CN112029854A - 一种预测结肠癌预后的标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因技术和医学领域，具体涉及一种预测结肠癌预后的标志物及其应用。该预测结肠癌预后的标志物包括自噬相关的lncRNA和/或自噬相关的mRNA标志物，所述自噬相关的lncRNA为CASC9、PCAT6、AP006621.2、GS1‑124K5.4、MIR4435‑2HG、AL354993.2、AC048344.4、AC010973.2、AL590483.1、AL137782.1、STAG3L5P‑PVRIG2P‑PILRB、LINC00513、SNHG16和AP001554.1，所述自噬相关的mRNA为GRID1、DAPK1、RAB7A、PELP1、ULK3和WIPI2。该预测结肠癌预后的标志物可用于预测结肠癌预后风险和生存率，为病人预后及健康管理提供指导依据，实现个体化精准治疗。
Description
技术领域
本发明属于基因技术和医学领域，具体涉及一种预测结肠癌预后的标志物及其应用。
背景技术
结肠癌是一种最常见的恶性上皮细胞肿瘤，是世界范围内死亡的主要原因之一。尽管在诊 断和治疗策略方面取得了进展，但结肠癌患者5年生存率仍然低于50％。因此，研究结肠癌的 发病的基本分子机制，确定分子生物标志物，对结肠癌患者的生存评估仍然势在必行。
自噬是肌体内维持代谢平衡和细胞在代谢压力(如能量缺乏和饥饿)以及生理和病理条件(如 衰老、凋亡和癌症)下的主要分解代谢过程。自噬作用复杂，并且在各种类型的癌症中有所不 同，可发挥抑癌或促癌的作用。因此，使其成为潜在的癌症治疗靶点。近年来，许多研究都 试图通过研究自噬路径寻找新的治疗癌症的潜在治疗靶点。此外，有研究证明自噬药物通过促 进癌细胞自噬性死亡(II型细胞死亡)抑制结肠癌的进展。例如，NVP-BEZ235处于第I/II阶 段临床试验中，可同时诱导结肠癌细胞凋亡和自噬。然而，先前的研究大多集中在研究自噬在 肿瘤形成中的作用，包括采用细胞系或动物模型中数量有限的自噬相关基因。因此，自噬相关 多基因系统性表达模式的预后价值尚未被评估。
基因分子标志物，是指基于一组基因的表达，通过机器学习建立数学模型，用于预测临床 上的具体目标如预后生存期率或转移率等。近年来基因表达检测手段已经相当成熟，包括高通 量的RNA测序，以及相对低通量的实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术等。但是如何找 到一组优化的自噬相关并与预后总生存率相关的基因组合，并且整合临床信息，病理诊断结果 构建的数学模型，并能达到良好效果，未见报导。
Long non-coding RNAs(lncRNAs),参与多种生物过程，占了非编码RNA总量的80％。参 与多种类型的癌症，以多种方式调控肿瘤的发生和发展。现有的研究表明，lncRNAs是调节 自噬和肿瘤进展的重要调节因子。最近的报告也指出，lncRNAs可以通过调控自噬，影响结肠 癌患者的生存和肿瘤进程。然而，现有技术中，还没有自噬相关lncRNA和mRNA组合的风 险评分模型及在此基础上进一步结合临床信息的诺莫图，通过对与预后相关的RNA表达水平 的检测和临床信息采集，预测结肠癌患者的生存。
近年来，使用列线图构建预测模型受到越来越多的关注，通过综合考虑多种预后指标，以 直观的图表来量化风险。已有多项研究报道，列线图预测模型对于乳腺癌、前列腺癌、胃癌和 非小细胞肺癌的预测预后能力较传统TNM分期有所提高。然而，目前尚缺乏有效实用的结肠 癌术后患者的列线图预测模型。王峰报导构建了基于临床独立预后指标的线列图用于结肠癌预 后风险分层，可能原因为缺乏必要的手术相关信息以及重要的实验室基因检查结果但并未结合 非编码RNA和编码mRNA的表达变化等基因水平的独立预后指标，构建的列线图一致性指 数C-index为0.768。但是由于RNA表达比蛋白质表达及其他临床预后特征出现更早，因此采 用RNA作为风险marker可以提高预测准确性，及早干预，改善预后。
此外，有研究报导采用某一个或几个单一类别的RNA作为结肠癌预后的标志物(例如， 专利文献CN105463070A公开了采用一种lncRNA-UCA1作为结肠癌诊断/预后的标志物,另有 文献《Beclin1和Livin在结肠癌及结肠腺瘤组织中的表达及其意义》公开mRNABeclin1和Livin 联合检测有助于结肠癌的预后判断)，这些又只是基于RNA水平与临床预后的关联，恰恰忽 略了临床病理及危险因素。由于结肠癌患者个体预后差异巨大，因此构建包括非编码RNA编 码RNA并结合临床风险因素的列线图，有助于明确个体患者危险分层，并指导治疗方式的选 择。
发明内容
本发明提供一种预测结肠癌预后的标志物，以解决上述技术问题。该标志物对结肠癌5 年生存率的预测准确率高于第7版AJCC-TNM分期系统(训练组C-index＝0.729，内部验证组 C-index＝0.720，外部验证组C-index＝0.735)。
本发明的第二目的在于提供了所述标志物的应用。
本发明的第三目的在于提供一种预测结肠癌预后风险的模型。
本发明的第四目的在于提供一种预测结肠癌预后风险的系统。
本发明的第五目的在于提供一种结肠癌生存率预测模型。
本发明的第六目的在于提供一种结肠癌生存率预测系统。
本发明的第七目的在于提供一种用于检测所述标志物的RT–qPCR引物组。
本发明的目的还在于提供了一种试剂盒。
本发明的目的还在于提供了一种检测结肠癌自噬相关基因的PCR芯片。
本发明的预测结肠癌预后的标志物采用如下技术方案：一种预测结肠癌预后的标志 物，所述标志物包括自噬相关的lncRNA和/或自噬相关的mRNA标志物，所述自噬相关 的lncRNA为CASC9、PCAT6、AP006621.2、GS1-124K5.4、MIR4435-2HG、AL354993.2、AC048344.4、AC010973.2、AL590483.1AL137782.1,STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB, LINC00513,SNHG16和AP001554.1，所述自噬相关的mRNA为GRID1、DAPK1、 RAB7A、PELP1、ULK3和WIPI2。
本发明的预测结肠癌预后的标志物的应用采用如下技术方案：如上所述的预测结肠 癌预后的标志物在结肠癌预后中的应用；所述应用包括但不限于评价或预测预后风险、预 测生存率、制定治疗/用药方案、构建预测结肠癌预后风险的模型、构建预测结肠癌生存率 的模型、制备用于预测结肠癌预后风险的检测试剂或装置、制备预测结肠癌生存率的检测 试剂或装置中的任意一种或几种的组合。其中，所述试剂包括但不限于用于检测本发明的 标志物的引物、PCR芯片或其他必要的试剂中的任意一种或几种的组合，试剂也可以试剂 盒的形式存在；所述装置可为电子设备，其内配置有可用于计算预测结肠癌预后风险的模 型和/或预测结肠癌生存率(1-10年或1-5年)的模型，以便于对结肠癌的预后风险或生存 率进行预测；装置还可以可见载体(例如，将结肠癌预后风险模型的公式和/或预测结肠癌 生存率的诺莫图印刷与纸质或其他材质的卡片上等)的形式存在，该可见载体上显示有预 测结肠癌预后风险的模型的计算公式或/和结肠癌生存率预测模型的诺莫图等。所述装置和 试剂可分别或同时存在，以便于使用者可以更便捷的获取相应结果。
本发明的预测结肠癌预后风险的模型采用如下技术方案：一种预测结肠癌预后风险的 模型，所述模型包括自噬相关mRNA风险预测模型、自噬相关lncRNA风险预测模型和/或结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型；所述自噬相关mRNA 风险预测模型公式＝(0.524×expression level of UKL3)+(1.022×expression level ofGRID1) +(0.254×expression level of DAPK1)+(0.410×expression level of PELP1)+(0.608×expression level of WIP2)+(1.097×expression level of RAB7A)；所述自噬相关lncRNA风险预测模型公 式＝(0.183×expression level of CASC9)+(0.334×expression level of PCAT6)+(0.348× expression level of AP006621.2)+(0.409×expression level of GS1-124K5.4)+(0.651× expression level of MIR4435-2HG)+(0.838×expression level of AL354993.2)+(0.881×expression level ofAC048344.4)+(1.145×expression level of AC010973.2)+(-0.882× expressionlevel of AL590483.1)+(-0.875×expression level of AL137782.1)+(-0.688×expression level of STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(-0.665×expression level ofLINC00513) +(-0.663×expression level of SNHG16)+(-0.573×expression level ofAP001554.1)；结合所述 自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式 ＝(-0.361×expression level of AP001554.1)+(0.150×expression level of AP006621.2)+(0.023× expression level of ULK3)+(0.564×expression level of AL354993.2)+(0.379×expression level of MIR4435-2HG)+(×-0.025expression level of GRID1)+(0.130×expression level of PCAT6)+ (-0.591×expression level of STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(0.021×expression level of CAS C9)+(-0.169×expression levelof LINC00513)+(0.015×expression level of DAPK1)+(-0.125×e xpression levelof SNHG16)+(0.769×expression level of AC048344.4)+(0.029×expression lev elof GS1-124K5.4)+(-0.005×expression level of PELP1)+(0.023×expression levelof WIPI2)+ (-1.118×expression level of AL137782.1)+(0.814×expression levelof AC010973.2)+(0.01×e xpression level of RAB7A)+(-0.641×expression levelof AL590483.1)。
本发明的预测结肠癌预后风险的系统采用如下技术方案：一种预测结肠癌预后风险 的系统，所述预测结肠癌预后风险的系统包括数据输入模块、模型计算模块和结果输出模 块；
所述数据输入模块用于将结肠癌病人的自噬相关基因表达值的结果输入模型计算模 块，所述自噬相关基因包括所述自噬相关mRNA或/和lncRNAs；
所述模型计算模块根据所述自噬相关基因表达值和如上所述的结肠癌风险预测模型 中的自噬相关mRNA风险模型公式、自噬相关lncRNA风险模型公式和/或结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式进行计算；
所述结果输出模块用于根据结肠癌病人自噬相关mRNA和/或lncRNA的风险值来预测 结肠癌病人的预后风险；优选的，按照所述自噬相关mRNA风险模型公式计算得到的 结果≥0.954时，判定结肠癌预后为高风险；按照所述自噬相关mRNA风险模型公式计 算得到的结果<0.954时，判定结肠癌预后为低风险；优选的，按照所述自噬相关 lncRNAs风险模型公式计算得到的结果≥1.009时，判定结肠癌预后为高风险；按照 所述自噬相关lncRNAs风险模型公式计算得到的结果<1.009时，判定结肠癌预后为低 风险；按照所述结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式计 算得到的结果≥1.04时，判定结肠癌预后为高风险；按照所述自噬相关mRNA风险模 型公式计算得到的结果<1.04时，判定结肠癌预后为低风险。
本发明的结肠癌生存率预测模型采用如下技术方案：一种结肠癌生存率预测模型，所 述结肠癌生产率预测模型通过以根据上所述的预测结肠癌预后风险的模型计算得到的风 险值、年龄和肿瘤分期为影响因素构建诺莫图得到。构建得到的诺莫图具体如诺莫图1(依 据所述8个自噬相关mRNA标志物，通过构建COX模型得到，详见说明书附图图5)、 诺莫图2(依据所述14个自噬相关lncRNA标志物，通过构建COX模型得到，详见说明 书附图图6)和诺莫图3(依据所述8个自噬相关mRNA和14个自噬相关lncRNA标志物， 通过构建COX模型得到，详见说明书附图图7)。
本发明的结肠癌生存率预测系统采用如下技术方案：一种结肠癌生存率预测系统，所 述结肠癌生存率预测系统根据如上所述的结肠癌生存率预测模型构建得到，所述结肠癌生 存率预测系统的形式包括但不限于绘制有所述诺莫图的可见载体、网页计算器或小程序中 的任意一种或几种的组合。
本发明的用于检测如上所述的标志物的RT–qPCR引物组采用如下技术方案：用于检 测如上所述的标志物的RT–qPCR引物组，所述引物组包括下述引物中的至少一种：检测GRID1的上游引物如SEQ ID NO.1所示，检测GRID1的下游引物如SEQ ID NO.2所示； 检测DAPK1的上游引物如SEQ ID NO.3所示，检测DAPK1的下游引物如SEQ ID NO.4 所示；检测RAB7A的上游引物如SEQ ID NO.5所示，检测RAB7A的下游引物如SEQ ID NO.6所示；检测PELP1的上游引物如SEQ ID NO.7所示，检测PELP1的下游引物如SEQ ID NO.8所示；检测ULK3的上游引物如SEQ ID NO.9所示，检测ULK3的下游引物如SEQ ID NO.10所示；检测WIPI2的上游引物如SEQ ID NO.11所示，检测WIPI2的下游引物如 SEQ ID NO.12所示；检测AL354993.2的上游引物如SEQ ID NO.13所示，检测AL354993.2 的下游引物如SEQ IDNO.14所示；检测AC048344.4的上游引物如SEQ ID NO.15所示， 检测AC048344.4的下游引物如SEQ ID NO.16所示；检测CASC9的上游引物如SEQ ID NO.17所示，检测CASC9的下游引物如SEQ ID NO.18所示；检测AP006621.2的上游引 物如SEQ ID NO.19所示，检测AP006621.2的下游引物如SEQ ID NO.20所示；检测 AC010973.2的上游引物如SEQ IDNO.21所示，检测AC010973.2的下游引物如SEQ ID NO.22所示；检测GS1-124K5.4的上游引物如SEQ ID NO.23所示，检测GRID1的下游引 物如SEQ ID NO.24所示；检测MIR4435-2HG的上游引物如SEQ ID NO.25所示，检测 MIR4435-2HG的下游引物如SEQ ID NO.26所示；检测PCAT6的上游引物如SEQ ID NO.27所示，检测PCAT6的下游引物如SEQ ID NO.28所示；检测AL590483.1的上游引 物如SEQ ID NO.29所示，检测AL590483.1的下游引物如SEQ IDNO.30所示；检测 AL137782.1的上游引物如SEQ ID NO.31所示，检测AL137782.1的下游引物如SEQ ID NO.32所示；检测STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB的上游引物如SEQ ID NO.33所示，检测 STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB的下游引物如SEQ ID NO.34所示；检测LINC00513的上游引物如SEQ ID NO.35所示，检测LINC00513的下游引物如SEQ ID NO.36所示；检测 SNHG16的上游引物如SEQ ID NO.37所示，检测SNHG16的下游引物如SEQ ID NO.38
所示；检测AP001554.1的上游引物如SEQ ID NO.39所示，检测AP001554.1的下游引物 如SEQ ID NO.40所示；检测GAPDH的上游引物如SEQ ID NO.41所示，检测GAPDH的 下游引物如SEQ ID NO.42所示；检测GDC的上游引物如SEQ ID NO.43所示，检测GDC 的下游引物如SEQ ID NO.44所示；检测RTC的上游引物如SEQ ID NO.45所示，检测RTC 的下游引物如SEQ ID NO.46所示。其中，GAPDH为内参基因；检测GDC基因的引物可 用于检测样品中是否存在DNA污染；检测RTC的引物可用于检测反转录效率。
本发明的试剂盒采用如下技术方案：一种试剂盒(检测结肠癌自噬基因的一般荧光定 量PCR试剂盒)，所述试剂盒包括用于检测如上所述的标志物的试剂、如上所述的预测结肠癌预后风险的模型、如上所述的预测结肠癌预后风险的系统、如上所述的结肠癌生存率预测模型、如上所述的结肠癌生存率预测系统和如上所述的引物组中的任意一种或几种的组合。
本发明的检测结肠癌自噬相关基因的PCR芯片采用如下技术方案：所述PCR芯片包含如上所述的引物组。
本发明的有益效果是：本发明的预测结肠癌预后的标志物筛选自自噬相关的RNA标签， 并进一步筛选预后相关的RNA标签，找到两组与预后相关的mRNA和lncRNAs标志物，将 所述标志物用于构建风险模型，然后结合临床信息，构建预测结肠癌的生存率的诺莫模型，用 于预测结肠癌患者的预后和死亡风险。通过所述风险模型和预测结肠癌生存率的诺莫模型，确 定癌症患者治疗方案，为病人预后及健康管理提供指导依据，实现个体化精准治疗。
本发明提供了自噬相关基因在结直肠癌预后的一般荧光qPCR试剂盒和PCR芯片试剂盒 等系统中的应用。结合自噬相关基因，从转录组数据分别找到两组可以稳定预测结肠癌预后的 特征基因；两组风险评分系统可以结合使用，也可以分别根据病人需求单独使用。采用本发明 系统可以很好地预测结肠癌预后和预测结肠癌病人的风险后针对性治疗，避免过度治疗；本发 明还进行了单变量及多变量分析，证明使用自噬风险模型确实可以独立预测结肠癌病人的预后 风险。
本发明构建得到的诺莫图1(基于本发明的自噬相关mRNA的风险预测模型)5年生存率 C-index为0.816、诺莫图2(基于本发明的自噬相关lncRNA的风险预测模型)5年生存率C-index 为0.826、诺莫图3(基于本发明的自噬相关mRNA的风险预测模型和自噬相关lncRNA的风险 预测模型)5年生存率C-index为0.803，均大于第7版AJCC-TNM分期系统(训练组 C-index＝0.729，内部验证组C-index＝0.720，外部验证组C-index＝0.735)，本发明的结肠癌生 存率预测模型的准确率更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描 述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图 获得其他的附图。
图1A为差异表达的自噬相关mRNA的热图；图1B为自噬相关mRNA预后的森林图；
图2A为差异表达的自噬相关lncRNA的热图；图2B为自噬相关lncRNA预后的森林图；
图3为基于自噬相关的mRNA风险评分系统的建立及在预测直肠癌患者预后方面的应用， 具体为高风险组和低风险组的KM生存曲线；
图4为基于自噬相关lncRNA的风险评分系统的构建及在预测直肠癌患者预后方面的应 用，具体为TCGA数据集中的高风险或低风险组的Kaplan Meier生存曲线；
图5为基于本发明的自噬相关mRNA风险预测公式、年龄和肿瘤分期构建得到的用于结 肠癌患者生存率的诺莫图(诺莫图1)；
图6为基于本发明的自噬相关lncRNA风险预测公式、年龄和肿瘤分期构建得到的用于结 肠癌患者生存率的诺莫图(诺莫图2)；
图7为基于本发明的自噬相关mRNA和lncRNA风险预测公式、年龄和肿瘤分期构建得 到的用于结肠癌患者生存率的诺莫图(诺莫图3)；
图8为诺莫图1的校准图；
图9为诺莫图2的校准图；
图10为诺莫图3的校准图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实 施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本 发明保护的范围。
实施例1筛选用于结直肠癌预后预测的自噬相关基因
使用公开的TCGA数据集COAD患者样品(41例正常样品和473例肿瘤样品)的基因表达数 据集和临床信息。验证组使用了来自GEO数据集GSE72970的124例结肠癌样本。自噬基因从 人类自噬数据库HADb筛选获得231个差异表达的自噬基因。在R软件中使用单变量Cox回归 分析来评估自噬相关RNA是否与OS相关。筛选|log2FC|>1和p<0.05的mRNA，|log2FC|>2.5和p<0.01的lncRNA作为预后候选用于建模基因。危险比(HR)<1的RNA被定义为抑 癌基因，而HR>1的RNA被定义为风险基因。
筛选结果：差异表达的自噬相关的mRNA热图如说明书附图图1A所示、自噬相关mRNA 的预后的森林图如图1B所示；差异表达的自噬相关的lncRNA的热图如说明书附图图2A所 示，自噬相关lncRNA预后的森林图如说明书附图图2B所示。
实施例2建立自噬相关的预后风险模型并使用风险模型对结肠癌患者预后风险进行预 测
使用多元Cox回归对预后相关的自噬mRNA和lncRNA分别构建风险模型。模型通过合并 每个特定RNA的表达值后，分析每个患者的风险评分，并通过其估计的回归系数加权。根据危 险度评分公式，以危险度中位数为分界点，将患者分为低危组和高危组。通过KM评估两组之 间的生存差异，并使用对数秩统计方法进行比较。多变量Cox回归分析和分层分析用于检验风 险评分在预测患者预后中的作用。
自噬相关mRNA风险模型(模型1)构建时选用TCGA结肠癌数据集(colon cancer；n＝514: 41normal samples and 473tumor samples)作为训练集，构建模型1；再通过GEO的数据集 (GSE72970)作为验证集，ROC分析判断风险模型1的预测准确性。自噬相关lncRNA风险模 型(模型2)构建时选用TCGA结肠癌数据集(colon cancer；n＝514:41normal samplesand 473 tumor samples)作为训练集，构建模型2，通过选用TCGA(colon cancer primarysite rectosigmoid juction；n＝67)数据作为验证集，ROC分析判断风险模型2的预测准确性。结合所述自噬相 关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型构建时选用TCGA结肠癌数据集(colon cancer；n＝514:41normal samples and 473tumor samples)作为训练集，构建模型3；再通过选用 TCGA(colon cancer primary site rectosigmoid juction；n＝67)数据作为验证集，ROC分析判断 风险模型3的预测准确性。
本发明的预测结肠癌风险的模型具体如下：
模型1：自噬相关mRNA风险模型公式＝(0.524×expression level of UKL3) +(1.022×expression level of GRID1)+(0.254×expression level of DAPK1)+(0.410×expression level of PELP1)+(0.608×expression level of WIP2)+(1.097×expression level of RAB7A).
模型2：自噬相关lncRNA风险模型公式＝(0.183×expression level of CASC9)+(0.334× expression level of PCAT6)+(0.348×expression level of AP006621.2)+(0.409×expression level of GS1-124K5.4)+(0.651×expression level of MIR4435-2HG)+(0.838×expression level of AL354993.2)+(0.881×expression level ofAC048344.4)+(1.145×expression level of AC010973.2)+(-0.882×expression levelof AL590483.1)+(-0.875×expression level of AL137782.1)+(-0.688×expressionlevel of STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(-0.665×expression level of LINC00513)+(-0.663×expression level of SNHG16)+(-0.573×expression level of AP001554.1)。
模型3：结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式 ＝(-0.361×expression level of AP001554.1)+(0.150×expression level ofAP006621.2)+(0.023×expr ession level of ULK3)+(0.564×expression level ofAL354993.2)+(0.379×expression level of MIR4 435-2HG)+(×-0.025expressionlevel of GRID1)+(0.130×expression level of PCAT6)+(-0.591×exp ression levelof STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(0.021×expression level of CASC9)+(-0.169×expression level of LINC00513)+(0.015×expression level of DAPK1)+(-0.125×expression level of SN HG16)+(0.769×expression level of AC048344.4)+(0.029×expression level of GS1-124K5.4)+(-0. 005×expression level of PELP1)+(0.023×expression level of WIPI2)+(-1.118×expression level of AL137782.1)+(0.814×expression level of AC010973.2)+(0.01×expression level of RAB7A)+(-0.6 41×expression level of AL590483.1)。
本发明的预测结肠癌预后风险的系统，其包括：
数据输入模块，用于将结肠癌病人的自噬相关基因表达值的结果输入模型计算模块，所 述自噬相关基因包括mRNA和/或lncRNAs的表达值；
模型计算模块：包括构建Cox风险模型，用于根据结肠癌病人自噬相关基因表达值的结 果以及多元Cox风险模型计算病人自噬风险值，所述风险值的计算公式Risk score采用加权相 乘法：F(x)＝Sum[Coeffcient(模型中各基因权重系数)×exp(模型中各lncRNA表达值)]。其中， 模型计算模块具体可为下述计算模块1或/和计算模块2
计算模块1：自噬相关mRNA风险模型公式＝(0.524×expression level of UKL3)+(1.022×expression level of GRID1)+(0.254×expression level of DAPK1)+(0.410×expression level of PELP1)+(0.608×expression level of WIP2)+(1.097×expression level of RAB7A).
计算模块2：自噬相关lncRNA风险模型公式＝(0.183×expression level ofCASC9)+(0.334 ×expression level of PCAT6)+(0.348×expression level ofAP006621.2)+(0.409×expression level of GS1-124K5.4)+(0.651×expression levelof MIR4435-2HG)+(0.838×expression level of AL354993.2)+(0.881×expressionlevel of AC048344.4)+(1.145×expression level of AC010973.2)+(-0.882×expression level of AL590483.1)+(-0.875×expression level of AL137782.1)+(-0.688×expression level of STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(-0.665×expression levelof LINC00513)+(-0.663×expression level of SNHG16)+(-0.573×expression levelof AP001554.1)。
计算模块3：结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式 ＝(-0.361×expression level of AP001554.1)+(0.150×expression level ofAP006621.2)+(0.023×expr ession level of ULK3)+(0.564×expression level ofAL354993.2)+(0.379×expression level of MIR4 435-2HG)+(×-0.025expressionlevel of GRID1)+(0.130×expression level of PCAT6)+(-0.591×exp ression levelof STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(0.021×expression level of CASC9)+(-0.169×expression level of LINC00513)+(0.015×expression level of DAPK1)+(-0.125×expression level of SN HG16)+(0.769×expression level of AC048344.4)+(0.029×expression level of GS1-124K5.4)+(-0. 005×expression level of PELP1)+(0.023×expression level of WIPI2)+(-1.118×expression level of AL137782.1)+(0.814×expression level of AC010973.2)+(0.01×expression level of RAB7A)+(-0.6 41×expression level of AL590483.1)。
结果输出模块：
结果输出模块1:用于根据结肠癌病人自噬相关mRNA表达量计算风险值，判断病人治疗后 的预后风险；当COAD病人风险值≥0.954时，病人为高风险，生存会显著差，需要更多的临 床关注和更好的临床管理；当COAD病人风险值＜0.954时，病人为低风险，生存较好，可以 用更温和的治疗方案，避免过度治疗。
结果输出模块2:用于根据结肠癌病人自噬lncRNAs表达量计算风险值，判断病人治疗后 的预后风险；当COAD病人风险值≥1.009时，病人为高风险，生存会显著差，需要更多的临 床关注和更好的临床管理；当COAD病人风险值＜1.009时，病人为低风险，生存较好，可以 用更温和的治疗方案，避免过度治疗。
结果输出模块3：用于根据结肠癌病人自噬lncRNAs和mRNA表达量计算风险值，判断病 人治疗后的预后风险；当COAD病人风险值≥1.04时，病人为高风险，生存会显著差，需要更 多的临床关注和更好的临床管理；当COAD病人风险值＜1.04时，病人为低风险，生存较好， 可以用更温和的治疗方案，避免过度治疗。
备注：上述基因表达值采用2-ΔΔCt法行数据统计，计算各个基因的相对表达量。
实施例3建立基于风险模型的诺莫图(通过构建COX模型得到)
构建结合mRNA的风险评分系统，年龄和肿瘤分期的诺莫图1；
构建结合14条lncRNA的风险评分系统，年龄和肿瘤分期的诺莫图2；
构建结合6条mRNA、14条lncRNA的风险评分系统及年龄和肿瘤分期的诺莫图3；
根据临床检测结果，列出各项分值(诺莫图1-3中的“risk score”分别按照上述模型 1-3的公式计算得到)，以预测每位患者的1年，3年，5年或10年的生存率。
实施例4诺莫图的特异性和稳定性评价
图8-10分别对应本发明的诺莫图1-3的校准图；由图8可知，诺莫图1的5年生存率C-index为0.816，由图9可知，诺莫图2的5年生存率C-index为0.826；由图10可知，诺 莫图3的5年生存率C-index为0.803。
实施例5通过检测本发明的预测结肠癌预后标志物的表达量，并依据本发明的预测结肠 癌预后风险的模型和结肠癌生存率预测模型来预测结肠癌患者的预后风险和生存率
5.1检测自噬相关的mRNA和/或lncRNA
采用RT-qPCR方法进行检测，所采用的引物组如下表1所示：
5.2具体检测方法如下：
5.2.1提取样品RNA：采用trizol法提取
5.2.2用紫外吸收法测定RNA的浓度和纯度
用NanoDrop ND-1000型分光光度计去检测RNA浓度和纯度，首先使用DEPC(焦碳酸二 乙酯)水进行背景调零，搽拭干后进行样本测定，歩骤如下：
(1)滴加RNA样品至测量基座的表面；
(2)滴加的RNA样品会自动在上下基座之间形成液柱并由仪器自动完成测定，然后在电脑中自 动生成相关的各种参数文件；
(3)测定结束后，RNA浓度的计算方法：260nm处读值为1表示每μL样品中有40ngRNA；样 品RNA浓度计算公式为：260nm处读值×40ng/μLRNA；纯度判定方法：吸光度OD260/OD280 比值法是一种普遍采用的RNA纯度检测方法，纯的RNA浓度其OD260/OD280的比值应介于 1.8～2.1，越接近2.0纯度越高；OD260/OD280的比值小于1.8或是大于2.1，说明RNA已经 被污染，OD(optical density，光密度)；
(4)用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下个样品的测试。
5.2.3变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性
(1)凝胶制备：称取琼脂糖1g，加水72mL，微波炉中加热溶解，直至琼脂糖溶液澄清，无 细小颗粒物，并降温至60℃，加入10×MOPS电泳缓冲液10mL和37％甲醛溶液18mL，混合 均匀；
(2)配制10×MOPS电泳缓冲液：0.4M MOPS，pH70.1M乙酸钠，0.01M EDTA；
(3)胶板制备：准备好干净的凝胶板和电泳槽，将冷却好的琼脂糖凝胶液倒入凝胶板，预加 样孔至少可以加入25μL溶液，室温下静置，直至凝胶完全凝固，垂直轻拔子，将凝胶板放入 电泳槽内，添加足量10×MOPS电泳缓冲液至没过胶板表面2mm左右；
(4)RNA样品准备：取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至 终度为10μg/mL，加热至70℃孵育15min使样品变性；
(5)加样：将样品加入胶板的样品小槽内，加样时避免碰坏样品孔周围的凝胶面；
(6)电泳：5-6V/cni电压下电泳，当溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm处时，停止电泳；
(7)紫外透射光下观察并拍照，若最大的两条条带28s RNA和18s RNA的亮度大致比为2:1 时，说明RNA的完整性较好，未出现降解现象。
5.2.4 RNA的逆转录
第一链cDNA的合成：逆转录的反应体系如表2。样品充分混匀后短离心使液体至于管底， PCR仪中进行第一步反应，65℃5min，4℃降温，42℃60min，70℃15min，4℃保存。合成的第一条链cDNA取出后，-20℃长期保存备用。
表2逆转录反应体系
表Q-PCR反应体系(10μL)
5.2.5荧光定量PCR分析相关RNA的表达差异
U6基因做内参，进行PCR扩增检测模板质量，反应体系见表3。
表3q-PCR反应体系(10μL)
一般荧光定量PCR反应检测仪采用Bio-Rad公司的CFX96系统，反应条件为：95℃预变性1min，95℃变性10s，65℃退火30s，重复40个循环，72℃延伸30s。
所述PCR芯片的PCR反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s， 重复40个循环；65℃1min；95℃15s。
基因表达值采用2-ΔΔCt法行数据统计，计算各个基因的相对表达量。
5.3预后风险或生产率预测：将得到的基因表达值代入上述实施例2的模型1-3中的任意 一项，即可得到结肠癌患者的预后风险值；或将得到的基因表达值通过实施例2中的数据输入 模块，输入预测结肠癌预后风险的系统，即可根据结果输出模块输出的结果，得到结肠癌病人 的预后风险预测结果。根据预后风险值和/或预后风险预测结果，为患者提供更多的临床关注 和临床管理或采用更温和的治疗方案，避免过度治疗。
将上述计算得到的预后风险值(对应诺莫图中的risk score)、患者年龄(对应诺莫图中的 age)和肿瘤分期(对应诺莫图中的stage)分别对应到相应的诺莫图中，即可计算得到患者1 年、3年、5年和/或10年生存率。
此外，根据上述表1中公开的引物组，本领域技术人员知晓也可以通过制备PCR芯片来 对样品中本发明的自噬相关mRNA和/或lncRNA标志物的基因表达值，进而用于预测结肠癌 患者的预后风险或生存率预测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种预测结肠癌预后的标志物及其应用
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagcgttgtg gacttca 17
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagcctgtat cctgttca 18
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catccctgga tcaagcct 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgcttctgg caacactc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cattccctac tttgagacca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acagctccac ctccgttt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgccctctat ccaccttga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttggtccga accgtgct 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccacagcatg ggcacttat 19
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<212> DNA
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tgcagggagg acagacagc 19
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gcatacgatc agggagacg 19
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<212> DNA
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gccagtgccg ctaaagga 18
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cacaatcgtg taggagtt 18
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cattcatacc acattcaag 19
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ggtagagtta gcgtagcc 18
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aggtgcttga gtgagtct 18
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<212> DNA
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gtaggaccct ctgagcca 18
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<212> DNA
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ttcttgccag gtgttgtt 18
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<212> DNA
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tgaagcacag acgagttt 18
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ccccagacct aatgaatc 18
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cgaggattga agattgtg 18
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ctcatcatta gaccaggg 18
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ctgtgatgcc gaaggacc 18
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aaaggctaac tcacttggac ac 22
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tgctgccact aatttgcc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agacccagat gccgtttt 18
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<212> DNA
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ctttccctcg tcctctgcg 19
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<212> DNA
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caagcgtttg tgggtttca 19
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<212> DNA
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gctgctcaga tgcgattg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgttgtttt gccgaccc 18
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<212> DNA
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gcacccatag cctgtaac 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cactgataat gctcgtct 18
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttgactgt ggctacctcc t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtgttgata gtggcataag g 21
<210> 35
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cttcctagat gacgccttgc 20
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gtgcccttcc gttgtgag 18
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atactctgtt ggaagagcct aa 22
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aagcaatggt tgtgggtg 18
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ggacggaata atggatagag 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggaagcagg taagtgaat 19
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ctggtgaccc gtgctgctt 19
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ttgccgcctt ctgcctta 18
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aactccatca tgaagtgtga cg 22
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gatccacatc tcgctggaag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aactccatca tgaagtgtga cg 22
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatccacatc tcgctggaag g 21
Claims (10)
1.一种预测结肠癌预后的标志物，其特征在于，所述标志物包括自噬相关的lncRNA和/或自噬相关的mRNA标志物，所述自噬相关的lncRNA为CASC9、PCAT6、AP006621.2、GS1-124K5.4、MIR4435-2HG、AL354993.2、AC048344.4、AC010973.2、AL590483.1、AL137782.1、STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB、LINC00513、SNHG16和AP001554.1，所述自噬相关的mRNA为GRID1、DAPK1、RAB7A、PELP1、ULK3和WIPI2。
2.根据权利要求1所述的预测结肠癌预后的标志物在结肠癌预后中的应用；所述应用包括但不限于构建预测结肠癌预后风险的模型、构建预测结肠癌生存率的模型、制备用于预测结肠癌预后风险的检测试剂或装置、制备用于预测结肠癌生存率的检测试剂或装置中的任意一种或几种的组合。
3.一种预测结肠癌预后风险的模型，其特征在于，所述模型包括自噬相关mRNA风险预测模型、自噬相关lncRNA风险预测模型和/或结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型；所述自噬相关mRNA风险预测模型公式＝(0.524×expression level ofUKL3)+(1.022×expression level of GRID1)+(0.254×expression level of DAPK1)+(0.410×expression level of PELP1)+(0.608×expression level of WIP2)+(1.097×expression level of RAB7A)；所述自噬相关lncRNA风险预测模型公式＝(0.183×expression level of CASC9)+(0.334×expression level of PCAT6)+(0.348×expression level of AP006621.2)+(0.409×expression level of GS1-124K5.4)+(0.651×expression level of MIR4435-2HG)+(0.838×expression level ofAL354993.2)+(0.881×expression level of AC048344.4)+(1.145×expression levelof AC010973.2)+(-0.882×expression level of AL590483.1)+(-0.875×expressionlevel of AL137782.1)+(-0.688×expression level of STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(-0.665×expression level of LINC00513)+(-0.663×expression level of SNHG16)+(-0.573×expression level of AP001554.1)；结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式＝(-0.361×expression level of AP001554.1)+(0.150×expressionlevel of AP006621.2)+(0.023×expression level of ULK3)+(0.564×expressionlevel of AL354993.2)+(0.379×expression level of MIR4435-2HG)+(×-0.025expression level of GRID1)+(0.130×expression level of PCAT6)+(-0.591×expression level of STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB)+(0.021×expression level ofCASC9)+(-0.169×expression level of LINC00513)+(0.015×expression level ofDAPK1)+(-0.125×expression level of SNHG16)+(0.769×expression level ofAC048344.4)+(0.029×expression level of GS1-124K5.4)+(-0.005×expressionlevel of PELP1)+(0.023×expression level of WIPI2)+(-1.118×expression levelof AL1 37782.1)+(0.814×expression level of AC010973.2)+(0.01×expressionlevel of RAB7A)+(-0.641×expression level of AL590483.1)。
4.一种预测结肠癌预后风险的系统，其特征在于，所述预测结肠癌预后风险的系统包括数据输入模块、模型计算模块和结果输出模块；
所述数据输入模块用于将结肠癌病人的自噬相关基因表达值的结果输入模型计算模块，所述自噬相关基因包括所述自噬相关mRNA或/和lncRNAs；
所述模型计算模块根据所述自噬相关基因表达值和如权利要求3所述的结肠癌风险预测模型中的自噬相关mRNA风险模型公式、自噬相关lncRNA风险模型公式和/或结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式进行计算；
所述结果输出模块用于根据结肠癌病人自噬相关mRNA和/或lncRNA的风险值来预测结肠癌病人的预后风险。
5.根据权利要求4所述的预测结肠癌预后风险的系统，其特征在于，按照所述自噬相关mRNA风险模型公式计算得到的结果≥0.954时，判定结肠癌预后为高风险；按照所述自噬相关mRNA风险模型公式计算得到的结果<0.954时，判定结肠癌预后为低风险；优选的，按照所述自噬相关lncRNAs风险模型公式计算得到的结果≥1.009时，判定结肠癌预后为高风险；优选的，按照所述自噬相关lncRNAs风险模型公式计算得到的结果<1.009时，判定结肠癌预后为低风险；按照所述结合所述自噬相关mRNA和自噬相关lncRNA的风险预测模型公式计算得到的结果≥1.04时，判定结肠癌预后为高风险；按照所述自噬相关mRNA风险模型公式计算得到的结果<1.04时，判定结肠癌预后为低风险。
6.一种结肠癌生存率预测模型，其特征在于，所述结肠癌生产率预测模型通过以根据权利要求3所述的预测结肠癌预后风险的模型计算得到的风险值、年龄和肿瘤分期为影响因素构建诺莫图得到。
7.一种结肠癌生存率预测系统，其特征在于，所述结肠癌生存率预测系统根据如权利要求6所述的结肠癌生存率预测模型构建得到，所述结肠癌生存率预测系统的形式包括但不限于绘制有所述诺莫图的可见载体、网页计算器或小程序中的任意一种或几种的组合。
8.用于检测如权利要求1所述的标志物的RT–qPCR引物组，其特征在于，包括下述引物中的至少一种：检测GRID1的上游引物如SEQ ID NO.1所示，检测GRID1的下游引物如SEQ IDNO.2所示；检测DAPK1的上游引物如SEQ ID NO.3所示，检测DAPK1的下游引物如SEQ IDNO.4所示；检测RAB7A的上游引物如SEQ ID NO.5所示，检测RAB7A的下游引物如SEQ IDNO.6所示；检测PELP1的上游引物如SEQ ID NO.7所示，检测PELP1的下游引物如SEQ IDNO.8所示；检测ULK3的上游引物如SEQ ID NO.9所示，检测ULK3的下游引物如SEQ ID NO.10所示；检测WIPI2的上游引物如SEQ ID NO.11所示，检测WIPI2的下游引物如SEQ ID NO.12所示；检测AL354993.2的上游引物如SEQ ID NO.13所示，检测AL354993.2的下游引物如SEQID NO.14所示；检测AC048344.4的上游引物如SEQ ID NO.15所示，检测AC048344.4的下游引物如SEQ ID NO.16所示；检测CASC9的上游引物如SEQ ID NO.17所示，检测CASC9的下游引物如SEQ ID NO.18所示；检测AP006621.2的上游引物如SEQ ID NO.19所示，检测AP006621.2的下游引物如SEQ ID NO.20所示；检测AC010973.2的上游引物如SEQ ID NO.21所示，检测AC010973.2的下游引物如SEQ ID NO.22所示；检测GS1-124K5.4的上游引物如SEQ ID NO.23所示，检测GRID1的下游引物如SEQ ID NO.24所示；检测MIR4435-2HG的上游引物如SEQ ID NO.25所示，检测MIR4435-2HG的下游引物如SEQ ID NO.26所示；检测PCAT6的上游引物如SEQ ID NO.27所示，检测PCAT6的下游引物如SEQ ID NO.28所示。检测AL590483.1的上游引物如SEQ ID NO.29所示，检测AL590483.1的下游引物如SEQ ID NO.30所示；检测AL137782.1的上游引物如SEQ ID NO.31所示，检测AL137782.1的下游引物如SEQID NO.32所示；检测STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB的上游引物如SEQ ID NO.33所示，检测STAG3L5P-PVRIG2P-PILRB的下游引物如SEQ ID NO.34所示；检测LINC00513的上游引物如SEQ ID NO.35所示，检测LINC00513的下游引物如SEQ ID NO.36所示；检测SNHG16的上游引物如SEQ ID NO.37所示，检测SNHG16的下游引物如SEQ ID NO.38所示；检测AP001554.1的上游引物如SEQ ID NO.39所示，检测AP001554.1的下游引物如SEQ ID NO.40所示；检测GAPDH的上游引物如SEQ ID NO.41所示，检测GAPDH的下游引物如SEQ ID NO.42所示；检测GDC的上游引物如SEQ ID NO.43所示，检测GDC的下游引物如SEQ ID NO.44所示；检测RTC的上游引物如SEQ ID NO.45所示，检测RTC的下游引物如SEQ ID NO.46所示。
9.一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测如权利要求1所述的标志物的试剂、如权利要求3所述的预测结肠癌预后风险的模型、如权利要求4所述的预测结肠癌预后风险的系统、如权利要求5所述的结肠癌生存率预测模型、如权利要求6所述的结肠癌生存率预测系统和如权利要求8所述的引物组中的任意一种或几种的组合。
10.一种检测结肠癌自噬相关基因的PCR芯片，其特征在于，包含如权利要求8所述的引物组。
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