CN114166986A - 胎粪代谢标志物及其筛选方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胎粪代谢标志物及其筛选方法、应用，该胎粪代谢标志物用于评价新生儿黄疸，该胎粪代谢标志物包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸与新生儿黄疸之间具有密切关联，通过检测这些代谢标志物能够可靠地判断新生儿黄疸的发生。这样，只需要通过对刚出生的新生儿所排泄的胎粪进行检测，就可以在第一时间判断新生儿是否容易发生黄疸，并及时进行相关的监测及干预，无需等到新生儿出生后两三天再进行判断，真正做到早发现、早干预、早治疗。
Description
技术领域
本申请涉及医学技术领域，尤其涉及一种胎粪代谢标志物及其筛选方法、应用。
背景技术
新生儿黄疸是一种比较常见的病症，其发生主要是由于体内胆红素代谢障碍而引起血清内胆红素浓度升高所致，表现为新生儿的皮肤、巩膜及黏膜黄染等现象，如胆红素值超标也称高胆红素血症。严重的高胆红素血症可导致胆红素脑病，该病如果未能及时发现并治疗可引发胆红素脑病及严重后遗症。
根据新生儿胆红素代谢特点，黄疸现象一般于新生儿出生后2～3天才出现，通过抽血检测可进一步准确判断胆红素高低。但这会导致对新生儿的黄疸诊断时间有所延迟，做不到第一时间发现并干预治疗。
发明内容
本申请公开了一种胎粪代谢标志物及其筛选方法、应用，通过研究发现胎粪代谢标志物与黄疸发生之间的关联性，为新生儿黄疸的早期预测提供可靠证据，以解决现有的黄疸诊断技术存在诊断及干预时间延迟的问题。
第一个方面，本申请提供给一种胎粪代谢标志物，用于评价新生儿黄疸，所述胎粪代谢标志物包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
进一步地，所述胎粪代谢标志物还包括蛋氨酸和苯丙氨酸。
第二个方面，本申请提供一种如第一个方面所述胎粪代谢标志物的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
样品采集：分别采集黄疸组和对照组的胎粪，所述黄疸组为患有黄疸的新生儿、所述对照组为正常的新生儿；
样品处理：对所述胎粪进行前处理，得到待分析样品；
样品测试：对所述待分析样品进行非靶向代谢组学分析测试，得到测试结果；
代谢标志物筛选：对测试结果进行数据处理与分析，确定所述黄疸组与所述对照组之间的差异代谢物，并根据所述差异代谢物确定所述胎粪代谢标志物。
进一步地，所述样品处理的步骤包括：
冷冻干燥采集的所述胎粪；
称取冷冻干燥后的所述胎粪，加入含有氯磺丙脲的提取液，混合均匀后在室温下超声25min～35min；其中，所述提取液为乙腈与水按照体积比1:1的混合液体，所述氯磺丙脲在所述提取液中的浓度为5μmol/L，所述胎粪与所述提取液的固液比为30mg:600μL～800μL；
对浸有所述胎粪的所述提取液进行第一次离心，得到第一上清液，使用所述第一上清液作为所述待分析样品；其中，离心时间为15min～20min、离心转速为12000r/min～14000r/min。
进一步地，所述样品处理的步骤还包括：
向所述第一上清液中再次加入所述提取液进行第二次离心，得到第二上清液，使用所述第二上清液作为待分析样品；其中，离心时间为25min～30min、离心转速为18000r/min～19000r/min。
进一步地，所述样品测试的步骤为：使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪对所述待分析样品进行非靶向代谢组学分析；
使用所述超高效液相色谱的条件包括：流动相A为含0.01wt％甲酸的水，流动相B为含0.01wt％甲酸的乙腈，流速为0.3mL/min，使用C18色谱柱作为分离柱，色谱分离梯度是1～12min时所述流动相B由体积比为2％上升至98％、保持2min后所述流动相B相的体积比逐渐下降至2％，总洗脱时间为16min；
使用所述四级杆飞行时间质谱仪的条件包括：离子采集范围的质荷比为100～800，采集模式为正离子模式ESI+和负离子模式ESI-，毛细管电压均为3.5kV，进样锥电压均为20V；雾化气压均为35psi，碰撞气和干燥气均为氮气，流速分别为50L/h和9L/min，干燥器温度均为350℃。
进一步地，使用所述超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪对所述待分析样品进行非靶向代谢组学分析的进样步骤为：将所述待分析样品中的每一个都吸取10μL进行混合作为质控样品，将所述待分析样品采用乱序进样检测且每间隔十个所述待分析样品插入一个所述质控样品。
进一步地，所述代谢标志物筛选的步骤为：对所述测试结果进行正交最小二乘判别分析，得到OPLS-DA模型，根据所述OPLS-DA模型确定所述黄疸组与所述对照组之间的所述差异代谢物，再根据对所述差异代谢物的分析从中筛选出所述胎粪代谢标志物。
第三个方面，本申请提供一种如第一个方面所述的胎粪代谢标志物在制备新生儿黄疸检测试剂盒中的应用。
第四个方面，本申请提供一种新生儿黄疸诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测新生儿胎便中的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
进一步地，所述试剂盒用于检测新生儿胎便中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及蛋氨酸和苯丙氨酸。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
本申请发明人研究发现，肠道代谢产物中的支链氨基酸——缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸与新生儿黄疸之间具有密切关联，通过检测这些代谢标志物能够可靠地判断新生儿黄疸的发生。这样，只需要通过对刚出生的新生儿所排泄的胎粪(也即新生儿出生后的第一次排便)进行检测，就可以在第一时间预判新生儿是否容易发生黄疸，并及时进行相关的监测、干预及治疗，无需等到新生儿出生后两三天再进行判断，真正做到早发现、早干预、早治疗。不仅如此，由于是利用新生儿胎粪进行检测，无需对新生儿采血，既可以降低操作难度、又可以避免因采血而给新生儿带来的疼痛感。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例中黄疸组对对照组的OPLS-DA模型的置换检验结果图；
图2是本申请实施例中黄疸组对对照组的OPLS-DA模型得分散点图；
图3是申请实施例中黄疸组对对照组的Z-score图；
图4是本申请实施例中黄疸组对对照组的差异代谢物火山图；
图5是本申请实施例中黄疸组对对照组的差异代谢物相关系数热图；
图6是本申请实施例中黄疸组对对照组的差异代谢物相关系数热图(标记出负相关区域)；
图7是本申请实施例中黄疸组对对照组的差异代谢物的代谢通路图；
图8是本申请实施例中黄疸组的重点差异代谢物ROC曲线图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“中”、“竖直”、“水平”、“横向”、“纵向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。
并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请中的具体含义。
此外，术语“安装”、“设置”、“设有”、“连接”、“相连”应做广义理解。例如，可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
此外，术语“第一”、“第二”等主要是用于区分不同的装置、元件或组成部分(具体的种类和构造可能相同也可能不同)，并非用于表明或暗示所指示装置、元件或组成部分的相对重要性和数量。除非另有说明，“多个”的含义为两个或两个以上。
下面将结合具体实施例和附图对本申请的技术方案作进一步的说明。
黄疸在新生儿期非常常见，发生在60％到84％的足月和近足月儿，约8％-11％的新生儿发生高胆红素血症。严重高胆红素血症可导致胆红素脑病，该病如果未能及时发现并治疗可引发胆红素脑病及严重后遗症，具有高住院率、高发病率、高致残性的特点，给社会及家庭带来沉重的负担。但是目前的新生儿黄疸并不能在新生儿一出生就可以确认，而是要出生后两三天才能确认，存在黄疸确认延迟的问题。可见如何更早发现新生儿黄疸、对其进行及时有效的治疗与护理显得十分重要。
本申请发明人在研究中发现，黄疸患者肠道菌群的变化主要表现为物种丰富度显著增加，这表示肠道代谢产物可能在黄疸中扮演重要作用，因此本申请通过研究黄疸新生儿与非黄疸新生儿肠道代谢组学的差异，找到新生儿黄疸与肠道代谢产物之间的关系，并以此来预判诊断新生儿黄疸的发生。
第一个方面，本申请实施例提供一种胎粪代谢标志物，用于评价新生儿黄疸，该胎粪代谢标志物包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本申请发明人研究发现，肠道代谢产物中的支链氨基酸——缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸与新生儿黄疸之间具有密切关联，通过检测这些代谢标志物能够可靠地判断新生儿黄疸的发生。这样，只需要通过对刚出生的新生儿所排泄的胎粪进行检测，就可以在第一时间预判新生儿是否容易发生黄疸，并及时进行相关的监测、干预及治疗，无需等到新生儿出生后两三天再进行判断，真正做到早发现、早干预、早治疗。不仅如此，由于是利用新生儿胎粪进行检测，无需对新生儿采血，既可以降低操作难度、又可以避免因采血而给新生儿带来的疼痛感。
进一步地，该胎粪代谢标志物还包括蛋氨酸和苯丙氨酸。本申请实施例通过代谢组学分析实验发现，将蛋氨酸和苯丙氨酸与上述三种支链氨基酸共同作为代谢标志物时，这五种代谢标志物与总胆红素构建的诊断模型显示AUC达96.6％，表明同时使用这五种代谢标志物来预判新生儿黄疸的结果更可靠准确。
第二个方面，本申请实施例提供一种上述胎粪代谢标志物的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：
样品采集：分别采集黄疸组和对照组的胎粪，黄疸组为患有黄疸的新生儿、对照组为正常的新生儿；
样品处理：对胎粪进行前处理，得到待分析样品；
样品测试：对待分析样品进行非靶向代谢组学分析测试，得到测试结果；
代谢标志物筛选：对测试结果进行数据处理与分析，确定所述黄疸组与所述对照组之间的差异代谢物，并根据所述差异代谢物确定所述胎粪代谢标志物。
通过上述筛选方法能够可靠地筛选出胎粪代谢标志物，使其可用于新生儿黄疸的预判诊断，从而实现利用胎粪在第一时间及时确认新生儿黄疸的目的，进而为新生儿黄疸的及早治疗与护理提供了诊断基础。
进一步地，样品处理的步骤包括：
冷冻干燥采集的胎粪；
称取冷冻干燥后的胎粪，加入含有氯磺丙脲的提取液，混合均匀后在室温下超声25min～35min；其中，提取液为乙腈与水按照体积比1:1的混合液体，氯磺丙脲在提取液中的浓度为5μmol/L，胎粪与提取液的固液比为30mg:600μL～800μL；
对浸有胎粪的提取液进行第一次离心，得到第一上清液，使用第一上清液作为待分析样品；其中，离心时间为15min～20min、离心转速为12000r/min～14000r/min。
本申请实施例中，首先通过冷冻干燥的处理方式将胎粪中的水分除去，然后再通过提取液将胎粪中待检测的物质有效提取出来，并通过一次离心将胎粪中的杂质去除，以将第一上清液作为待分析样品进行代谢物成分分析。
进一步地，样品处理的步骤还包括：向第一上清液中再次加入提取液进行第二次离心，得到第二上清液，使用第二上清液作为待分析样品；其中，离心时间为25min～30min、离心转速为18000r/min～19000r/min。在第一次离心的基础上进行第二次离心，能够更好地去除胎粪中的杂质，利于进一步提高对胎粪中代谢物检测的结果准确性。
进一步地，样品测试的步骤为：使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪对待分析样品进行非靶向代谢组学分析；
使用超高效液相色谱的条件包括：流动相A为含0.01wt％甲酸的水，流动相B为含0.01wt％甲酸的乙腈，流速为0.3mL/min，使用C18色谱柱作为分离柱，色谱分离梯度是1～12min时流动相B由体积比为2％上升至98％、保持2min后流动相B相的体积比逐渐下降至2％，总洗脱时间为16min；
使用四级杆飞行时间质谱仪的条件包括：离子采集范围的质荷比为100～800，采集模式为正离子模式ESI+和负离子模式ESI-，毛细管电压均为3.5kV，进样锥电压均为20V；雾化气压均为35psi，碰撞气和干燥气均为氮气，流速分别为50L/h和9L/min，干燥器温度均为350℃。
通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪(也即UPLC-QTOF/MS)联用，再结合商用的代谢组学分析软件进行处理，可以得到庞大的数据矩阵，以便后续对测试结果的处理与分析。
进一步地，使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪对待分析样品进行非靶向代谢组学分析的进样步骤为：将待分析样品中的每一个都吸取10μL进行混合作为质控样品，将待分析样品采用乱序进样检测且每间隔十个待分析样品插入一个质控样品。通过将样品混合作为质控样品，以及乱序进样的方式，能够监控检测设备(即超高效液相色谱仪和四级杆飞行时间质谱仪)和样品的稳定性，确保后续对测试结果能进行可靠的分析。
进一步地，代谢标志物筛选的步骤为：对测试结果进行正交最小二乘判别分析，得到OPLS-DA模型，根据OPLS-DA模型确定黄疸组与对照组之间的差异代谢物，再根据对差异代谢物的分析从中筛选出胎粪代谢标志物。
第三个方面，本申请实施例还提供一种上述胎粪代谢标志物在制备新生儿黄疸检测试剂盒中的应用。由于上述胎粪代谢标志物与新生儿黄疸之间存在密切关联，故可以利用桑树胎粪代谢标志物制作相应的试剂盒，用于对新生儿黄疸进行便捷地测试。
第四个方面，本申请实施例还提供一种新生儿黄疸诊断试剂盒，该试剂盒用于检测新生儿胎便中的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。该试剂盒通过检测新生儿胎便中的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，来快速判断新生儿出现黄疸的可能性，为新生儿黄疸的相关确认提供诊断依据。
本申请实施例的试剂盒还用于检测新生儿胎便中的蛋氨酸和苯丙氨酸。
为了对本申请的技术方案及技术效果做更详细的说明，下面将通过更具体的实施例和测试结果分析等对本申请进行进一步说明。
实施例
本实施例提供一种胎粪代谢标志物，用于评价新生儿黄疸，该胎粪代谢标志物包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸。
上述胎粪代谢标志物的筛选方法包括以下步骤：
样品采集：分别采集黄疸组和对照组的胎粪，所述黄疸组为患有黄疸的新生儿、所述对照组为正常的新生儿；
样品处理：对所述胎粪进行前处理，得到待分析样品；
样品测试：对所述待分析样品进行非靶向代谢组学分析测试，得到测试结果；
测试结果处理与分析：对所述测试结果进行主成分分析和正交最小二乘判别分析，得到OPLS-DA模型，根据所述OPLS-DA模型筛选出患有黄疸的新生儿与正常的新生儿之间的差异代谢物，所述差异代谢物为所述胎粪代谢标志物。
其中，本实施例的黄疸组共计68例，包括男性34例、女性34例，这其中又分为顺产34例、剖宫产34例，平均胎龄38周。黄疸，也即新生儿高胆红素血症的诊断标准参照美国儿科学会新生儿黄疸干预指南及中华医学会儿科学分会新生儿学组新生儿高胆红素血症诊断和治疗专家共识。本实施例的对照组(也即正常的健康新生儿组)共计68例，包括男性34例、女性34例，这其中又分为顺产34例、剖宫产34例，平均胎龄38+1周。黄疸组和对照组两组在性别和胎龄、出生方式等基本资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
其中，黄疸组和对照组的入选标准为：出生前母亲无高危因素，母亲未使用抗生素，入组前生后未排胎便；排除标准为：母亲有高危因素，产前2周内有使用抗生素，新生儿为小于胎龄儿，入院后证实有严重感染或存在先天畸形的新生儿。
样品采集的具体步骤为：分别采集黄疸组和对照组的新生儿出生后首次排出的胎粪，质量为3～5g，置于-80℃冰箱中备用。
其中，样品处理的步骤包括：(1)冷冻干燥采集的胎粪以去除水分；(2)称取30mg冷冻干燥后的胎粪，向其中加入600μL含有5μmol/L氯磺丙脲的提取液，混合均匀后在室温下超声25min～35min；其中，提取液是乙腈与水按照体积比1:1的混合液体，氯磺丙脲在提取液中的作用是作为内标物；(3)对浸有胎粪的提取液在12000r/min下进行第一次离心15min，得到第一上清液；(4)向经过第一次离心的第一上清液中再次加入等体积(即600μL)提取液，在转速为18000r/min下涡旋离心25min，得到第二上清液，使用第二上清液作为待分析样品。在上述样品处理步骤中，通过两次离心能够较充分的去除胎粪中的杂质，利于提高后续样品测试的可靠性。
其中，样品测试的步骤为：使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪(Ultraperformanceliquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF/MS)对待分析样品进行非靶向代谢组学分析。
使用超高效液相色谱的条件包括：流动相A为含0.01wt％甲酸的水，流动相B为含0.01wt％甲酸的乙腈，流速为0.3mL/min，使用C18色谱柱作为分离柱，色谱分离梯度是1～12min时流动相B由体积比为2％上升至98％、保持2min后流动相B相的体积比逐渐下降至2％，总洗脱时间为16min；也即在前12min内，流动相B与流动相A的体积比逐渐由2:98改变为98:2，在流动相B与流动相A的体积比达到98:2后保持2min该流动相比例，而后再从流动相B与流动相A的体积比为98:2逐渐改变至2:98，完成待分析样品在超高效液相色谱中的检测。
使用四级杆飞行时间质谱仪的条件包括：离子采集范围的质荷比为100～800，采集模式为正离子模式ESI+和负离子模式ESI-，毛细管电压均为3.5kV，进样锥电压均为20V；雾化气压均为35psi，碰撞气和干燥气均为氮气，流速分别为50L/h和9L/min，干燥器温度均为350℃。
在使用上述液质联用仪器进样分析时，具体进样步骤为：将待分析样品中的每一个都吸取10μL进行混合作为质控样品，将待分析样品采用乱序进样检测且每间隔十个待分析样品插入一个质控样品。通过这种质控样品以及乱序进样检测的方式来监控液相和质谱设备以及待分析样品的稳定性，以保证后续测试结果分析的可靠性。
经过测试后采集到的数据也即测试结果，其经过Agilent公司的代谢组学分析软件Mass Profinder处理后将产生庞大的数据矩阵，该矩阵包含有样品名、保留时间、质荷比和离子峰面积等信息。为了提高数据的质量和可靠性，获得的数据矩阵以质控样品为参照，将变异系数(Variation coefficient)大于30％的变量进行过滤去除。随后，应用SIMCA-P+13.0(Umetrics，USA)对数据集进行统计分析，包括主成分分析(principal componentanalysis，PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)。通过OPLS-DA模型[p(corr)(偏相关系数)绝对值>0.5，VIP(变量权重)值>1]筛选到差异代谢物后运用HMDB和KEGG数据库对相应的质荷比进行匹对(ppm<10)，列出候选的胎粪代谢标志物。最终，通过差异化合物所对应的二级碎片和标准品对候选的胎粪代谢标志物的结构进行最终的匹配和确定。
具体地，本实施例对黄疸组和对照组的数据集进行统计分析时，采用正交偏最小二乘判别分析，并对应建立OPLS-DA模型。由于本实施例的代谢组学数据具有高维(检测出代谢物种类多)、小样本(检测样本量偏少)的特性，在这些变量中既包含与分类变量相关的差异变量，也包含大量互相之间可能存在关联的无差异变量。这导致使用PCA模型(或PLS模型)进行分析，由于相关变量的影响，差异变量会分散到更多的主成分上，无法进行更好的可视化和后续分析。因此本实施例采用OPLS-DA分析，可以过滤掉所要分析的代谢物中与分类变量不相关的正交变量，并对非正交变量和正交变量分别分析，从而获取更加可靠的代谢物在黄疸组与对照组之间的组间差异等信息。
参阅图1所示，图1是本申请实施例中黄疸组对对照组的OPLS-DA模型的置换检验结果图。从图1可以得出以下结论：(1)原模型R2Y比较接近1，说明建立的模型比较符合样本数据的真实情况；(2)原模型Q2接近0.5，说明如果有新样本加入模型，会得到较为近似的分布情况，总的来说原模型可以较为好地解释两组样本之间的差异；(3)置换检验随机模型的Q2值均小于原模型的Q2值，Q2的回归线与纵轴的截距小于零，同时随着置换保留度逐渐降低，置换的Y变量比例增大，随机模型的Q2逐渐下降，以上说明原模型具有良好的稳健性，不存在过拟合现象。
进一步结合图2所示，图2是本申请实施例中黄疸组对对照组的OPLS-DA模型得分散点图。从图2可以看出，黄疸组与对照组的代谢物可以清楚区分开。结合以上图1和图2的OPLS-DA模型相关结果可知，对本实施例进行代谢组学分析的结果无论是在质谱的正离子模式还是负离子模式下，样品和仪器的稳定性均呈现出较好的状态，代谢物可清楚区分黄疸组与对照组。
在上述OPLS-DA模型的基础上，进一步分析黄疸组与对照组之间的差异代谢物。参阅图3所示，图3是申请实施例中黄疸组对对照组的Z-score图。该Z-score图是基于代谢物的相对含量转换而来，用于衡量同一水平面上代谢物的相对含量的高低，其中浅色圆圈表示的是对照组的代谢物，深色圆圈表示的是黄疸组的代谢物。从图3可以看出，代谢物在黄疸组与对照组中的变化程度较大。进一步结合图4所示，图4是本申请实施例中黄疸组对对照组的差异代谢物火山图。在图4中每个散点代表一个代谢物，散点大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散点越大VIP值越大。散点形状代表最终的筛选结果，在图4中右半部分中深色的圆形表示的是显著上调的代谢物，在图4中左半部分圆形表示的是显著下调的代谢物，而浅色的圆形则表示非显著差异的代谢物。从图4可知，黄疸组与对照组之间差异显著的代谢物共有82个，其中61个在黄疸组明显富集，21个在对照组明显富集。
在筛选出82个差异代谢物之后，通过做差异代谢物相关系数热图、将差异代谢物与KEGG数据库进行匹对以及结合通路分析对这些差异代谢物进一步分析。参阅图5和图6所示，图5是本申请实施例中黄疸组对对照组的差异代谢物相关系数热图，图6则通过矩形框标记出图5中负相关的区域。从图5和图6可以看出两个代谢物的线性关系为正相关时趋于1、负相关时趋于-1。此外，本申请实施例还将筛选出的差异代谢物与KEGG等代谢物数据库进行匹对，在取得差异代谢物的匹配信息后，对对应物种的通路数据库进行搜索和代谢通路分析。如图7所示为本申请实施例黄疸组的差异代谢物的通路分析图，在图7中，正离子模式结果显示黄疸组氨酰tRNA生物合成、泛酸和辅酶a生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成富集程度高。负离子模式的通路分析图，显示缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、嘧啶代谢、丙酮酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解富集程度高。
在筛选出上述生物合成富集程度高的差异代谢物后，绘制ROC曲线(ReceiverOperating Curve)并计算AUC(Area Under the ROC Curve)分析缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的特异性和灵敏度，参阅图8所示，图8是本申请实施例中黄疸组的重点差异代谢物的ROC曲线图。从图8可知，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的AUC评分为0.874；而缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸与蛋氨酸以及苯丙氨酸联合的AUC评分为0.86；缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及胆红素联合的AUC评分为0.966，这表明缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及胆红素联合诊断新生儿黄疸的可靠性高。
以上对本申请实施例公开的一种胎粪代谢标志物及其筛选方法、应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
Claims (10)
1.一种胎粪代谢标志物，用于评价新生儿黄疸，其特征在于，所述胎粪代谢标志物包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的胎粪代谢标志物，其特征在于，所述胎粪代谢标志物还包括蛋氨酸和苯丙氨酸。
3.一种如权利要求1或2任一项所述胎粪代谢标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
样品采集：分别采集黄疸组和对照组的胎粪，所述黄疸组为患有黄疸的新生儿、所述对照组为正常的新生儿；
样品处理：对所述胎粪进行前处理，得到待分析样品；
样品测试：对所述待分析样品进行非靶向代谢组学分析测试，得到测试结果；
代谢标志物筛选：对测试结果进行数据处理与分析，确定所述黄疸组与所述对照组之间的差异代谢物，并根据所述差异代谢物确定所述胎粪代谢标志物。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述样品处理的步骤包括：
冷冻干燥采集的所述胎粪；
称取冷冻干燥后的所述胎粪，加入含有氯磺丙脲的提取液，混合均匀后在室温下超声25min～35min；其中，所述提取液为乙腈与水按照体积比1:1的混合液体，所述氯磺丙脲在所述提取液中的浓度为5μmol/L，所述胎粪与所述提取液的固液比为30mg:600μL～800μL；
对浸有所述胎粪的所述提取液进行第一次离心，得到第一上清液，使用所述第一上清液作为所述待分析样品；其中，离心时间为15min～20min、离心转速为12000r/min～14000r/min。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述样品处理的步骤还包括：
向所述第一上清液中再次加入所述提取液进行第二次离心，得到第二上清液，使用所述第二上清液作为待分析样品；其中，离心时间为25min～30min、离心转速为18000r/min～19000r/min。
6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述样品测试的步骤为：使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪对所述待分析样品进行非靶向代谢组学分析；
使用所述超高效液相色谱的条件包括：流动相A为含0.01wt％甲酸的水，流动相B为含0.01wt％甲酸的乙腈，流速为0.3mL/min，使用C18色谱柱作为分离柱，色谱分离梯度是1～12min时所述流动相B由体积比为2％上升至98％、保持2min后所述流动相B的体积比逐渐下降至2％，总洗脱时间为16min；
使用所述四级杆飞行时间质谱仪的条件包括：离子采集范围的质荷比为100～800，采集模式为正离子模式ESI+和负离子模式ESI-，毛细管电压均为3.5kV，进样锥电压均为20V；雾化气压均为35psi，碰撞气和干燥气均为氮气，流速分别为50L/h和9L/min，干燥器温度均为350℃。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，使用所述超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪对所述待分析样品进行非靶向代谢组学分析的进样步骤为：将所述待分析样品中的每一个都吸取10μL进行混合作为质控样品，将所述待分析样品采用乱序进样检测且每间隔十个所述待分析样品插入一个所述质控样品。
8.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述代谢标志物筛选的步骤为：对所述测试结果进行正交最小二乘判别分析，得到OPLS-DA模型，根据所述OPLS-DA模型确定所述黄疸组与所述对照组之间的所述差异代谢物，再根据对所述差异代谢物的分析从中筛选出所述胎粪代谢标志物。
9.一种如权利要求1至2任一项所述的胎粪代谢标志物在制备新生儿黄疸检测试剂盒中的应用。
10.一种新生儿黄疸诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测新生儿胎便中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及蛋氨酸和苯丙氨酸。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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