CN114334170A

CN114334170A - 一种代谢年龄预测模型及其在结直肠癌诊断中的应用

Info

Publication number: CN114334170A
Application number: CN202210244839.4A
Authority: CN
Inventors: 陈利民; 李振; 孙西予; 丛杨海
Original assignee: Shanghai Yunxiang Medical Technology Co ltd; Tianjin Yunjian Medical Lab Co ltd
Current assignee: Shanghai Yunxiang Medical Technology Co ltd; Tianjin Yunjian Medical Lab Co ltd
Priority date: 2022-03-14
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明揭示了一种代谢年龄预测模型及其在结直肠癌诊断中的应用，通过模型得到衰老模式，即精确计时的代谢组衰老时钟，其是通过血清代谢谱建立的代谢年龄预测模型，并发现了参与其中的代谢通路。本发明从代谢组学的角度阐明了在结直肠癌发生过程中衰老模式(由精确计时的代谢组衰老时钟表征)存在的延缓衰老现象，并展示了所述的延缓衰老现象用于结直肠癌诊断的可能性。本发明进一步提出：结直肠癌样本在各个分期（包括晚期癌前病变期）均呈不同程度的延缓衰老趋势，其中I期样本延缓衰老的程度最高。对这种代谢组衰老时钟的低老化趋势进行研究能够有效提高结直肠癌诊断中的阳性预测值，并从代谢通路方面加深对结直肠癌病理生理学的认知。

Description

一种代谢年龄预测模型及其在结直肠癌诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药建模领域，涉及一种代谢年龄预测模型及其在结直肠癌诊断中的应用。

背景技术

人类血清代谢组分析可以探索衰老模式中体内发生的代谢变化。不同年龄健康人血清的代谢谱能够解析不同生理年龄的代谢模态，作为研究个人衰老的正常生物学基线。观察正常衰老基线在疾病（例如结直肠癌）中发生的偏移和变化，将有助于临床诊断并揭示潜在的病理生理学，进而加深对疾病发病机制的理解。

发明内容

本发明的主要目的在于提供代谢年龄预测模型在评估结直肠癌的风险中的应用及分类建模的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种代谢年龄预测模型，所述代谢年龄预测模型的数据集分为训练集及评估集；

所述训练集，数据范围为健康人群,用于衰老模式建模和进行模态分类；

所述评估集，数据范围为未知人群,用于结直肠癌诊断。

优选的，代谢年龄预测模型的训练集的组成和构建包括如下步骤：

(1)采集训练集的样本，并记录样本的实际年龄；

(2)对步骤(1)的待测样本通过代谢组学检测数据对衰老模式建模，获得样本的代谢年龄；

(3)将步骤(2)中得到的依据人群基线中代谢年龄相对于样本实际年龄的偏移量分布对样本的衰老程度进行衰老分类。

优选的，所述训练集以3折交叉验证方式训练。

优选的，所述衰老分类采用分位数回归方法，自上而下根据每个实际年龄中各个代谢年龄的97.5%, 50%和2.5%分位数拟合得到，位于上方分位数线以上的样本定义为过度衰老组，位于下方分位数线以下的样本定义为延缓衰老组，其余样本为正常衰老组。

一种代谢年龄预测模型在评估结直肠癌的风险的应用。

优选的，所述评估结直肠癌的风险包括如下步骤：

（1）采集评估集的样本，并记录样本的实际年龄；

(2)对步骤(1)的待测样本通过代谢组学检测数据对衰老模式建模，根据模型计算出样本的代谢年龄；

(3)将步骤(2)中得到的依据人群基线中代谢年龄相对于样本实际年龄的偏移量分布与衰老分类对比，对其中延缓衰老组的样本给出结直肠癌阳性风险诊断。

本发明的有益效果是：

本发明揭示了一个衰老分类，即精确计时的代谢组衰老时钟，代谢组衰老时钟是通过血清代谢谱建立的代谢年龄预测模型，并发现了参与其中的代谢通路。本发明从代谢组学的角度阐明了在结直肠癌发生过程中衰老模式存在的延缓衰老现象，并展示了所述的延缓衰老现象用于结直肠癌诊断的可能性。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1.代谢年龄预测模型选取的代谢通路特征。

图2.代谢年龄预测模型选取的代谢通路的可视化权重。

图3.代谢年龄预测模型的预测结果与实际年龄相关性图，每个子图为一个样本组，x轴为实际年龄，y轴为预测的代谢年龄。每个子图中均有三条位置相同的分位数线，它们自上而下分别由最左侧的样本集（训练集）根据每个实际年龄中各个代谢年龄的97.5%,50%和2.5%分位数拟合得到。位于上方分位数线以上的样本定义为过度衰老（hyper）组，位于下方分位数线以下的样本定义为延缓衰老（hypo）组，其余样本为正常衰老（normal）组。

样本组说明：Normal-train：健康人群-训练集，Normal -test：健康人群-评估集1，CRC-APL：结直肠癌人群-APL，CRC-stage I：结直肠癌人群-I期，CRC-stage II：结直肠癌人群-I期，CRC-stage III：结直肠癌人群-I期，CRC-stage I~III：结直肠癌人群（所有分期）。

图4.代谢年龄偏移值随着实际年龄的分布图。每个子图为一个样本组，x轴为实际年龄，y轴为代谢年龄的偏移值。偏移值由每个实际年龄的代谢年龄减去该实际年龄对应的代谢年龄50%分位数得到，即位于中间的分位数线在每个实际年龄的偏移值恒为0。

图5.代谢年龄偏移值的统计柱状图，x轴为样本组，y轴为样本比例。每个样本组左侧的柱形高度表示该样本组内被分到延缓衰老（hypo）组的样本比例，右侧的柱形高度表示该样本组内被分到过度衰老（hyper）组的样本比例。可以看出，对于“健康人群”（训练集/评估集1），这两个样本比例均接近于2.5%，而对于结“直肠癌人群”（训练集/评估集2）的不同分期，延缓衰老（hypo）组的样本比例则有不同程度的显著增加（3~10倍）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部试验结果。

本发明提供了代谢年龄预测模型在评估结直肠癌的风险的应用。代谢年龄预测模型建模及训练的过程，实施例中评估集分为评估集1及评估集2，并选取不同的人群。

样本的收集和人群信息：

在本实施例中，总共使用 3019 个健康人群样本（Normal）构成基线，其中2309个样本作为训练集，710个样本作为评估集1（即评估集的第1部分，包括健康人群）。另一组研究对象为2653例结直肠癌（CRC）患者，其中晚期癌前病变（advanced precancerouslesions，APL）患者（CRC-APL）715例，I期（CRC-stage I）1091例，II期（CRC-stage II）430例，III期（CRC-stage III）417例，均作为评估集2（即评估集的第2部分，包括CRC人群）。从每个人身上采集一份血清样本。所有样本的人口学统计信息如下。

实施例的实施方法：

样本处理方法：

血清样本从-80 °C冰箱中取出，放在冰上解冻。每个血清样本吸取10 μL的样品，之后加入由甲醇、乙腈和 ddH₂O (5:3:2 v/v) 组成的 240 μL 提取缓冲液（储存在-20 °C下）。混合后的样品在 4°C 下涡旋振荡混匀，然后在相同温度下以12,000 ×g 离心30分钟。将每个样品的上清液 170 μL转移到小瓶中，并在进样前储存在-20 °C 下。

质谱检测方法：

流动注射分析(FIA)采用QE-Plus质谱仪(Thermo Fisher，美国)进行。以含有0.1%甲酸的5%乙腈-水溶液为流动相(流速为50 μL/min)，每次进样10 μL，分析时长3 min。样品在4kv电压和325°C温度下喷雾电离，质核比m/z检测范围是60-900，分辨率为140,000。电离模式依次设置为正、负两种，以收集每个样品的完整代谢谱，得到原始质谱文件（raw文件）。

数据处理方法：

原始MS文件使用ProteoWizard进行转换和中心化，并保存为mzXML文件。通过proFIA包提取同一批次样本的进样时间段并检测m/z特征峰。然后用xcms包中的MzClust方法对检测到的特征峰进行对齐，得到同一批次（batch）内样本共有的代谢特征（比例阈值minProp = 0.5），将各个样本的正负极代谢特征按行堆叠，形成数据矩阵。将鲁棒局部估计散点图平滑(robust LOESS)模型应用于每一个代谢特征，以消除注入过程中的同一批次内的信号漂移。通过归一化到每个代谢特征的正常基线的中位数，以消除信号的批次间差异。使用impute包采用k-最近邻(kNN)算法补全缺失值。

建立模型的方法：

健康人群被分为训练集(75%)和评估集1(25%)。训练集中的代谢特征首先与实际年龄进行相关分析，并保留绝对相关系数|r| ≥ 0.3的特征。使用xMSannotator包以±5ppm的窗宽对筛选后的代谢特征在KEGG化合物数据库中进行注释。使用绝对相关系数对代谢物的数值进行加权，将注释到的化合物按不同方向性（即正/负相关）分别聚合到KEGG通路中，形成代谢通路的数据矩阵。利用推导出的数据矩阵拟合弹性网络模型，并采用3折交叉验证(CV)优化超参数。对于训练集，使用CV过程中每个样本作为非训练样本时的预测值。对于评估集1和评估集2，使用最终模型的预测值。

分位数线性回归模型拟合了训练集中预测值的2.5%、50%和97.5%分位限。样本的年龄差异定义为样本的预测值与样本实际年龄所在的50%分位数线之间的差异。预测低于2.5%分位数回归线的样本被归类为低老化，即延缓衰老组，预测高于97.5%的样本被归类为超老化，即过度衰老组，其余的被归类为正常老化，即正常衰老组。

基于模型低老化分类的结直肠癌诊断方法：

为了展示衰老分类在结直肠癌诊断中的应用，所有低老化分组中的样本被认定为结直肠癌阳性。为了模拟大众人群中结直肠癌的发病率，以30倍的覆盖率（coverage）在评估集1和评估集2中进行有替换的自举（bootstrap），使得APL的发病率为760/10023,结直肠癌（所有分期）的发病率为65/10023，即分别从健康人群的评估集1、CRC人群的APL组和CRC人群的所有分期中分别有替换地自举抽样9198×30、760×30和65×30个样本，并以抽样后样本的分类结果给出结直肠癌诊断。以真阳性计数与总检测阳性计数的比值计算阳性预测值(PPVs)，以中心极限定理假设通过logit变换计算PPV的置信区间。

实施例的实施效果：

代谢年龄预测模型和分类结果：

使用训练集中的2309个样本，用3折CV拟合弹性网络模型，优化后的超参数为α=0.375，λ = 0.359。在所得到的弹性网络模型中，各个通路（图1）的贡献比例（即相对重要性）如图2所示。如图3所示，在模型的预测结果中，训练集的预测值随着时间年龄的增加而增加，相关系数r = 0.58。在与训练集组成相近的评估集1（均为健康人群）中，预测值与实际年龄达到了相似的相关系数（r = 0.57），表明模型基本不存在过拟合现象。使用2.5%和97.5%分位数线确定每个实际年龄预测的95% 置信区间，构建基于健康人衰老模式的代谢组衰老时钟。如图5所示，在训练集中，有2.6% 的样本低于2.5%分位数回归线，归类为低老化；有2.5% 的样本高于97.5%分位数回归线归类为超老化。与训练集中的情况类似，在评估集1中有3.4%的样本类别为低老化，有2.3%的样本类别为超老化，并且在训练集的置信区间周围分布大致平衡。

如图3所示，由各个分期的结直肠癌样本组成的评估集2在训练集定义的2.5%分位数回归线以下的样本明显更多。如图4所示，在剔除50%分位数回归线定义的中位线之后，评估集1和评估集2预测值的残差验证了这一趋势。如图5所示，在所有结直肠癌分期(包括APL)中，结直肠癌I期样本的低老化程度最严重，达到训练集中低老化样本比例的10倍以上，以及由健康人组成的评估集1中低老化样本比例的8倍以上。

代谢年龄预测模型对CRC低老化趋势的解释：

为了解释CRC人群的低老化趋势，本实施例鉴定出代谢组时钟模型中存在两个关键的代谢通路（相对重要性位于前50%），其中有多个代谢物的血清浓度在健康人群中与年龄高度相关（|r|≥0.3），而这种相关性在CRC人群中被不同程度地破坏:

(i)五碳糖和葡萄糖酸酯的相互转化（map00040）通路，包括9种与年龄相关的代谢产物：L-半乳糖酸(C15930)、D-甘露酸(C00514)、L-葡萄糖酸(C00800)和D-阿卓糖酸(C00817)、D-葡萄糖酸(C00257)、木糖醇(C00379)、D-阿拉伯糖醇(C01904)、L-阿拉伯糖醇(C00532)和利比醇(C00474);

(ii) 柠檬酸循环（map00020）通路，包括4种与年龄相关的代谢产物：草酰乙酸(C00036)、柠檬酸(C00158)、异柠檬酸(C00311)和草酰琥珀酸(C05379)。

在CRC所有分期中，“柠檬酸循环”通路的相关代谢物与年龄的相关性均呈现显著降低（其中至少有3个代谢物与年龄的相关性|r|<0.3），从而导致CRC样本整体呈现低老化趋势；而仅在CRC的早期（即APL和I期），“五碳糖和葡萄糖酸酯的相互转化”通路的相关代谢物与年龄相关性呈现显著降低（其中至少有7个代谢物与年龄的相关性|r|<0.3），从而导致CRC早期样本的低老化趋势比其它分期更加明显。

基于模型低老化分类的结直肠癌诊断效果：

有鉴于结直肠癌样本在代谢组中呈现明显的低老化现象，可以使用代谢组衰老时钟的低老化分类进行结直肠癌诊断。按照大众人群中的结直肠癌发病率（含CRC - APL和CRC（所有分期）两种）对评估集（评估集1和评估集2的并集）中的相应样本进行自举抽样后，将低老化样本视为结直肠癌阳性，得到CRC - APL的阳性预测值（PPV）为 41.45 (37.35%-45.68%) 和 CRC（所有分期）的PPV为 4.37% (2.64%-7.16%)，括号中的数值为PPV的95%置信区间。相比于现有的两种结直肠癌体外诊断方法（Cologuard和Septin 9甲基化血液检测），本诊断方法显示出更高的 PPV，可以对现有体外诊断方法形成有效的补充：Cologuard方法在CRC–APL中的PPV约为20.0%，在CRC（所有分期）的PPV约为3.7%（数据来源：美国药监局认证P130017）；Septin 9血液甲基化血液检测方法在CRC – APL中的PPV约为9.5%，在CRC（所有分期）的PPV约为2.3%（数据来源：美国药监局认证P130001）。通过对分子年龄偏移值的分组，可以界定样本是否位于极端值区域内，进而有效预示待测样本的疾病风险。如果将延缓衰老（hypo）组的样本定义为具有CRC高风险人群，则本研究的分子模型能够达到比血液检测Septin 9甲基化更好的阳性预测率（即PPV，括号中为95%置信区间）。

结直肠癌人群在精准的衰老分类中下存在明显的低老化趋势。仔细研究与结直肠癌的衰老代谢谱及其相关的代谢通路，不仅可以提高结直肠癌诊断的PPV，从而更有效地找出阳性诊断中真正患有结直肠癌的病人，还可以通过所发现的代谢通路为结直肠癌的病理生理学提供新的见解。

本领域技术人员会理解，本发明不限于这里的实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims

1.一种代谢年龄预测模型，其特征在于：所述模型的数据集分为训练集及评估集；

所述评估集，数据范围为未知人群,用于结直肠癌诊断;

通过将评估集的代谢年龄与训练集的代谢年龄进行比对,建立模型。

2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于：

代谢年龄预测模型的训练集的组成和构建包括如下步骤：

(1)采集训练集的样本，并记录样本的实际年龄；

3.根据权利要求2所述的模型，其特征在于：所述训练集以3折交叉验证方式训练。

4.根据权利要求2所述的模型，其特征在于：所述衰老分类采用分位数回归方法，自上而下根据每个实际年龄中各个代谢年龄的97.5%, 50%和2.5%分位数拟合得到，位于上方分位数线以上的样本定义为过度衰老组，位于下方分位数线以下的样本定义为延缓衰老组，其余样本为正常衰老组。