CN108645924A

CN108645924A - 基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法

Info

Publication number: CN108645924A
Application number: CN201810254555.7A
Authority: CN
Inventors: 宁云山; 王宗珊; 周景权; 李妍
Original assignee: Zhuhan Smu Biomedicine Public Service Platform Co Ltd; Southern Medical University
Current assignee: Zhuhan Smu Biomedicine Public Service Platform Co Ltd; Southern Medical University
Priority date: 2017-06-22
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2038-03-26
Also published as: CN108645924B

Abstract

本发明提供了一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的代谢性标志物联检方法，该方法采用同位素标记的氨基酸标准品及同位素标记的肉碱标准品作为内标、以高浓度质控血片和低浓度质控血片作为阳性对照，结合了乙腈‑水溶液为流动相，采用母离子扫描、中性丢失扫描和多反应离子监测多种扫描方式联用的超高效液相色谱串联质谱仪检测条件的合理设置，可实现仅需要低至3μL极少量的血液样品，且仅需一次检测，即可完成对134多种包括氨基酸和肉碱类代谢物的定性和定量分析，该发明具有所需样品量少，高灵敏度，高准确度，高通量，高重复性等优点，适合于大规模的临床干血片样品的分析应用。

Description

基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法

技术领域

本发明涉及代谢物检测领域，具体涉及了一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法。

背景技术

细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放(cellsignaling)、能量传递、细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢物调控涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇等多种物质，其种类繁多，使得代谢网络错综复杂，通过对代谢产物进行检测分析，可用于寻找疾病的生物标记物，建立代谢指纹图谱。

传统的对代谢物水平的检查主要依赖实验室的特异性检查，一项实验只能检测一种代谢物，该方法需要样品量大，且周期长、准确度较低。同时，由于代谢物的特殊性，对其含量水平变化检测的重复性、准确度、灵敏度偏低，导致检测时容易出现假阴性和假阳性判断。

因此，有必要提供一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的，消耗少量样品，即可实现高灵敏度、高准确度、高通量和高重复性的代谢物检测方法。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的，样品用量少、且高灵敏度、高准确度、高通量和高重复性的代谢物检测方法。

具体技术方案如下：

一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物检测方法，包括以下步骤：

(1)制备待测样品：用含内标的萃取液萃取样品血片中的代谢物后，进行衍生化反应；所述内标为同位素标记的氨基酸标准品及同位素标记的肉碱标准品；

(2)设置空白滤纸片作为空白对照，质控血片作为阳性对照，所述质控血片包括高浓度质控血片和低浓度质控血片；

(3)对所述待测样品、空白对照和阳性对照用超高效液相色谱串联质谱仪检测；

所述超高效液相色谱串联质谱仪检测的条件包括：样品进样量为10-20μl；乙腈水溶液为流动相；毛细管的雾化；经电喷雾离子源电离；采用母离子扫描、中性丢失扫描和多反应离子监测三种扫描方式中至少一种方式进行扫描。

在其中一些实施例中，所述同位素标记的氨基酸标准品包括同位素标记的：L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸、L-瓜氨酸和DL-谷氨酸；

所述同位素标记的肉碱标准品包括同位素标记的：左旋肉碱、L-肉豆蔻酰基肉碱、L-乙酰基肉碱、L-棕榈酰基肉碱、L-丙酰基肉碱、L-异戊酰基肉碱、L-丁酰基肉碱和L-辛酰基肉碱。

在其中一些实施例中，所述同位素标记的氨基酸标准品为Cambridge IsotopeLaboratories的NSK-A；所述同位素标记的肉碱标准品为Cambridge IsotopeLaboratories的NSK-B。

在其中一些实施例中，所述高浓度质控为Chromsystems instruments&ChemicalsGmbH，0193；所述低浓度质控为Chromsystems instruments&Chemicals GmbH，0192。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述制备待测样品包括：

(1)血样采集：采血、滴于滤纸片上，使其自然均匀渗透至滤纸片得7-8mm血斑，室温风干后，在血样均匀分散的滤纸片用打孔器打孔，孔径为3-3.4mm，得样品血片；

(2)样品前处理：向样品血片中加入含内标的萃取液对血片中的代谢标志物进行萃取；离心并转移萃取液，于48-52℃氮气吹干；加入衍生化试剂并在加热条件下密闭反应，于48-52℃氮气吹干；加入80％的乙腈水溶液，震荡混匀复溶，准备上机进样。

在其中一些实施例中，所述含内标的萃取液由以下方法制备得到：取适量的同位素标记的氨基酸标准品和同位素标记的肉碱标准品，溶于适量甲醇水溶液，超声，即得；及/或

所述衍生化试剂由以下方法制备得到：冰浴条件下，将乙酰氯按照1：(8.5-9.5)的比例加入到正丁醇中，即得。

在其中一些实施例中，所述含内标的萃取液由以下方法制备得到：

(1)向所述同位素标记的氨基酸标准品Cambridge Isotope Laboratories，NSK-A和所述同位素标记的肉碱标准品Cambridge Isotope Laboratories，NSK-B中分别加入体积百分比为(50±1)％的甲醇水溶液(1±0.1)ml进行溶解，超声20min，得NSK-A内标储备液和NSK-B内标储备液；

(2)量取8-12ml甲醇，分别加入55μl NSK-A内标储备溶液和55μl NSK-B内标储备溶液，振摇2min以混合均匀，即得。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱串联质谱仪检测包括：

超高效液相色谱条件为：采用体积百分比为(80±2)％的乙腈水溶液作为流动相，0-0.12min流速为0.200mL/min，0.12-1.12min流速为0.016mL/min，1.12-1.60min时流速为0.200mL/min；

质谱条件为：源温度120℃，电离源毛细管压力3.0KV，样品锥孔电压50.0V，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量800L/hr，锥孔气流量50.0L/hr。

在其中一些实施例中，所述中性丢失扫描，用于检测酸性和中性氨基酸；所述母离子扫描用于检测酰基肉毒碱；所述中性丢失扫描、母离子扫描与多反应离子监测三种扫描方式联合使用，用于同时对氨基酸、脂肪酸进行综合检测分析。

在其中一些实施例中，所述新生儿代谢物包括以下氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Hcy、His、Leu、Lys、Met、Orn、Phe、Pip、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；以下酰基肉碱：C0、C2、C3、C4、C4-OH、C4DC、C5、C5-OH、C5DC、C5:1、C6、C8、C10、C12、C14、C14-OH、C14DC、C14:1、C16、C16-OH、C16:1-OH、C18、C20、C22、C24、C26、C6:1、C6-OH、C8:1、C8:2、C8DC、C10DC、C12:1、C12:2、C12-OH、C12DC、C16:1、C16:2、C16DC、C18DC C18:1、C18-OH、C18:1-OH、C10:1、C10:2、C14:2、C18:2、C6DC；和以下代谢物间比值：Arg/Orn、Cit/Arg、Gly/Ala、Met/Leu、Met/Phe、Orn/Cit、Phe/Tyr、Tyr/Cit、Val/Phe、Cit/Phe、Glu/Phe、Glu/Cit、Gly/Phe、His/Phe、Leu/Phe、Thr/Phe、Trp/Phe、Tyr/Phe、C2/C0、C3/C0、C3/C2、C3/C16、C4/C2、C4/C3、C4/C8、C5/C0、C5/C2、C5/C3、C5-OH/C8、C5-OH/C0、C5DC/C5-OH、C5DC/C16、C8/C2、C8/C10、C16-OH/C16、C26/C20、C14:1/C16、C3DC、C3DC/C10、C5DC/C8、(0+2+3+16+18:1)/Cit、(C16+C18)/C0、C0/(C16+C18)、C3/Met、C3DC/C4、C4-OH/C2、C4-OH/C3、C5-OH/C3、C5DC/C3、C6/C3、C8/C3、C10/C3、C12/C3、C14/C3、C14:1/C8:1、C14-OH/C3、C16/C2、C16/C3、C16-OH/C3、C18/C3、C18-OH/C3、(C16+C18:1)/C2、C10:2/C10。

本发明所述基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物联检方法，具有以下有益效果：

本发明经过发明人大量创造性劳动，基于超高效液相色谱串联质谱的技术，采用同位素标记的氨基酸标准品及同位素标记的肉碱标准品作为内标、以高浓度质控血片和低浓度质控血片作为阳性对照，结合了乙腈水溶液为流动相，采用母离子扫描、中性丢失扫描和多反应离子监测多种扫描方式联用的超高效液相色谱串联质谱仪检测条件的合理设置，可实现仅需要低至3μL极少量的血液样品，且仅需一次检测，即可完成对134多种包括氨基酸和肉碱类代谢物的定性和定量分析，该发明具有所需样品量少，高灵敏度，高准确度，高通量，高重复性等优点，适合于大规模的临床干血片样品的分析应用。

附图说明

图1为本发明的操作流程图；

图2枫糖尿症患者质谱分析图谱；

图3正常人群质谱分析图。

具体实施方式

本发明提供超高效液相色谱串联质谱技术路线，如图1所示，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、干血片的采血、运输及保存:

新生儿出生后喂饱母乳48小时后进行血样采集，用采血针进行足跟采血滴于滤纸片(Whatman 903)上，让血液自然渗透至8mm大小的血斑，采集3个血斑以便复查，室温风干，置于密封袋内密封，常温运输，如不能及时送检2-8℃短期保存，-20℃长期保存。

实施例2、相关试剂的制备：

2.1内标储备液的溶解：向含NSK-A和NSK-B内标物的瓶子中分别加入50％甲醇水溶液1ml进行溶解，超声20min，制备得到NSK-A内标储备液和NSK-B内标储备液，于4℃可保存1个月；使用前恢复至室温，其中NSK-A和NSK-B含有12种氨基酸同位素内标物和8种肉碱同位素内标物，Cambridge Isotope Laboratories(CIL)提供的NSK-A的成分如表1所示，NSK-B成分如表2所示。

2.2衍生化试剂：冰水浴中将乙酰氯按照1：9的比例加入到正丁醇中混合，试剂现配现用。

2.3流动相复溶液：80％乙腈水溶液。

表1

表2

实施例3、干血片样品的前处理

3.1.打开96孔板离心机，等待仪器稳定；打开氮吹仪和孵育箱，调整准备运行状态；调整好LC-MS/MS运行状态。

3.2打孔：将样本血片和质控血片从-20℃冰箱中拿出放置室温，用打孔器打孔(3.2mm)，取虚线范围内分散均匀的血样(血片较中央的无明显凝集血块的部位)，放入96孔过滤板中。

3.4内标工作溶液的配制：瓶中先加入甲醇11ml，分别加55μl NSK-A内标储备溶液和NSK-B内标储备溶液，配制完成振摇2min，混合均匀。

3.5快速加入内标工作液，每孔100μl，封膜。

3.6萃取：室温静置萃取20min，转至96孔板离心机，20℃，3500r/min离心2min后转移至96孔接收板中。

3.7氮吹：用氮吹仪吹干，温度调至50℃，至少吹15min，直至样品完全吹干。

3.8衍生化反应：每孔加70μl衍生化试剂，封膜后放进孵育器中进行衍生化反应，65℃放置15min。

3.9吹干：揭开封膜，氮吹不少于15min，温度为50℃，直至样品完全吹干。

3.10复溶，加入100μl复溶液(即80％乙腈水溶液，现配现用)，封膜，振荡混匀，室温下振荡10min，转速约300r/min。

其中，上述质控血片为：高浓度质控血片level 2，德国Chromsystemsinstruments&Chemicals GmbH，0193；低浓度质控血片level 1，德国Chromsystemsinstruments&Chemicals GmbH，0192；用于方法的准确性和精密度验证，以及检测过程中的阳性对照。

其说明书提供的质控血片Level-1所含分析物及分析物参考范围如表3所示，质控血片Level-2所含分析物及分析物参考范围如表4所示：

表3低浓度质控血片Level-1

表4高浓度质控血片Level-2

实施例4超高效液相色谱串联质谱仪检测

4.1流动相A为80％乙腈；进样量为15μl；

4.2液相色谱条件如表5所示：

表5

	时间(min)	流速(mL/min)	A％	B％
					1	0	0.200	100％	0.00％
2	0.12	0.016	100％	0.00％
					3	1.12	0.700	100％	0.00％
4	1.60	0.200	100％	0.00％

4.3质谱方法如表6所示：

表6

质谱条件	参考值
		源温度(℃)	120
电离源毛细管压力(KV)	3.0
		样品锥孔电压(V)	50.0
脱溶剂气温度(℃)	350
		脱溶剂气流量(L/Hr)	800
锥孔气流量(L/hr)	50.0

4.4方法准确度及精密度验证：

分别取两个不同浓度的标准品(质控血片Level-1和Level-2)，每一浓度为6个样本，按照干血片样品前处理方法，用超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，以各个分析物的的实测浓度分析上述方法的准确度和精密度，分别测定质控血片Level1和质控血片Level2中各物质的含量，质控血片Level1测定结果如表7所示、质控血片Level2测定结果如表8所示：

表7

表8

将上述分析物的检测结果(即表7、表8)与质控干血片生产厂家提供的产品说明书中分析物及分析物浓度的参考范围(即表3、表4)对比可知，本发明所述方法对质控分析样品的检测结果均在参考范围内，各物质平行测试的RSD值在10％以内，说明本发明所述基于液质联用技术的代谢标志物快速检测方法，方法准确度与精密度高，稳定可靠。

实施例5

采用如实施例4所述基于超高效液相色谱串联质谱技术的代谢物联检方法，对高苯丙氨酸血症患者的血样进行分析，其结果如表9所示：

此样本Phe检测结果612.82，是参考上限的5.1倍，为阳性结果，说明本方法对代谢标志物的检测准确，可灵敏检测出代谢标志物的异常。

表9

实施例6

采用如实施例4所述基于超高效液相色谱串联质谱技术的代谢物联检方法，对3例正常人的血样进行分析，其结果如表10-12所示：

对3例血样中代谢标志物的含量检测值均在正常参考范围内波动，为阴性结果，说明本发明所述的代谢标志物联检方法对代谢物水平的检测准确，未出现假阳性升高或降低的结果。

表10

表11

表12

实施例7

采用实施例1-3所述的方法，分别对枫糖尿症的患者血样和正常人群血样进行样品制备及前处理，并采用如实施例4所述基于超高效液相色谱串联质谱技术的代谢物联检方法进行分析，得到如图2、图3所示中性丢失扫描分析图谱。

其中，图2显示，本发明所述代谢物联检方法中的中性丢失扫描方式检测到枫糖尿症的患者血样中的代谢物有以下氨基酸及其比值：Asp、Glu、Hcy、Leu、Met、Phe、Pip、Ser、Trp、Tyr、Val、Met/Leu、Met/Phe、Phe/Tyr、Val/Phe、Glu/Phe、Leu/Phe、Trp/Phe，其中可见Leu、leu/Phe浓度特异性增高，其余未见明显异常。图3显示，检测到正常人血清中的代谢物有以下氨基酸及其比值：Asp、Glu、Hcy、Leu、Met、Phe、Pip、Ser、Trp、Tyr、Val、Met/Leu、Met/Phe、Phe/Tyr、Val/Phe、Glu/Phe、Leu/Phe、Trp/Phe，均未见明显异常。。亮氨酸(Leu)水平为枫糖尿症患者的特异性代谢物指标，对比图2、图3分析图谱，发现枫糖尿症患者血中亮氨酸水平为1370.50μM，为正常上限值的4.5倍。明显高于正常人群水平范围50.00μM～300.00μM，说明本发明所述代谢物联检方法从可检测到的大量代谢物中，能够准确区分出表达水平异常的代谢物，本方法检测特异性强、灵敏度高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，所述同位素标记的氨基酸标准品包括同位素标记的：L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸、L-瓜氨酸和DL-谷氨酸；

3.根据权利要求2所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，所述同位素标记的氨基酸标准品为Cambridge Isotope Laboratories的NSK-A；所述同位素标记的肉碱标准品为Cambridge Isotope Laboratories的NSK-B。

4.根据权利要求1所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，所述高浓度质控为Chromsystems instruments&Chemicals GmbH，0193；所述低浓度质控为Chromsystemsinstruments&Chemicals GmbH，0192。

5.根据权利要求1-4任一项所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述制备待测样品包括：

(2)样品前处理：向样品血片中加入含内标的萃取液对血片中的代谢标志物进行萃取；离心并转移萃取液，于48-52℃氮气吹干；加入衍生化试剂并在加热条件下密闭反应，于48-52℃氮气吹干；加入体积百分比为(80±2)％的乙腈水溶液，震荡混匀复溶，准备上机进样。

6.根据权利要求5所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，

所述含内标的萃取液由以下方法制备得到：取适量的同位素标记的氨基酸标准品和同位素标记的肉碱标准品，溶于适量甲醇水溶液，超声，即得；及/或

所述衍生化试剂由以下方法制备得到：冰浴条件下，将乙酰氯按照1：(8.5～9.5)的体积比加入到正丁醇中，即得。

7.根据权利要求6所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，所述含内标的萃取液由以下方法制备得到：

(1)向所述同位素标记的氨基酸标准品Cambridge Isotope Laboratories，NSK-A和所述同位素标记的肉碱标准品Cambridge Isotope Laboratories，NSK-B中分别加入体积百分比为(50±1)％的甲醇水溶液(1±0.1)ml进行溶解，超声混匀，得NSK-A内标储备液和NSK-B内标储备液；

(2)量取10-12ml甲醇，分别加入55μl NSK-A内标储备溶液和55μlNSK-B内标储备溶液，振摇以混合均匀，即得。

8.根据权利要求1-4任一项所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱串联质谱仪检测包括：

9.根据权利要求8所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，所述中性丢失扫描，用于检测酸性和中性氨基酸；所述母离子扫描用于检测酰基肉毒碱；所述中性丢失扫描、母离子扫描与多反应离子监测三种扫描方式联合使用，用于同时对氨基酸、脂肪酸进行综合检测分析。

10.根据权利要求9所述的新生儿代谢物的检测方法，其特征在于，所述新生儿代谢物包括以下氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Hcy、His、Leu、Lys、Met、Orn、Phe、Pip、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；以下酰基肉碱：C0、C2、C3、C4、C4-OH、C4DC、C5、C5-OH、C5DC、C5:1、C6、C8、C10、C12、C14、C14-OH、C14DC、C14:1、C16、C16-OH、C16:1-OH、C18、C20、C22、C24、C26、C6:1、C6-OH、C8:1、C8:2、C8DC、C10DC、C12:1、C12:2、C12-OH、C12DC、C16:1、C16:2、C16DC、C18DC C18:1、C18-OH、C18:1-OH、C10:1、C10:2、C14:2、C18:2、C6DC；和以下代谢物间比值：Arg/Orn、Cit/Arg、Gly/Ala、Met/Leu、Met/Phe、Orn/Cit、Phe/Tyr、Tyr/Cit、Val/Phe、Cit/Phe、Glu/Phe、Glu/Cit、Gly/Phe、His/Phe、Leu/Phe、Thr/Phe、Trp/Phe、Tyr/Phe、C2/C0、C3/C0、C3/C2、C3/C16、C4/C2、C4/C3、C4/C8、C5/C0、C5/C2、C5/C3、C5-OH/C8、C5-OH/C0、C5DC/C5-OH、C5DC/C16、C8/C2、C8/C10、C16-OH/C16、C26/C20、C14:1/C16、C3DC、C3DC/C10、C5DC/C8、(0+2+3+16+18:1)/Cit、(C16+C18)/C0、C0/(C16+C18)、C3/Met、C3DC/C4、C4-OH/C2、C4-OH/C3、C5-OH/C3、C5DC/C3、C6/C3、C8/C3、C10/C3、C12/C3、C14/C3、C14:1/C8:1、C14-OH/C3、C16/C2、C16/C3、C16-OH/C3、C18/C3、C18-OH/C3、(C16+C18:1)/C2、C10:2/C10。