从羊肉中测定15种镇静剂类药物残留量，该方法灵敏度高、回收率高，能满足兽药检测的要求。

Description

测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法
技术领域
本发明涉及一种检测肉类残留药物的方法，特别是涉及同时测定肉类中多个镇静剂类药物的方法。
背景技术
镇静剂(sedative)是指能使中枢神经系统产生轻度抑制，减弱机能活动，从而起到消除躁动不安、恢复安静的一类药物。近年来，个别畜牧业饲养者因经济利益的驱使，擅自在畜禽饲养过程中添加此类药物以起到镇静催眠、增重催肥、缩短出栏时间的作用；另外，在动物运输过程中，为减少动物死亡和体重下降，防止肉品质降低，也常使用此类药物以减少应激带来的损失。非法使用此类药物会使其原形和代谢产物不可避免地残留于动物源食品中，人们食用了这些食品后，肝脏负担加重，头脑长期昏沉，记忆受影响，同时运动神经和肌肉功能受到抑制，因此许多国家都将此类药物列为禁用药物。我国农业部第193号公告规定严禁在动物饲料和饮用水中使用此类药物，在动物源食品中不得检出此类药物。
目前，检测残留的镇静剂类药物的方法主要有液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)、液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等。国标规定检测此类药物用液-质联用法，羊肉中镇静剂类药物残留量测定的方法仍未见报道。本发明采用快速高分辨液相色谱-串联质谱法(RRLC-MS/MS)同时测定羊肉中15种镇静剂类药物。
发明内容
本发明的主要目的是提供了一种测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法。本发明人通过高分辨液相色谱-串联质谱法检测方法从羊肉中测定15种镇静剂类药物残留量，该方法灵敏度高、回收率高，能满足兽药检测的需求。
本发明可通过以下步骤来实现：一种测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
所述的残留镇静剂类兽药为唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、盐酸异丙嗪、硝西泮、盐酸氯丙嗪、奋乃静、盐酸氟奋乃静、氯硝西泮、盐酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌隆；
(1)将羊肉绞碎、混合、均质，贮存于-18～-40℃备用；
(2)取出备用样品解冻至室温，准确称取4.5～5.5g羊肉样品于50mL聚丙烯离心管中，加入15mL10:90v/v的氨水-乙腈和30μLβ-葡萄糖醛苷酸酶≥100000units/mL，置于黑暗中，35～40℃旋涡、震摇8～12h后，30～40℃超声萃取10～15min，3500～4500r/min离心5～10min，移出上清液，残渣中加入15mL10:90，v/v氨水-乙腈，30～40℃超声萃取10～15min，3500～4500r/min离心5～10min；合并两次上清液，加入4.0～8.0g NaCl，充分混合，静置3～10min，移出上清液，于30～40℃减压浓缩至近干，加入1mL0.027mol L-190:10v/v甲酸水溶液-乙腈涡旋至瓶内残渣全部溶解，过0.22～0.45μm有机相滤膜后，供分析测定；
(3)液相色谱-串联质谱仪检测：色谱柱：Acquity UPLC CSHTM C18；流动相：A为乙腈，B为0.027mol L-1甲酸水溶液，0～15min，A10％→70％，15～16min，A70％→10％，流速0.3～0.5mL min-1；进样量：5～20μL；ESI+电离模式；多级反应检测(MRM)；毛细管电压：+3.0～3.5kV；离子源温度：100～150℃；脱溶剂气温度：300～380℃；锥孔气流速：40～55L h-1；脱溶剂气流速：450～550L h-1；
(4)制备不同浓度的基质匹配标准工作液，依次进行步骤(3)，以峰面积对浓度进行线性回归，得到镇静剂类药物的线性回归方程和相关系数；
(5)将步骤(1)至(3)的样品色谱峰面积代入镇静剂类兽药基质匹配标准工作液的线性回归方程，检出结果。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药阿扎哌隆定性离子对为328.4/121m/z；定量离子对为328.4/121m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量25～35V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药阿扎哌隆在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝126.98x+114.03；r2＝0.9974；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药甲苯噻嗪定性离子对为221.1/163.75m/z；定量离子对为221.1/163.75m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压25～35V；碰撞能量30～40V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药甲苯噻嗪在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2为：y＝41.8489x+97.8894 r2＝0.9756；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药酒石酸唑吡坦定性离子对为308.3/263.1m/z；定量离子对为308.3/235.1m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压45～55V；碰撞能量30～40/20～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药酒石酸唑吡坦在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝853.442x+195.653 r2＝0.9912；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药咔唑心安定性离子对为299.5/116.2m/z；定量离子对为299.5/116.2m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量25～35/25～35V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药咔唑心安在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝92.67x+53.114 r2＝0.9978；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氯氮卓定性离子对为300.32/227.03m/z；定量离子对为300.32/282.07m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压25～35V；碰撞能量18～30/15～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氯氮卓在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝81.3144x+138.444 r2＝0.9853；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氟哌利多定性离子对为380.21/165.01m/z；定量离子对为380.21/194.22m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量20～30/12～20V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氟哌利多在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝98.795x+77.9818 r2＝0.9960；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氟哌啶醇定性离子对为376.4/122.8m/z；定量离子对为376.4/165.4m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量50～60/30～40V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氟哌啶醇在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝42.0712x+55.6248 r2＝0.9756；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药异丙嗪定性离子对为285.2/85.8m/z；定量离子对为285.2/198m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压15～25V；碰撞能量12～18/25～35V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药异丙嗪在1～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝783.963x+517.991 r2＝0.9970；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药硝西泮定性离子对为282.3/179.9m/z；定量离子对为285.3/236.2m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～40/20～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药硝西泮在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝140.141x+213.812，r2＝0.9860；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药乙酰丙嗪定性离子对为327.4/57.9m/z；定量离子对为327.4/85.91m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压25～33V；碰撞能量30～40/15～25V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药乙酰丙嗪在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝926.957x+336.5，r2＝0.9898；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药奋乃静定性离子对为404.38/143m/z；定量离子对为404.38/171.14m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压40～50V；碰撞能量25～35/30～40V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药奋乃静在1～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝577.043x+860.76 r2＝0.9864；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氯丙嗪定性离子对为319.11/57.99m/z；定量离子对为319.11/86.06m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～35/15～25V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氯丙嗪在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝97.5618x+120.861，r2＝0.9821；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药丙酰丙嗪定性离子对为341.2/57.7m/z；定量离子对为341.2/85.7m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～40/15～25V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药丙酰丙嗪在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝49.1929x+9.7867 r2＝0.9984；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氟奋乃静定性离子对为438.33/143.04m/z；定量离子对为438.33/171.1m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量22～35/15～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氟奋乃静在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝1584.83x+623.487，r2＝0.9639；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氯硝西泮定性离子对为316.1/214.03m/z；定量离子对为316.1/214.03m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～45/20～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氯硝西泮在2～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝62.047x+25.631 r2＝0.9976；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
本发明的有益效果：建立了采用RRLC-MS/MS测定羊肉中镇静剂类药物残留量的方法。阿扎哌隆、甲苯噻嗪、咔唑心安、丙酰丙嗪、氯丙嗪的检出限为2.5μg kg-1，酒石酸唑吡坦、氟哌利多、奋乃静、氟奋乃静、异丙嗪的检出限为0.5μg kg-1，氯氮卓、氟哌丁醇、氯硝西泮的检出限为2μg kg-1，乙酰丙嗪和硝西泮的检出限为0.25μg kg-1。方法的回收率为74.1～112.8％，相对标准偏差为2.1～11.4％。RRLC-MS/MS能够为羊肉样品的检测提供足够的分析灵敏度和精度。该方法回收率高、精密度好能够满足兽药残留分析的要求，为检测动物源性食品中镇静剂提供有利工具。
附图说明:
图1空白样品的多反应监测(MRM)色谱图；
图2阿扎哌隆基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图3甲苯噻嗪基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图4唑吡坦基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图5咔唑心安基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图6氯氮卓基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图7氟哌利多基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图8氟哌丁醇基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图9异丙嗪基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图10乙酰丙嗪基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图11奋乃静基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图12丙酰丙嗪基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图13氯丙嗪基质匹配标准品(30μg kg-1)多反应监测(MRM)色谱图；
图14氟奋乃静基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图15硝西泮基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图16氯硝西泮基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图；
图1715种镇静剂类药物基质匹配标准品(30μg kg-1)的多反应监测(MRM)色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步的描述：
实施例1：一种测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
所述的残留镇静剂类兽药为唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、盐酸异丙嗪、硝西泮、盐酸氯丙嗪、奋乃静、盐酸氟奋乃静、氯硝西泮、盐酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌隆；
(1)将羊肉绞碎、混合、均质，贮存于-40℃备用。
(2)取出备用样品解冻至室温；准确称取5.5g羊肉样品于50mL聚丙烯离心管中，加入15mL氨水-乙腈(10:90，v/v)和30μLβ-葡萄糖醛苷酸酶，置于黑暗中，40℃旋涡、震摇12h后，40℃超声萃取15min，4500r/min离心10min，移出上清液，残渣中加入15mL氨水-乙腈(10:90，v/v)，40℃超声萃取15min，4500r/min离心10min；合并两次上清液，加入8.0g NaCl，充分混合，静置10min，移出上清液，于40℃减压浓缩至近干，加入1mL0.027mol L-1甲酸水溶液-乙腈(90:10，v/v)涡旋至瓶内残渣全部溶解，过0.22μm有机相滤膜后，供分析测定；
(3)液相色谱-串联质谱仪检测。快速高分辨液相色谱-串联质谱仪(RRLC-MS/MS)：Agilent1290series液相色谱仪(配有G1322A脱气装置、G1312B二元泵、G1357D自动进样器，Agilent公司，美国)；6460三重四级杆质谱仪(配有G1948B离子源，Agilent公司，美国)；色谱柱：Acquity UPLC CSHTM C18；流动相：A为乙腈，B为0.027mol L-1甲酸水溶液，0～15min，A10％→70％，15～16min，A70％→10％，流速：0.5mL min-1；进样量：20μL；ESI+电离模式；多级反应检测；毛细管电压：+3.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：380℃；锥孔气流速：55L h-1；脱溶剂气流速：550L h-1。其他参数见表1、表2。
表1.MRM监测模式下各镇静剂类药物质谱条件
(4)制备不同浓度的基质匹配标准工作液，依次进RRLC-MS/MS分析，以峰面积对浓度进行线性回归，得到镇静剂类药物的线性回归方程和相关系数；
(5)将步骤(1)至(3)的样品结果代入镇静剂类兽药的基质匹配标准工作液的线性回归方程，检出结果。
表2所述的残留镇静剂类兽药的线性回归方程和相关系数为：
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
实施例2：一种测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
所述的残留镇静剂类兽药为唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、盐酸异丙嗪、硝西泮、盐酸氯丙嗪、奋乃静、盐酸氟奋乃静、氯硝西泮、盐酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌隆；
(1)将羊肉绞碎、混合、均质，贮存于-18℃备用。
(2)取出备用样品解冻至室温；准确称取4.5g羊肉样品于50mL聚丙烯离心管中，加入15mL氨水-乙腈(10:90，v/v)和30μLβ-葡萄糖醛苷酸酶，置于黑暗中，35℃旋涡、震摇8h后，30℃超声萃取10min，3500r/min离心5min，移出上清液，残渣中加入15mL氨水-乙腈(10:90，v/v)，30℃超声萃取10min，3500r/min离心5min；合并两次上清液，加入4.0g NaCl，充分混合，静置3min，移出上清液，于30℃减压浓缩至近干，加入1mL0.027mol L-1甲酸水溶液-乙腈(90:10，v/v)涡旋至瓶内残渣全部溶解，过0.45μm有机相滤膜后，供分析测定。
(3)液相色谱-串联质谱仪检测。快速高分辨液相色谱-串联质谱仪(RRLC-MS/MS)：Agilent1290series液相色谱仪(配有G1322A脱气装置、G1312B二元泵、G1357D自动进样器，Agilent公司，美国)；6460三重四级杆质谱仪(配有G1948B离子源，Agilent公司，美国)；色谱柱：Acquity UPLC CSHTM C18；流动相：A为乙腈，B为0.027mol L-1甲酸水溶液，0～15min，A10％→70％，15～16min，A70％→10％，流速：0.3mL min-1；进样量：5μL；ESI+电离模式；多级反应检测(MRM)；毛细管电压：+3.0kV；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：300℃；锥孔气流速：40L h-1；脱溶剂气流速：450L h-1。其他参数见表3。
表3.MRM监测模式下各镇静剂类药物质谱条件
(4)制备不同浓度的基质匹配标准工作液，依次进RRLC-MS/MS分析，以峰面积对浓度进行线性回归，得到镇静剂类药物的线性回归方程和相关系数；
(5)将步骤(1)至(3)的样品结果代入镇静剂类兽药的基质匹配标准工作液的线性回归方程，检出结果。
所述的镇静剂类药物的线性回归方程和相关系数与实施例1相同。
实验例：
羊肉样品购自市场(兰州)，绞碎、混合、均质，贮存于-18℃备用。对照品酒石酸唑吡坦(Lot:171258-200601，100％)、氟哌啶醇(Lot:100313-200301，100％)、盐酸异丙嗪(Lot:100422-201002，99.4％)、氯氮卓(Lot:171248-200301，100％)、盐酸氯丙嗪(Lot:100460-200501，100％)、奋乃静(Lot:100133-200602，100％)、盐酸氟奋乃静(Lot:100162-201003，98.8％)、硝西泮(Lot:171217-200402，100％)、氯硝西泮(Lot:171227-201103，100％)等购自中国药品生物制品检定所；盐酸甲苯噻嗪(Lot:11010，98.0％)、丙酰丙嗪(Lot:10404，99.0％)、咔唑心安(Lot:00421，99.0％)、阿扎哌隆(Lot:20124，98.5％)、乙酰丙嗪(Lot:21105，99％)等为Dr.Ehrenstorfer GmbH公司标准品(德国)；氟哌利多(CDCU-1229001)为USP标准品。甲醇和乙腈为色谱纯试剂，购自Merck公司(德国)，β-葡萄糖醛苷酸酶(Lot:SV130107，≥100000units/mL)购自上海安谱科学仪器有限公司(中国)，其他试剂均为国产分析纯试剂。
标准溶液
分别准确称取唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、盐酸异丙嗪、硝西泮、盐酸氯丙嗪、奋乃静、盐酸氟奋乃静、氯硝西泮、盐酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌隆等15种标准品10.00mg，用甲醇溶解，并定容至50mL的棕色容量瓶中，制成标准储备液。此储备液中15种标准品的浓度为200μg mL-1。使用前用0.027molL-1甲酸水溶液-乙腈(90:10,v/v)稀释成50、30、10、5、2、1和0.5μg L-1混合标准工作溶液。基质匹配标准工作溶液制备于空白样品的提取液中。所有的标准溶液于-18℃保存在棕色瓶中，备用。
样品制备
取出备用样品解冻至室温。准确称取5.0g羊肉样品于聚丙烯离心管中(50mL)，加入15mL氨水-乙腈(10:90，v/v)和30μLβ-葡萄糖醛苷酸酶，置于黑暗中，37℃旋涡、震摇10h后30℃超声萃取10min，4000r/min离心5min，移出上清液，残渣中加入15mL氨水-乙腈(10:90，v/v)，30℃超声萃取10min，4000r/min离心5min。合并两次上清液，加入5.0g NaCl，充分混合，静置5min，移出上清液，于35℃减压浓缩至近干，加入1mL0.027mol L-1甲酸水溶液-乙腈(90:10,v/v)涡旋至瓶内残渣全部溶解下来，过0.22μm有机相滤膜后，供分析测定。
RRLC–MS/MS分析
快速高分辨液相色谱-串联质谱仪(RRLC-MS/MS)：Agilent1290series液相色谱仪(配有G1322A脱气装置、G1312B二元泵、G1357D自动进样器，Agilent公司，美国)；6460三重四级杆质谱仪(配有G1948B离子源，Agilent公司，美国)。
色谱条件色谱柱：Acquity UPLC CSHTM C18(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm,Waters公司，美国)，流动相：A为乙腈，B为0.027mol L-1甲酸水溶液，流速：0.3mL min-1，进样量：5μL。流动相梯度洗脱条件见表4。
表4.梯度条件
质谱条件ESI+电离模式，多级反应检测(MRM)，毛细管电压：+3.2kV，离子源温度：120℃，脱溶剂气温度：350℃，锥孔气流速：50L h-1：脱溶剂气流速：500L h-1。其他参数详见表5。MRM色谱图见图1-图17。
表5.MRM监测模式下各镇静剂类药物质谱条件
线性方程、检出限、回收率和精密度
用流动相将标准储备液稀释成一系列不同浓度的标准工作液，依次进RRLC-MS/MS分析，以峰面积对浓度进行线性回归，得到15种镇静剂类药物的线性回归方程和相关系数(表6)。阿扎哌隆、甲苯噻嗪、咔唑心安、丙酰丙嗪、氯丙嗪、氯氮卓和氟哌啶醇在5～50μg L-1范围有良好的线性关系(浓度为5、10、20、30和50μg L-1)；唑吡坦、氟哌利多、乙酰丙嗪、氟奋乃静和硝西泮在0.5～50μg L-1范围有良好的线性关系(浓度为0.5、1、10、30和50μg L-1)；异丙嗪和奋乃静在1～50μg L-1范围有良好的线性关系(浓度为1、5、10、30和50μg L-1)；氯硝西泮在2～50μg L-1范围有良好的线性关系(浓度为2、10、20、30和50μg L-1)。
以信噪比(S/N)等于3和10为标准，分别测得15种镇静剂类药物的检出限和定量限(表6)。
表6.方法的线性方程、相关系数、定性限(LOD)和定量限(LOQ)
在空白样品中加入标准物质，用日内和日间的平均回收率评价方法的准确度，精确度根据日内重复性和日间再现性评价。回收率及相关系数见表7。
表7.实验室内的准确度(回收率，％)、重复性(RSD，％)和再现性(RSD，％)
日内和日间平均回收率分别在74.1～116.8％和78.7～112.8％。重复性和再现性的相对标准偏差分别为2.6～11.2％和2.1～11.4％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他未背离本发明的精神实质与原理所做的改变、修饰、替换、组合、简化，均视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于包括以下步骤：
所述的残留镇静剂类兽药为唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、盐酸异丙嗪、硝西泮、盐酸氯丙嗪、奋乃静、盐酸氟奋乃静、氯硝西泮、盐酸甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、乙酰丙嗪、氟哌利多、阿扎哌隆；
(1)将羊肉绞碎、混合、均质，贮存于-18～-40℃备用；
(2)取出备用样品解冻至室温，准确称取4.5～5.5g羊肉样品于50mL聚丙烯离心管中，加入15mL10:90v/v的氨水-乙腈和30μLβ-葡萄糖醛苷酸酶≥100000units/mL，置于黑暗中，35～40℃旋涡、震摇8～12h后，30～40℃超声萃取10～15min，3500～4500r/min离心5～10min，移出上清液，残渣中加入15mL10:90，v/v氨水-乙腈，30～40℃超声萃取10～15min，3500～4500r/min离心5～10min；合并两次上清液，加入4.0～8.0g NaCl，充分混合，静置3～10min，移出上清液，于30～40℃减压浓缩至近干，加入1mL 0.027mol L-190:10v/v甲酸水溶液-乙腈涡旋至瓶内残渣全部溶解，过0.22～0.45μm有机相滤膜后，供分析测定；
(3)液相色谱-串联质谱仪检测：快速高分辨液相色谱-串联质谱仪(RRLC-MS/MS)：Agilent 1290series液相色谱仪，配有G1322A脱气装置、G1312B二元泵、G1357D自动进样器，Agilent公司，美国；6460三重四级杆质谱仪，配有G1948B离子源，Agilent公司，美国；色谱柱：Acquity UPLCCSHTM C18；流动相：A为乙腈，B为0.027mol L-1甲酸水溶液，0～15min，A10％→70％，15～16min，A 70％→10％，流速0.3～0.5mL min-1；进样量：5～20μL；ESI+电离模式；多级反应检测(MRM)；毛细管电压：+3.0～3.5kV；离子源温度：100～150℃；脱溶剂气温度：300～380℃；锥孔气流速：40～55Lh-1；脱溶剂气流速：450～550L h-1；
(4)制备不同浓度的基质匹配标准工作液，依次进行步骤(3)，以峰面积对浓度进行线性回归，得到镇静剂类药物的线性回归方程和相关系数；
(5)将步骤(1)至(3)的样品色谱峰面积代入镇静剂类兽药基质匹配标准工作液的线性回归方程，检出结果；
所述的在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药阿扎哌隆定性离子对为328.4/121m/z；定量离子对为328.4/121m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量25～35V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药阿扎哌隆在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝126.98x+114.03；r2＝0.9974；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氯硝西泮定性离子对为316.1/214.03m/z；定量离子对为316.1/214.03m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～45/20～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氯硝西泮在2～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝62.047x+25.631 r2＝0.9976；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
2.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药甲苯噻嗪定性离子对为221.1/163.75m/z；定量离子对为221.1/163.75m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压25～35V；碰撞能量30～40V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药甲苯噻嗪在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2为：y＝41.8489x+97.8894 r2＝0.9756；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
3.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药酒石酸唑吡坦定性离子对为308.3/263.1m/z；定量离子对为308.3/235.1m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压45～55V；碰撞能量30～40/20～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药酒石酸唑吡坦在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝853.442x+195.653 r2＝0.9912；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
4.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药咔唑心安定性离子对为299.5/116.2m/z；定量离子对为299.5/116.2m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量25～35/25～35V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药咔唑心安在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝92.67x+53.114 r2＝0.9978；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
5.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氯氮卓定性离子对为300.32/227.03m/z；定量离子对为300.32/282.07m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压25～35V；碰撞能量18～30/15～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氯氮卓在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝81.3144x+138.444 r2＝0.9853；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
6.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氟哌利多定性离子对为380.21/165.01m/z；定量离子对为380.21/194.22m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量20～30/12～20V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氟哌利多在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝98.795x+77.9818 r2＝0.9960；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
7.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氟哌啶醇定性离子对为376.4/122.8m/z；定量离子对为376.4/165.4m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量50～60/30～40V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氟哌啶醇在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝42.0712x+55.6248 r2＝0.9756；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
8.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药异丙嗪定性离子对为285.2/85.8m/z；定量离子对为285.2/198m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压15～25V；碰撞能量12～18/25～35V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药异丙嗪在1～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝783.963x+517.991 r2＝0.9970；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
9.如权利要求1所述的测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，其特征在于还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药硝西泮定性离子对为285.3/179.9m/z；定量离子对为282.3/236.2m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～40/20～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药硝西泮在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝140.141x+213.812，r2＝0.9860；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药乙酰丙嗪定性离子对为327.4/57.9m/z；定量离子对为327.4/85.91m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压25～33V；碰撞能量30～40/15～25V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药乙酰丙嗪在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝926.957x+336.5，r2＝0.9898；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药奋乃静定性离子对为404.38/143m/z；定量离子对为404.38/171.14m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压40～50V；碰撞能量25～35/30～40V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药奋乃静在1～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝577.043x+860.76 r2＝0.9864；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氯丙嗪定性离子对为319.11/57.99m/z；定量离子对为319.11/86.06m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～35/15～25V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氯丙嗪在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝97.5618x+120.861，r2＝0.9821；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药丙酰丙嗪定性离子对为341.2/57.7m/z；定量离子对为341.2/85.7m/z；驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量30～40/15～25V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药丙酰丙嗪在5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝49.1929x+9.7867 r2＝0.9984；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积；
或还包括有在步骤(3)液相色谱-串联质谱仪检测中：所述的残留镇静剂类兽药氟奋乃静定性离子对为438.33/143.04m/z；定量离子对为438.33/171.1m/z；
驻留时间0.02～0.05ms；锥孔电压30～40V；碰撞能量22～35/15～30V；
在步骤(4)所述的残留镇静剂类兽药氟奋乃静在0.5～50μg kg-1浓度范围的线性回归方程和相关系数r2，为：y＝1584.83x+623.487，r2＝0.9639；
其中：x为：基质匹配标准工作液浓度；y为：MRM色谱峰面积。
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