CN113265467A - 一种多发性骨髓瘤标志物、引物、试剂盒及应用 - Google Patents

一种多发性骨髓瘤标志物、引物、试剂盒及应用 Download PDF

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CN113265467A CN202110704644.9A CN202110704644A CN113265467A CN 113265467 A CN113265467 A CN 113265467A CN 202110704644 A CN202110704644 A CN 202110704644A CN 113265467 A CN113265467 A CN 113265467A
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multiple myeloma
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王浩霖
杨季云
周玉
姜涛
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Abstract

本发明提供了一种多发性骨髓瘤标志物、引物、试剂盒及应用，标志物为MIR4435‑2HG，如SEQ ID NO.1所示。它受骨髓瘤生长存活因子IL‑6的刺激表达上调，在肿瘤细胞中高表达，在正常细胞中不表达。在多种MM细胞株中呈高水平表达，MM患者骨髓和血浆中的表达量也上调。MIR4435‑2HG的表达量与目前临床现行的预后分层标准R‑ISS体系相契合即R‑ISS分期越差，MIR4435‑2HG表达量越高。MIR4435‑2HG高表达患者无病生存率显著较低，它是早期复发和生存率显著下降的重要指标。MIR4435‑2HG的肿瘤特异性的高频率且持续的表达，使其有望成为有效的MM预后、疗效监测指标。

Description

一种多发性骨髓瘤标志物、引物、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多发性骨髓瘤标志物、引物、试剂盒及应用。
背景技术
多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）占血液系统恶性肿瘤的10%，占所有恶性肿瘤的1%。MM是一种浆细胞恶性克隆性肿瘤，尽管近年来雷那度胺、硼替佐咪等新药疗效显著，但其仍无法治愈，所有患者终将复发。其主要原因在于经过常规治疗后患者体内仍然存在微小残留病( minimal residual disease, MRD) ,MRD被认为是复发的根源。MRD直接指导治疗并判断预后, 因此需要对MRD进行监测。目前常用的MRD监测方法是采集骨髓样本进行细胞形态学检测和流式细胞免疫分型，但存在着不足之处：① MM具有独特的组织分布特征即瘤细胞在髓内浸润和增殖程度不同，呈灶状分布，常需要多次穿刺才能检出阳性结果，并且多次检测结果间变异较大。②细胞形态学主观性较强，不易于良恶性浆细胞的鉴别。并且化疗后骨髓瘤细胞数量骤减，即使人工分类细胞数超出日常检测数目仍难以准确地计数瘤细胞的数量。③因各实验室仪器状态和人员技术水平存在较大差异使得流式细胞术的检测方案和监测指标较难统一。并且即使目前高端的多色流式细胞术（八色到十色）的灵敏度仍为10-4。
目前关于MM MRD的监测指标主要是骨髓瘤细胞表面分子的表达模式和免疫球蛋白基因的克隆性重排。表面分子表达模式异常的浆细胞并不能等同于肿瘤性浆细胞，并且该指标只能通过流式细胞术检测，受限于该技术的灵敏度。免疫球蛋白基因的克隆性重排目前主要通过二代测序检测，检测的成本太高，不利于临床推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：目前关于MM MRD的监测指标和检测手段，存在灵敏度较低、或检测成本较高等问题，本发明提供了解决上述问题的一种多发性骨髓瘤标志物、引物、试剂盒及应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种多发性骨髓瘤标志物，所述标志物为MIR4435-2HG，如SEQ ID NO .1所示。
MIR4435-2HG又称为MIR4435-2HG、LINC00978，位于染色体2q13。它受骨髓瘤生长存活因子IL-6的刺激表达上调，在肿瘤细胞中高表达，在正常细胞中不表达。在多种MM细胞株中呈高水平表达，MM患者骨髓和血浆中的表达量也上调。并且MIR4435-2HG的表达量与目前临床现行的预后分层标准R-ISS体系相契合即R-ISS分期越差，MIR4435-2HG表达量越高。MIR4435-2HG高表达患者无病生存率显著较低，它是早期复发和生存率显著下降的重要指标。MIR4435-2HG的肿瘤特异性的高频率且持续的表达，使其有望成为有效的MM预后、疗效监测指标，尤其是无创检测的靶标。
检测上述的一种多发性骨髓瘤标志物的物质在制备多发性骨髓瘤诊断、疗效预测及预后检测制剂中的应用。
一种针对多发性骨髓瘤标志物的检测引物，包括针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲：上游引物如SEQ ID NO .2所示；下游引物如SEQ ID NO .3所示。
进一步优选，还包括针对ABL基因的特异性引物对乙：上游引物如SEQ ID NO .4所示；下游引物如SEQ ID NO .5所示。
一种多发性骨髓瘤诊断与预后检测试剂盒，包括检测上述的一种多发性骨髓瘤标志物的物质。
进一步优选，包括针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲：上游引物如SEQ IDNO .2所示；下游引物如SEQ ID NO .3所示。
进一步优选，还包括针对ABL基因的特异性引物对乙：上游引物如SEQ ID NO .4所示；下游引物如SEQ ID NO .5所示。
进一步优选，还包括阳性对照质粒；所述阳性对照质粒是以MIR4435-2HG基因DNA为模板，进行PCR扩增产物与载体连接构成的质粒。
进一步优选，所述阳性对照质粒如SEQ ID NO .6所示。
进一步优选，还包括内参对照质粒和/或阴性对照质粒；所述内参对照质粒是以K562细胞系的cDNA为模板的克隆质粒，所述阴性对照质粒采用pLVX-IRES-Neo-luc载体。
本发明具有如下的优点和有益效果：
目前关于MM MRD的监测指标主要是骨髓瘤细胞表面分子的表达模式和免疫球蛋白基因的克隆性重排。表面分子表达模式异常的浆细胞并不能等同于肿瘤性浆细胞，并且该指标只能通过流式细胞术检测，受限于该技术的灵敏度。免疫球蛋白基因的克隆性重排目前主要通过二代测序检测，检测的成本太高，不利于临床推广应用。
本发明将循环MIR4435-2HG发展为多发性骨髓瘤残留监测的新指标，创建无创、高灵敏度、高特异性的MM MRD的检测试剂盒。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1表示阳性对照质粒的RQ-PCR标准曲线；
图2表示阳性对照质粒105、104、103、102个拷贝的RQ-PCR扩增曲线。
图3为本发明的初诊时MM患者循环MIR4435-2HG表达量分析图；其中，
图3a：46 例 MM 患 者 MIR4435-2HG 表达量为正常对照组的 4.97 ± 1.24 倍（P=0.022，）；
图3b：MM患者MIR4435-2HG表达量与血清IL-6水平呈正相关（r=0.88，P=0.0001）；
图3c：R-ISS分期越差，MIR4435-2HG表达量越高；
图3d：初诊时，循环MIR4435-2HG的表达量与骨髓MIR4435-2HG的表达量相关性显著（r=0.99，P<0.0001）。
图4为本发明的MM患者生存分析图；其中，
图4a：46例MM患者的R-ISS分期不同，其无进展生存率（PFS）不同。R-ISS Ⅲ期患者的PFS最差量；
图4b：Ⅰ期患者中MIR4435-2HG 均值为3.45，同组内高于均值的患者的PFS较差（X2=5.49, P=0.019，）；
图4c：Ⅱ期患者中MIR4435-2HG的均值为5.04，高于均值患者的PFS较同组内低于均值患者的PFS差（X2=15.96, P=6.45E-5）；
图4d：Ⅲ期患者中， MIR4435-2HG的均值为6.45，MIR4435-2HG较高患者的PFS较差（X2=0.021, P=0.88）。
图5为本发明的完全缓解MM患者的随访观察分析图；其中，
图5a：经诱导化疗后，46例患者中11例患者达完全缓解；其中7例MM患者MRD持续阴性（MFC），其MIR4435-2HG在随访期内持续处于较低水平；
图5b,c,d,e：另外4例已达完全缓解的患者在随访期内循环MIR4435-2HG的表达量逐渐增高。在MFC为阴性时MIR4435-2HG的表达量即呈逐渐上升趋势，并在某一阶段发生显著的升高，出现趋势变化的拐点较MFC报阳平均提前4周至8周。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种特异性引物对，具体如下所示：
一、针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲：
上游引物MIR4435-2HG-F：5'-CCTCAGGACTTGAGTAACAGC-3'；
下游引物MIR4435-2HG-R：5'-GTGAGTGTTGTGGTACAGTG-3'。
二、针对ABL基因(内参基因)的特异性引物对乙：
上游引物ABL-F：5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3'；
下游引物ABL-R：5'-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3'。
实施例2
本实施例提供了相关质粒的制备方法，具体如下所示：
步骤一：阳性对照质粒(含有MIR4435-2HG基因片段的质粒)的制备方法
以全基因合成MIR4435-2HG基因DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如下(4000bp)所示。回收PCR产物（DNA 凝胶回收试剂盒，DONGSHENG BIOTECH），再与 pLVX-IRES-Neo-luc 载体（如SEQ ID NO .7所述）分别用NotI单酶切。回收酶切产物（DNA 凝胶回收试剂盒，DONGSHENG BIOTECH）后进行目段片段与载体的连接（ClonExpress MultiS OneStep Cloning Ki 重组酶购于诺唯赞公司，货号：C113-01）。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α（天根生化公司，货号：CD101-02）感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了阳性对照质粒（如SEQ ID NO .6所示）。
PCR扩增所用的引物对如下：
上游引物MIR4435-2HG-F：5'-GGCAAGATCGCCGTGCGCACAAGTATGAAGAGAATGTCGGGAGAG-3'；
下游引物MIR4435-2HG-R：5'-GCGGCCGCAGATTTTTCCCACATGTGATTTTA-3'。
步骤二：内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备方法
以K562细胞系(上海坤肯生物化工有限公司；中国细胞库典藏细胞中心细胞目录：QK10269)的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列，扩增产物经纯化后，克隆入pLVX-IRES-Neo-luc载体，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了内参对照质粒。
步骤三：阴性对照质粒的制备
采用pLVX-IRES-Neo-luc载体。
实施例3
本实施例提供了试剂盒的灵敏度检测，具体如下所示：
步骤一：试剂盒的组装
试剂盒由如下组件组成：实施例1制备的针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲；实施例2制备的阳性对照质粒。
步骤二：试剂盒的灵敏度检测
阳性对照质粒10倍梯度稀释为分别含有105、104、103、102个拷贝的MIR4435-2HG基因片段。在荧光实时定量PCR仪(7500-FAST，ABI，美国)上进行RT-qPCR。
PCR反应体系（20μl）：实施例2所示的上游引物0.5μM，实施例2所示的下游引物0.5μM，2×TaqMan mix 10μl（TOYOBO，日本），阳性对照质粒2μl；去离子水7μl。
PCR反应条件：95˚C 5min；95˚C 10sec ，60˚C 30sec，39个循环；95˚C 15sec, 60˚C 1min 。
阳性对照质粒105、104、103、102个拷贝的RQ-PCR荧光曲线见图1，检测MIR4435-2HG基因片段的灵敏度可达100个拷贝。
实施例4
本实施例提供了一种试剂盒的应用，具体如下所示：
步骤一：试剂盒的组装
试剂盒由如下组件组成：实施例1制备的针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲；实施例2制备的阳性对照质粒和阴性对照质粒。
步骤二：试剂盒的应用
检测46位多发性骨髓瘤患者（R-ISS I期10例，II期 11例，III期 25例）、12例正常供者的骨髓和血浆中MIR4435-2HG 基因的表达情况，方法如下：
步骤1、骨髓RNA提取
用EDTA抗凝，用淋巴细胞分层液(相对密度1.077g/L，上海华精高科技有限公司)分离出单个核细胞，加入1000 μlTriPure Isolation Reagent试剂。反复用力吹打裂解。
将裂解液转入无RNAase污染的1.5ml EP管内，室温下静置5 min。
每管加入200μl三氯甲烷，盖上盖子，手中剧烈震荡20s。
室温下静置5min后，12000g，4℃离心15 min。
从上至下分为三层，上层即为总RNA液体。小心吸取300 μl上层液，转入新的无RNAase酶污染的1.5ml EP管中。
每管加入500μl 异丙醇，室温静置10min后，12000g，4℃离心10min。
去上清，每管加入预冷的75%乙醇1ml，置冰上10min。
12000 g，4℃离心5s，后去上清。室温下干燥5min-10min。
每管加入10μl DEPC水，混匀后，测总RNA浓度。
步骤2、血浆RNA的提取
为了富集血浆里游离RNA，分离获得血浆后先加入10% PEG8000，再采用QIAampRNA Blood Mini Kit提取循环血浆游离RNA。
步骤3、cDNA合成
根据罗氏Transcriptor First Strand cDNA synthesis Kit说明书操作。
表1 反转录体系（20μl反应体系）。
试剂 体积μl
反转录缓冲液（5倍浓度） 4
Rnase抑制剂（40U/μl） 0.5
dNTP Mix,10mM each 2.0
反转录酶（20U/μl） 0.5
Random primers, 600pmol/μl 2.0
总RNA 按1μg量计算
0.1% DEPC水 20μl体系剩下的体积
表2 反转录条件
25℃ 10min
55℃ 30min
85℃ 5min
10℃ 15min
Stop 反应结束立即置冰上
可以先配制缓冲液、RNAase抑制剂、dNTP、Reverase、Random Primer所需总量，再按样本数分装，可减少加样误差。
使用BIO-RAD双头PCR仪，设置好条件后进行逆转录。完成后，cDNA置-20℃冰箱保存。待进行荧光相对定量PCR检测。
步骤4、待测样本的检测
将步骤2得到的循环血浆游离RNA每个样本在荧光实时定量PCR仪上(7500-FAST，ABI，美国)进行RT-qPCR。
每批RT-qPCR实验均设置阳性对照(用等体积的10倍梯度稀释的阳性对照质粒代替样本)、阴性对照(用等体积的阴性对照质粒代替样本)和无模板空白对照(用等体积的H2O代替样本)。
PCR反应体系和程序同实施例3试剂盒灵敏度检测中的PCR反应体系和程序。
结果表明，46 例 MM 患 者 MIR4435-2HG 表达量为正常对照组的 4.97±1.24倍 （P=0.022，图3a）。同时MM患者MIR4435-2HG表达量与血清IL-6水平呈正相关（r=0.88，P=0.0001，图3b）。并且R-ISS分期越差，MIR4435-2HG表达量越高（图3c）。初诊时，循环MIR4435-2HG的表达量与骨髓MIR4435-2HG的表达量相关性显著（r=0.99，P<0.0001，图3d）。
实施例5
本实施例提供了关于MIR4435-2HG与预后的相关性试验，具体如下所示：
步骤一：试剂盒的组装
试剂盒由如下组件组成：实施例1制备的针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲；实施例2制备的阳性对照质粒和阴性对照质粒。
步骤二：试剂盒的应用
检测46位多发性骨髓瘤患者（R-ISS I期10例，II期 11例，III 期25例）、12例正常供者的骨髓和血浆中MIR4435-2HG基因的表达情况，方法如下：
1、RNA提取
同实施例4的步骤二中的分步骤：步骤1和步骤2。
2、cDNA合成
同实施例4的步骤二中的分步骤：步骤3。
3、待测样本的检测
同实施例4的步骤二中的分步骤：步骤4。
结果表明：46例MM患者的R-ISS分期不同，其无进展生存率（PFS）不同。R-ISS Ⅲ期患者的PFS最差（图4a）。进一步分析各R-ISS组内MIR4435-2HG表达量的差异：在同一R-ISS组内，循环MIR4435-2HG的表达量不同，以其均值为界限，高于均值与低于均值的患者的PFS存在差异。Ⅰ期患者中MIR4435-2HG 均值为3.45，同组内高于均值的患者的PFS较差（X2=5.49, P=0.019，图4b）。Ⅱ期患者中MIR4435-2HG的均值为5.04，高于均值患者的PFS较同组内 低于均值患者的PFS差（X2=15.96, P=6.45E-5，图4c）。Ⅲ期患者中， MIR4435-2HG的均值为6.45，MIR4435-2HG较高患者的PFS较差（X2=0.021, P=0.88，图4d）。
实施例6
MIR4435-2HG在完全缓解后MRD监测的应用
1、RNA提取
同实施例4的步骤二中的分步骤：步骤1和步骤2。
2、cDNA合成
同实施例4的步骤二中的分步骤：步骤3。
3、待测样本的检测
同实施例4的步骤二中的分步骤：步骤4。
结果表明：经诱导化疗后，46例患者中11例患者达完全缓解。其中7例MM患者MRD持续阴性（MFC），其MIR4435-2HG在随访期内持续处于较低水平（图5a）。而另外4例已达完全缓解的患者在随访期内循环MIR4435-2HG的表达量逐渐增高。在MFC为阴性时MIR4435-2HG的表达量即呈逐渐上升趋势，并在某一阶段发生显著的升高，出现趋势变化的拐点较MFC报阳平均提前4周至8周（图5b, 图5c, 图5d, 图5e）。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川省人民医院
<120> 一种多发性骨髓瘤标志物、引物、试剂盒及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1067
<212> DNA
<213> 1(1)
<400> 1
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cgttccaatg agaatgaagg ctgaggtgtg cgcctttttt ttttttcctt cttagtcgtg 120
tgtacatcat tgggaatgga gggaaataaa tgactggatg gtcgctgctt tttaagtttc 180
aaattgacat tccagacaag cggtgcctga gcccgtgcct gtcttcagat cttcacagca 240
cagttcctgg gaaggtggag ccaccagcct ctccctgaca agcaaagtgg atcagcaaag 300
gctgcagtca ccagcatctt ttccaacctt aatgaactgt atcctcaaaa gaacactatc 360
agactggtaa gacaagcatt attgtcccac ttcacagatg aagagcttgg gggccctgtg 420
gatgtgtagg agagtcggcc ttccttttta taggcctttt gctgagctca gaggacagag 480
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cgttccaatg agaatgaagg ctgaggtgtg cgcctttttt ttttttcctt cttagtcgtg 120
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gacagctcct gcctagagga gaaacaattc tctccttcag ccaggcatgt ggcacagagg 600
tgaacaggaa atgcttaggg agacagttca cagatatata tgtacttcac agggcacaat 660
ttaatccata aatcaatcat ggatcaccgc taaagaaaac aaaatatgct gccactaatt 720
tgccaccacc ctgtgagcat gattggatga tgtttatttt gattaggaga ttgctccatt 780
tataaatctt caatacatcc tgtcccccta aaacggcatc tgggtctttt gagggttaaa 840
aaaaaaaaaa agtgaaattg gatgagggat gagagctgga cttctgtgtg tcccggggtc 900
cctggatcca cagcctggtg cctagcatca gttaagccca cgctggggtc gcatcacatc 960
ccgcaaagcc acgtgctctg tgaggccaac aggagccccg ccgggtggac cagctggaat 1020
ctcagagagc gccgactctg aaactacccg gctctgcaga agcacgctgg gcccaggggc 1080
ttctagactg acagctccat ttatcaacta cctattggtt ttaaaaattg gagtgtcttt 1140
tccgcgttga ctgattttgg ctctaagaga tgtcgctggt catttcagag tgactgaacc 1200
tcccctctaa cagatcccgg gaattgtttt caggaaaggt aaaaggcagc cttttctgtc 1260
acaacacaac gctgagccgg cagcctggct ctgtcaggat ctggggctcc cgcgcccgag 1320
aagcccagcc tcgccggcgg ccaagttcac cgcgaggccc cgcgctgcct gcgctgcgct 1380
cccggacccg caccgaccgc agcgcgcgcc gccggtgctt ctcccacccc agcctggaag 1440
ctgcctccct ccgcctatgc ctgcaggata agaagcccga ggaggcggag catggaactc 1500
gacagttaaa acatttaaga gagaaaacct agtgtcttgc tggcctgaaa tcgagtacgc 1560
agcccggggt gatcagggtc tcccggcccg gatgtgtgag acttgcttcc cctgggcaat 1620
aggcgatacg atgctttagg aggaaggtgt ctctccctcc taagccccgg aggggagaac 1680
ttccaaagac agaaaaccac aggcttcctg gcacagagct ttccctttat cagctaaagc 1740
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tgctgatagt cgtggtgcat tatgccttcc tggttttcat ttaattgggc accacgctgc 1920
ctttcaagac gccttaaagg aaccaacaac caaatccaag agagctggac agaccattga 1980
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acacattcag aaatggtttt agagatagag tcaaactgga cctgataaag aactagagaa 3780
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<210> 7
<211> 4768
<212> DNA
<213> 7(7)
<400> 7
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aatatcttta ttttcattac catacctg 4768

Claims (10)

1.一种多发性骨髓瘤标志物，其特征在于，所述标志物为MIR4435-2HG，如SEQ ID NO.1所示。
2.检测权利要求1所述的一种多发性骨髓瘤标志物的物质在制备多发性骨髓瘤诊断、疗效预测及预后检测制剂中的应用。
3.一种针对多发性骨髓瘤标志物的检测引物，其特征在于，包括针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲：上游引物如SEQ ID NO .2所示；下游引物如SEQ ID NO .3所示。
4.根据权利要求3所述的一种针对多发性骨髓瘤标志物的检测引物，其特征在于，还包括针对ABL基因的特异性引物对乙：上游引物如SEQ ID NO .4所示；下游引物如SEQ ID NO.5所示。
5.一种多发性骨髓瘤诊断与预后检测试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1所述的多发性骨髓瘤标志物的物质。
6.根据权利要求5所述的一种多发性骨髓瘤诊断与预后检测试剂盒，其特征在于，包括针对MIR4435-2HG基因的特异性引物对甲：上游引物如SEQ ID NO .2所示；下游引物如SEQID NO .3所示。
7.根据权利要求5所述的一种多发性骨髓瘤诊断与预后检测试剂盒，其特征在于，还包括针对ABL基因的特异性引物对乙：上游引物如SEQ ID NO .4所示；下游引物如SEQ ID NO.5所示。
8.根据权利要求5至7任一项所述的一种多发性骨髓瘤诊断与预后检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照质粒；所述阳性对照质粒是以MIR4435-2HG基因DNA为模板，进行PCR扩增产物与载体连接构成的质粒。
9.根据权利要求8所述的一种多发性骨髓瘤诊断与预后检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒如SEQ ID NO .6所示。
10.根据权利要求5所述的一种多发性骨髓瘤诊断与预后检测试剂盒，其特征在于，还包括内参对照质粒和/或阴性对照质粒；
所述内参对照质粒是以K562细胞系的cDNA为模板的克隆质粒，
所述阴性对照质粒采用pLVX-IRES-Neo-luc载体。
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