CN106119406A - 多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因分型诊断领域，具体涉及多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒及使用方法，包括肉芽肿性多血管炎基因和微小动脉炎基因SNP检测探针、多重PCR引物、多重PCR反应液及杂交液与洗脱液。本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本通过检测与GPA和MPA相关5位SNP位点的特异性遗传标记物和疾病易感基因在血液细胞表达水平的变化，对此类疾病进行分子遗传学分型以区分GPA和MPA两类疾病。并对携带易感基因的正常个体AAV发病风险进行评估，具有良好的分子分型效能。

Description

多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒及 使用方法

技术领域

本发明属于基因分型诊断领域，具体涉及多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒及使用方法。

背景技术

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关小血管炎(ANCA Associated Vasculitis，AAV)包括肉芽肿性多血管炎(Granulomatosis with Polyangiitis,GPA)和微小动脉炎(Microscopic Polyangiitis，MPA)。据报道，北京大学肾脏病研究所临检室在近5年新检测出ANCA相关小血管炎1353例，说明该类疾病在我国较为常见。目前ANCA是AAV疾病的主要血清学诊断指标，迄今尚无分子遗传学诊断和区分GPA和MPA两种疾病类型。

AAV疾病包括GPA和MPA两种类型。目前对此类疾病的诊断包括血清学诊断、病理学诊断和影像学检查。主要诊断依据是ANCA血清学检查。c-ANCA多见于GPA，其靶抗原为蛋白酶3(PR3)；p-ANCA主要见于MPA，其靶抗原为髓过氧化物酶(MPO)。统计数据表明：GPA病人疾病活动期c-ANCA阳性率达90％，非活动期阳性率只有60-70％，还有近10％的GPA病人p-ANCA阳性。MPA病人疾病活动期p-ANCA阳性率60％，但也有近30％MPA病人c-ANCA阳性。这些数据说明ANCA血清学检查的特异性偏低，不能准确地区分GPA和MPA两种疾病类型；而且其灵敏性和检出率受疾病活动状态的影响较大，疾病活动期病人阳性率高，非活动期病人阳性率低。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒及使用方法，通过检测与GPA和MPA相关5位SNP位点的特异性遗传标记物和疾病易感基因，对此类疾病进行分子遗传学分型以区分GPA和MPA两类疾病，该检测也可对携带易感基因的正常个体AAV发病风险进行评估。本发明应用HLA-DPB1等三个AAV相关基因设计应对多发性肉芽肿血管炎和微小动脉炎的分子诊断试剂盒，为国际上首例，具有良好的分子分型效能。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒，其特征在于，包括肉芽肿性多血管炎基因和微小动脉炎基因SNP检测探针、多重PCR引物、多重PCR反应液及杂交液与洗脱液。

包括四个小试剂盒，分别用于检测位于HLA-DPB1基因上rs1042169_F、rs141520233_F和rs386699872_F的SNP位点以及HLA-DQA2基因上rs3998158_F的SNP位点，每个小试剂盒内装有DNA抽提、PCR扩增、限制性内切酶酶切以及琼脂糖凝胶电泳步骤的相关试剂。

所述试剂盒的HLA-DPB1和HLA-DQA2的扩增引物序列以及对应探针序列如下：

基因 检测位点 PCR扩增正向引物PCR扩增反向引物单碱基延伸引物

HLA-DPB1 rs1042169 5’-ACGTTGGATGACAGGATGTGCAGACACAAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-AGGGTCATGGGCCCG-3’

HLA-DPB1 rs141530233 5’-ACGTTGGATGGGATGTGCAGACACAACTAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-GCAGGGTCATGGGCC-3’

HLA-DPB1 rs386699872 5’-ACGTTGGATGACAGGATGTGCAGACACAAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-CGAGCTGGGCGGGCC-3’

HLA-DQA2 rs3998158 5’-ACGTTGGATGTTGTTTTCTCTGCTGCACTC-3’5’

-ACGTTGGATGAGCATCAGAGACATGTAGGC-3’5’-CTGCTGCACTCTTTATCC-3’。

一种多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒的使用方法，分别通过以下两种方案多个步骤实现：

方案一：经典的Sanger法

1)扩增反应体系为：每50ul中含5ul的10倍扩增缓冲液、2ul浓度为25mM的Mg2+、2ul浓度为I0mM的dNIPs、l.5ul浓度为10uM的正向引物、1.5ul浓度为10uM的反向引物、0.5ul的HotStarTaq DNA聚合酶、2ul浓度为10-20ng/ul的DNA模板、余量为35.5ul的加双蒸水；

2)扩增反应步骤为：先95℃反应15min，进入循环，循环中先94℃反应0.5min，然后56℃反应0.5min，然后72℃反应1min为一个循环，共反应35个循环然后72℃反应7min，最后4℃保存；

3)测序反应体系为：4ul的BigdyeV3.1终结反应混合物、3ul的双蒸水、1ul浓度为10μΜ的测序引物、2ul的PCR产物；

4)测序反应步骤为：先94℃反应0.5min，然后50℃反应0.5min，然后60℃反应2.0min为一个循环，共反应30个循环；

5)Sanger测序PCR反应产物；

6)Sanger测序结果分析；

方案二：ARMS-PCR法

在多重PCR中同时扩增多达4个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在4个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型；

联合多重PCR扩增引物和单碱基延伸包括：

基因 检测位点 PCR扩增正向引物PCR扩增反向引物单碱基延伸引物

HLA-DPB1 rs1042169 5’-ACGTTGGATGACAGGATGTGCAGACACAAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-AGGGTCATGGGCCCG-3’

HLA-DPB1 rs141530233 5’-ACGTTGGATGGGATGTGCAGACACAACTAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-GCAGGGTCATGGGCC-3’

HLA-DPB1 rs386699872 5’-ACGTTGGATGACAGGATGTGCAGACACAAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-CGAGCTGGGCGGGCC-3’

HLA-DQA2 rs3998158 5’-ACGTTGGATGTTGTTTTCTCTGCTGCACTC-3’

5’-ACGTTGGATGAGCATCAGAGACATGTAGGC-3’5’-CTGCTGCACTCTTTATCC-3’通过以下步骤实现：

a.PCR扩增和延伸反应

1)通过多重PCR扩增，获得靶序列扩增产物：分别在384孔里加入1μl基因组DNA(5ng/μl),4μl PCR反应混合液。反应条件为：94℃5min；94℃20sec,56℃30sec,72℃1min,45个循环；72℃3min；

2)使用虾碱性磷酸酶处理扩增产物，除去扩增产物中的dNTPs：在384孔中加入2μlSAP反应混合液，进行SAP反应，反应条件为：37℃40min,85℃10min。反应完成后降至室温并4℃保存；

3)加入延伸引物进行单碱基延伸反应，在延伸引物3’端连接一个与突变位点互补的碱基，获得小片段单链延伸产物。在384孔中加入2μl单碱基延伸反应液及适量引物，进行单碱基延伸反应，反应条件为：94℃15min；94℃20sec,56℃30sec,72℃1min,72℃3min；4℃保存；

b.产物纯化和质谱上机

1)使用阳离子交换树脂纯化延伸产物，除去延伸产物的阳离子。在384孔中加入16μl去离子水与6mg树脂进行脱盐处理；

2)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对纯化后的产物进行质谱检测；

c.数据分析：使用MassARRAY Typer系统对HLA-DPB1三等位基因和HLA-DQA2等位基因信息进行数据分析。

AAV是一种系统性自身免疫病，包括GPA和MPA两种类型，其与ANCA存在密切相关，是严重累及人类器官甚至威胁生命的坏死性血管炎。尽管GPA和MPA在通常情况下被认为是同一种疾病，但它们在某些方面有明显不同，例如细胞质型抗体c-ANCA多见于GPA，其靶抗原为蛋白酶3(PR3)。细胞核周型抗体p-ANCA主要见于MPA，其靶抗原为髓过氧化物酶(MPO)。此外，GPA和MPA疾病的风险基因不同、主要受累器官不同、疾病复发风险不同以及临床药物治疗和预后也不尽相同，因此临床上迫切需要一种鉴别诊断技术对AAV进行分子分型诊断。

通过对不同人群AAV患者大样本进行全基因组关联分析(Genome wideAssociation Studies,GWAS)，证明了此类疾病与主要组织兼容性复合体(MajorHistocompatibility Complex，MHC)Class II等位基因有极高的相关性。GWAS研究证实SERPINA和PRTN3等位基因与AAV疾病有显着相关性。与疾病的相关的MHC和非MHC风险基因在c-ANCA或p-ANCA阳性的AAV病人中也显着不同。以上结果为通过基因分型区分GPA和MPA奠定了基础。因此我们建立了一个GPA和MPA疾病人群和健康人群数据库。

我们通过对1986个AAV病人和4723个健康个体样本的GWAS分析，发现多个与AAV疾病相关的错义和/或影响基因表达、参与免疫应答的单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)：包括MHC区域HLA-DP和HLA-DQ，以及非MHC区域的PRTN3、SERPINA1和PTPN22基因。MHC区域编码HLA-DPβ链蛋白的HLA-DPB1基因单倍型与疾病的相关性最为显着(rs141530233p＝1.13x 10^-89，OR＝2.99)。非MHC区域易感基因SERPINA1和PTPN22的峰值信号来自影响基因功能的错义SNP rs28929474-(p＝3.09x10^-12，OR＝2.18)和rs6679677(p＝1.88x10^-8，OR＝1.40)；而PRTN3的峰值信号来自基因上游调控区域SNP rs62132293(p＝8.60x10^-11，OR＝1.29)。对AVV病人进一步分组统计分析结果表明HLA-DPB1、PRTN3和SERPINA1与cANCA阳性/GPA病人高度相关，与pANCA阳性/MPA病人没有显着相关性。而HLA-DQA2与pANCA阳性/MPA病人有显着相关性，与cANCA阳性/GPA病人没有显着相关性。综合本研究所有样本的人口归因分数分析结果表明77％AAV病人归因于上述所有易感基因。这些数据说明AAV可以通过不同的功能性风险等位基因来进行分类，并为不同疾病种类的区分和免疫功能紊乱的研究提供新途径。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：通过检测与GPA和MPA相关5位SNP位点的特异性遗传标记物和疾病易感基因在血液细胞表达水平的变化，对此类疾病进行分子遗传学分型以区分GPA和MPA两类疾病。并对携带易感基因的正常个体AAV发病风险进行评估，具有良好的分子分型效能。

附图说明

图1质量控制和研究设计图；

图2对于全基因组关联分析检验统计量的位数-位数图；

图3为ANCA相关性血管炎全基因组关联筛查的结果，Y轴表示沿着X轴的在每一个染色体的单核苷酸多态的–log10P值(来自EIGENSTRAT)。虚线表示全基因组显着性阈值(P＝5.0x10^-7)；

图4通过直接测序分析确认三等位基因HLA-DPB1风险和无风险单倍型，序列分析显示HLA-DPB1外显子2区rs1042169，rs141530233，rs386699872的风险和无风险的单倍型。通过引物对5’-GAGTACTGGAACAGCCAGAA和3’-TAAGGTCCCTTAGGCCAACC，一条从3048604到33048804的201bp的HLA-DPB1核苷酸片段被PCR扩增,扩增产物直接通过桑格测序确定纯合子的风险(N＝50)或纯合非风险(N＝50)rs1042169和rs141530233基因型，从每一个亚组读出的序列的代表性的例子，与核苷酸序列和相应的氨基酸序列和位置如图所示。每个单倍型中的多态性等位基因盘旋。测序分析证实了rs386699872CA与风险100％的相关性，以及rs386699872G与无风险的rs1042169/rs141530233单倍型100％的相关性；

图5为与AAV相关的rs62132293变异体与PRTN3表达的提高关联示意图，从有rs62132293CC(n＝7)，rs62132293CG(n＝9)或者rs62132293GG(n＝6)基因型的健康者的外周血单个核细胞中取出cDNA，对其进行定量PCR的扩增以检测PRTN3mRNA的水平。相对于校准参照基因COX5B PRTN3，PRTN3表达水平表示为在箱须图上规范化的各个数据点。每个盒中的水平线表示了平均表达值；垂直线表示了最低和最高的数据点。数据代表了三次独立实验。P值显示配对t检验；

图6 rs1042169等位基因与不同HLA-DPB1表达和T细胞表达相关联，(A)从具有rs1042169GG(N＝13)，rs1042169AA(N＝7)或rs1042169GA(N＝8)基因型的健康人外周血单个核细胞(PBMC)中提取cDNA,通过对它的扩增可以检测HLA-DPB1mRNA水平。数据为三次独立实验的数据。(B，C)HLA-DP的B细胞(B)和单核细胞(C)的表面蛋白水平通过抗DP和抗CD19或抗CD14的流式细胞测定法评估了rs1042169GG抗体染色的PBMCs(24)，rs1042169AA(N＝5)，或rs1042169GA(N＝9)捐助者。黑色条表示平均MFI值。(D)用sense和anti-sense的PR3活化具有rs10421699GG(N＝6)，GA(N＝4)或AA(N＝2)基因型的PR3ANCA阳性患者的外周血单个核细胞24个小时，然后通过ELISPOT分析IFNγ分泌T细胞(数据表明活化与未活化细胞的平均倍数的变化)。条表示均值±SEM。P值为非配对t检验所示。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步地说明。

本发明提供的试剂盒是一种应用于血管炎分型诊断的试剂盒。通过检测AAV患者的特异性遗传标记物的变异以便在基因水平对GPA和MPA进行遗传学分型。并对携带易感基因的正常个体AAV发病风险进行评估。

检测试剂盒应用于Sequenom iPLEX阵列平台上，在Sequenom大规模阵列平台上测定HLA-DPB1,HLA-DQA2基因位点上的4个SNP(表1)。

表1检测ANCA相关性小血管炎相关基因HLA-DPB1及HLA-DQA2的引物设计及序列

实验方法

本发明设计的HLA-DPB1三等位基因和HLA-DQA2等位基因检测PCR扩增引物包括：

HLA-DPB1：5’-GAGTACTGGAACAGCCAGAA-3’

HLA-DPB1：3’-TAAGGTCCCTTAGGCCAACC-5’

HLA-DQA2：5’-TTTCTCTGCTGCACTCTTTATCC-3’

HLA-DQA2：3’-GGTCACAGGCAAATGCAGTA-5’

本发明设计的HLA-DPB1三等位基因检测采用的测序引物包括：

HLA-DPB1：5’-GAGTACTGGAACAGCCAGAA-3’

HLA-DQA2：5’-TTTCTCTGCTGCACTCTTTATCC-3’

本发明通过以下技术方案来实现：

方案一：经典的Sanger法

1)扩增反应体系为：每50ul中含5ul的10倍扩增缓冲液、2ul浓度为25mM的Mg²⁺、2ul浓度为I0mM的dNIPs、l.5ul浓度为10uM的正向引物、1.5ul浓度为10uM的反向引物、0.5ul的HotStarTaq DNA聚合酶、2ul浓度为10-20ng/ul的DNA模板、余量为35.5ul的加双蒸水。

2)扩增反应步骤为：先95℃反应15min，进入循环，循环中先94℃反应0.5min，然后56℃反应0.5min，然后72℃反应1min为一个循环，共反应35个循环然后72℃反应7min，最后4℃保存。

3)测序反应体系为：4ul的BigdyeV3.1终结反应混合物、3ul的双蒸水、1ul浓度为10μΜ的测序引物、2ul的PCR产物。

4)测序反应步骤为：先94℃反应0.5min，然后50℃反应0.5min，然后60℃反应2.0min为一个循环，共反应30个循环。

5)Sanger测序PCR反应产物。

6)Sanger测序结果分析。

方案二：ARMS-PCR法

本发明设计还提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测HLA-DPB1三等位基因和HLA-DQA2等位基因检测方案。其中:在多重PCR中同时扩增多达4个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在4个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。

联合多重PCR扩增引物和单碱基延伸包括:

基因 检测位点 PCR扩增正向引物PCR扩增反向引物单碱基延伸引物

HLA-DPB1 rs1042169 5’-ACGTTGGATGACAGGATGTGCAGACACAAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-AGGGTCATGGGCCCG-3’

HLA-DPB1 rs141530233 5’-ACGTTGGATGGGATGTGCAGACACAACTAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-GCAGGGTCATGGGCC-3’

HLA-DPB1 rs386699872 5’-ACGTTGGATGACAGGATGTGCAGACACAAC-3’

5’-ACGTTGGATGAAAGCCCTCACTCACCTCG-3’5’-CGAGCTGGGCGGGCC-3’

HLA-DQA2 rs3998158 5’-ACGTTGGATGTTGTTTTCTCTGCTGCACTC-3’5’-ACGTTGGATGAGCATCAGAGACATGTAGGC-3’5’-CTGCTGCACTCTTTATCC-3’。

技术方案包括：

1.PCR扩增和延伸反应

1)通过多重PCR扩增，获得靶序列扩增产物：分别在384孔里加入1μl基因组DNA(5ng/μl),4μl PCR反应混合液。反应条件为：94℃5min；94℃20sec,56℃30sec,72℃1min,45个循环；72℃3min。5’端及3’端引物分别为1μg/mL。

2)使用虾碱性磷酸酶处理扩增产物，除去扩增产物中的dNTPs：在384孔中加入2μlSAP反应混合液，进行SAP反应，反应条件为：37℃40min,85℃10min。反应完成后降至室温并4℃保存。

3)加入延伸引物进行单碱基延伸反应，在延伸引物3’端连接一个与突变位点互补的碱基，获得小片段单链延伸产物。在384孔中加入2μl单碱基延伸反应液及适量引物，进行单碱基延伸反应，反应条件为：94℃15min；94℃20sec,56℃30sec,72℃1min,72℃3min；4℃保存。

2.产物纯化和质谱上机

1)使用阳离子交换树脂纯化延伸产物，除去延伸产物的阳离子。在384孔中加入16μl去离子水与6mg树脂进行脱盐处理。

2)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对纯化后的产物进行质谱检测。

3.数据分析：使用MassARRAY Typer系统对HLA-DPB1三等位基因和HLA-DQA2等位基因信息进行数据分析。

实验对象的选取

受试者均为AAV的患者，其中包括按风湿病标准对肉芽肿性血管炎的分类修订标准确诊为肉芽肿性血管炎的患者(501个病例)。对照组样本来自于1465个健康对照组。

基因分型和质量控制方案

全基因组学关联研究中共有1615份AAV病例的样品和202个对照组在西奈山医院临床基因组学中心运用Affymetrix Axiom Biobank 1基因分型阵列进行了基因分型。该阵列测试了628,679个单核苷酸多态性，其中246,000个(36.5％)为全基因组学关联标记，265,000个(39.3％)为非同义编码单核苷酸多态性，70,000个(10.4％)为无功能的单核苷酸多态性，23,000(3.4％)为表达数量形状基因座(eQTL)单核苷酸多态性，还有2,000个(0.3％)为药物遗传学标志，另外的27,679个是额外的“定制”的标记(additional“custom”markers)。

基因分型首先使用Affymetrix Genotyping ConsoleTM 4.2software记录下来，随后运用Affymetrix的SNPolisher软件进行分析处理。所有的数据均采用Golden HelixSVS 8.3.4软件进行质量检测，设置质量标准为基因分型完成率大于95％和样品完成率大于97％，且单态的单核苷酸多态性和哈迪-温伯格平衡假定值小于10^-5的SNP均会从数据集中删除。筛选后，我们将两个数据集中相同的单核苷酸多态性标记合并到一个单独的文件中。我们通过研究SNPs在连锁不平衡中的出现的频率来评测人群血统(IBD)和祖先，当每对病例的IBD测量值大于0.25时，移除其中低基因分型完成率的样品。最终，通过质量检测的病例，对照组以及333,035个SNPs通过了质量检测(图1)。A显示了对单核苷酸多态性(SNP)和个体对象的基因组DNA基因分型的质量控制的结果。单核苷酸多态性，以满足质量控制标准的要求:call rate大于95％，在哈迪-温伯格平衡测试中P小于1×10^-5大于0.01,最小等位基因频率的测试中P大于0.01。B显示了在发现(GWAS)和复制群组的病例和对照样本的数量，并组合以产生一个荟萃分析数据集。

复制研究中我们将AAV病例和对照组中在Sequenom大规模阵列平台上进行iPLEX测定并在8个基因位点上对9个单核苷酸多态性进行了基因分型。我们使用Taqman单核苷酸多态性基因分型阵列(Applied Biosystems)将另外一个在PRTN3位点上的单核苷酸多态性(rs62132293)进行了基因分型，将质量控制设置为单核苷酸多态性检测率>95％和样品完成率>97％。这个方法可以发现与亚组疾病有高度相关性的SNPs，如我们在PR3-ANCA和MPO-ANCA亚组的复制研究中发现了一个单核苷酸多态性(rs7264431)表现出与PR3-ANCA高度的相关性，另外则有两个位于HLA-DQA1基因上的单核苷酸多态性表现出与MPO-ANCA高度的相关性，这次结果为我们设计AAV的基因分型提供了基础。

统计方法

统计功效分析

我们使用Quanto v1.2.4software(http://hydra.usc.edu/gxe/)计算GWAS的功效，参数设置如下：GPA患病率：30/1,000,000；次要等位基因频率：0.20；501个病例和1465个对照组；阿尔法(α)：小于5.00x 10^-8相当于在全基因组学研究中具有显着性水平，大于1.00x 10^-4则认为无明显意义。对于α＝5.00x 10^-8或者α＝0.0001，当检测关联的相对风险分别大于1.4和大于1.3时，效能评估分析为大于80％。在组合分析疾病病例和对照组样本时，α＝5.00x 10^-8，且p<0.0001，检测SNP关联相对风险小于1.25时，效能依然被评估为大于80％。

关联分析

我们采用EIGENSTRAT的方法进行主成分分析，病例对照关联研究使用1自由度的科克伦-曼特尔-亨塞尔测试来调整组间实验对象的分层并使用PLINKversion1.9进行分层聚类。为了保证分析方法的可信度，在主成分分析的基础上，我们调整了前三个特征向量进行了关联分析，在特征向量的调整前后显示最小膨胀率的Lambda值分别为1.012和0.991(图2)。在剔除没有通过质量控制的所有个体和单核苷酸多态性后,Y轴表示由EIGENSTRAT分析得到的–log10(p)值,X轴表示预计的–log10(p)值。基因组控制校正后，膨胀因子λ在特征向量调整前后是0.991与1.012。(A)–log10(p)值对于所有的GWAS SNPs。(B)在剔除HLA区域的SNPs后的–log10(p)值。

荟萃分析

采用Logistic回归分析的结果和PLINK v1.9的荟萃分析功能的应用来进行两个队列的荟萃分析，并使用逆差额加权来合并多个研究以达到固定效应分析。此外，我们采用类似比较等位基因频率的的方法，通过比较GPA和MPA以及PR3与MPO对ANCA的反应性来确定病例组之间是否存在差异。由于HLA区域的SNPs往往连锁不平衡，我们采用Logistic回归分析来评估SNPs在HLA区域中的作用、调节等位基因的相关性以获得SNPs在不同区域发挥的作用。异质性研究采用χ2科克伦的Q统计量进行分析。

插补

我们采用software package IMPUTE 2v2.3.2和1000Genomes Project Phase 3在4629个样本(已通过GWAS质量控制标准)中插补来自五大人群的2504个个体的全基因组序列数据(包含81,706,022SNPs,MNPs,插入和缺失)的额外SNPs到其全基因组数据中。在实施插补之前，我们从GWAS数据集中删除了样本检测率低于95％的SNPs和P值低于10^-5的数据。我们采用了千人基因组计划(GP)第三阶段(单倍体的发布时间为2014年10月)的1至22的染色体作为参考数据集，并使用千人基因组计划第一阶段(单倍体X染色体发布时间为2012年8月)的数据作为染色体X。运用SHAPEIT(shapeit.v2.r790.Ubuntu_12.04.4.static)插补全基因组数据“两步走”来推导分段基因型，并使用IMPUTEv2(impute_v2.3.2_x86_64_static)来执行分段数据的插补。我们使用用于导出分段基因型的默认参数以增加：i)优化原迭代次数；ii)优化精简后的迭代次数；iii)使用迭代数目计算单倍体概率我们使用的是～5Mb非重叠区间对全基因组进行了插补，并提供"-use_prephased_g"标志以表明预分的单倍型正在被使用。此外，我们排除了千人基因组计划内欧洲人和东亚人中最小等位基因频率低于0.001的变异体。使用选项"-pgs_miss"将被插补的基因型替换掉为分类SNPs中缺失的基因型。当插补缺失基因型达到800("-k_hap 800")时，参考单倍体将作为模板使用，且缓冲区域将增加到500kb("-buffer 500")。

在精细作图的区域，我们用IMPUTEv2插入了非基因分型数据但是没有为了提高插补精度在SHAPEIT中预调相。为此我们还增加了i)马尔科夫链蒙特卡洛(MCMC)迭代(包括burn-in)到50("-iter 50")的默认号码，ii)MCMC迭代次数15("-burnin 15")，以及iii)当观察到基因型调相到100("-k 100")时，作为模板的单倍体数量。

条件分析

基因分型/补差PTPN22，PRTN3，SERPINA1和HLA等位基因的条件分析被进行测试在区域内的多个独立效果。我们首先使用了逻辑回归框架来测试各等位基因之间的关联性，包括作为人口分层中协变量的前3个主成分。在识别一个最显着的标记之后，我们通过包含第一标记的用量作为一个协变量来测试其他额外协变量的独立影响。重复这个过程，调节所有独立的显着SNPs直到标记全基因组中的显着信号。同时我们对PLINK v1.9进行条件分析与基因分型数据，并进行SNPTEST v2.5.2分析与填补，并对所有的标记使用SAS version9.2的proc logistic模块共同分析，以获得优势比。

人群归因分数

在掺入多变量的SNPs Logistic回归模型中取比值比(ORs)，用于评估人群归因分数(PAF)，调节每个SNP的比值比。通过这些分析，我们建立了一套评估单一位点等位基因效应的人群归因分数(PAF)：

在此公式中，OR是与等位基因型相关联的比值比，PAF是风险变异体的等位基因的频率。

若用于多个位点的计算，这个公式则变成：

${\mathrm{PAF}}_{combined}=1-(\underset{1=1}{\overset{nolci}{\&Pi;}}1-({\mathrm{PAF}}_i\left)\right)$

随机森林分析

我们应用机器学习工具来评估等位基因组合的潜在作用可能对AAV带来的风险。首先，我们运用分类和回归树(CART)方法学去执行随机森林分析，分类树寻求评估可用数据的所有可能的分裂，来确定更准确的病例和对照组分离的关节点，从而通过logistic回归或者用其他统计模型选择过程搜索其他很难确定的变量组合。然而，分类树可能会过度拟合数据，因此我们需要首先使用一个随机森林的方法来减少需要考虑的变量数目。简要来说，呈现在表1中的10个变异体的数据取决于分类分析和用70％的样品和变量重复建立的回归树，以及用于分类剩余的30％的数据。这一分析的结果表明PTPN22和其中一种HLADQA2(rs7454108)变异体基本不能改善病例和对照的分类，然而其他变异体(rs9277341in HLA-DPA1,rs141530233in HLA-DPB1,rs1042169in HLA-DPB1,rs62132293in PRTN3,rs35242582in SERPINA1,rs104902in HLA-DQB1,and rs39981589inHLA-DQA2)都至少提高了3％的模型拟合，并且将全部数据保留下来并构建了最终的分类和回归树。随后我们用这些基因变异体来执行最终的CART分析。我们使用software programrpart和Gini index measure来确定数据的最佳分割，并设定复杂参数为0.001。仅这一部分中我们就精简至少20个观察对象，最终模型有73％的分类精度。

验证位点的功能注释

为了筛选候选基因和候选基因变异体，我们采用PICS算法(概率识别因果SNP)并以PICS概率>0.0275来识别风险基因变异体(http://www.broadinstitute.org/pubs/finemapping/？q＝pics)。阈值的采用与Farh etc.论文中描述的方法是一致的。然后我们用ENSEMBL Variant Predictor网络工具来注释这些变异体，并预测其功能(http://www.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html)。我们采用Genevar(ref),seeQTL(http://www.bios.unc.edu/research/genomic_software/seeQTL/)(ref)和芝加哥大学eQTL浏览器(http://eqtl.uchicago.edu/cgi-bin/gbrowse/eqtl/)在候选变种之间识别表达数量性状位点(eQTLs)。

定量PCR

外周血单核细胞(PBMC)和多形核白细胞通过Ficoll-Hypaque密度离心后使用氯化铵裂解缓冲液出去红细胞。RNA通过使用TRIzol(Invitrogen)和Direct-zol RNAMiniPrep试剂盒(Zymo)萃取，全过程均在无RNase条件下操作。逆转录实验使用500ng全RNA，并加入随机六聚体引物和SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen)。使用SYBR green和以下被验证为线性放大和通过测序表明可得到单一产物的引物对定量PCR(qPCR)进行检测:PRTN3(forward:ACAACTACGACGCGGAGAAC；reverse:ACGGAGGCACTGAGGTTG),COX5B(forward:ACTGGGTTGGAGAGGGAGAT；reverse:TGGAGATGGAGGGGACTAAA),HLA-DPB1(forward:CAGCCTGGATAGTCCTGTCA；reverse:ATGCCCACTCCACAGATGAT),and GAPDH(forward:ATGTTCGTCATGGGTGT GAA；reverse:GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT).)样品在ABI PRISM 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)中跑样，与使用2(ΔΔCt)公式计算内部相关的特定基因(COX5B for PRTN3and GAPDH for HLA-DPB1)的倍数变化。

流式细胞分析

通过Ficoll-Hypaque密度离心从全血中提取PBMCs，将其用PE-抗人CD19抗体(BDBiosciences)或APC-Cy7-抗人CD14抗体(BD Biosciences)的推荐浓度进行染色，同时与FITC-抗人HLA-DP(Leinco)抗体或与FITC-鼠抗人IgG(BD Biosciences)的同型对照抗体在室温下培养45分钟，洗涤，然后使用FACS Canto(BD Biosciences)流式细胞仪读取样本并用FlowJo软件进行数据分析。

酶联免疫测定实验

患者组和健康对照组的PBMCs重悬于含20％FBS的RPMI培养基中，接种2x10⁵细胞在预涂有抗人IFN-γ的单克隆抗体(eBioscience)的ELISPOT板上(96孔、PVDF膜)。细胞在37℃用10μg/ml的多肽或1μg/ml的ConA(Sigma)刺激24小时后，将板清洗，并将留于板中的细胞与生物素化的小鼠抗人IFN-γ抗体(eBioscience)，抗生物素蛋白HRP(eBioscience)和AEC溶液(BDTM ELISPOT)在使用浓度培养适宜时间后使用Immunospot reader(ImmunoSpot 3software,version 3.2；Cellular Technology Ltd,Cleveland,OH,USA)读取结果。

表2:复制研究和结合性关联分析的结果

CI＝置信区间；A del＝腺苷缺失；OR＝比值比；RAF＝风险等位基因频率

a Eigenstrat Pvalue,b PLINK Pvalues,c Pvalues用于综合GWAS分析,结合等位基因频率计数的科克伦-曼特尔-亨塞尔法被用于复制数据集的计算，d rs141530233是一个插入/缺失多态性,在核苷酸33048688位置上,风险基因型缺失腺苷残基,无风险基因型包含腺苷残基。

我们发现的与AAV疾病高度相关的易感基因和风险等位基因，包括MHC区域的HLA-DP基因、HLA-DQ基因和非MHC区域PRTN3、SERPINA1、PTPN22基因。其中HLA-DPB1、PRTN3和SERPINA1基因与cANCA阳性/GPA病人高度相关,与pANCA阳性/MPA病人没有显着相关性。而HLA-DQA2基因与pANCA阳性/MPA病人有显着相关性，与cANCA阳性/GPA病人没有显着相关性。因此，本发明拟采用基因检测方法检测AAV疾病GPA和MPA两种类型分别所特有的易感基因遗传标记物，通过HLA-DP三等位基因、PRTN3和SERPINA1等位基因来鉴定AAV疾病GPA类型，通过HLA-DQA2等位基因鉴定AAV疾病MPA类型。本基因检测方法特异性强和准确性高、灵敏性和检出率不受到疾病活动状态影响,可以从分子遗传学上明确地区分GPA和MPA两类疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同形式的替换，这些改进和等同替换得到的技术方案也应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒，其特征在于，包括肉芽肿性多血管炎基因和微小动脉炎基因SNP检测探针、多重PCR引物（序列见表1）、多重PCR反应液及杂交液与洗脱液。

2.根据权利要求1所述的多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒，其特征在于，包括四个小试剂盒，分别用于检测位于HLA-DPB1基因上rs1042169_F、rs141520233_F和rs386699872_F的SNP位点以及HLA-DQA2基因上rs3998158_F的SNP位点，每个小试剂盒内装有DNA抽提、PCR扩增、限制性内切酶酶切以及琼脂糖凝胶电泳步骤的相关试剂。

3.根据权利要求1所述的一种多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的HLA-DPB1和HLA-DQA2的扩增引物序列以及对应探针序列如下：

4.一种多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，分别通过以下两种方案多个步骤实现：

方案一：经典的Sanger法

1）扩增反应体系为：每50 ul中含5 ul的10倍扩增缓冲液、2 ul浓度为25mM的 Mg2+、2ul浓度为I0mM的dNIPs、l.5 ul浓度为10 uM的正向引物、1.5 ul浓度为10 uM的反向引物、0. 5 ul的HotStarTaq DNA聚合酶、2 ul 浓度为10 - 20 ng/ul 的DNA模板、余量为35.5ul 的加双蒸水；

2）扩增反应步骤为：先95°C反应15min，进入循环，循环中先94°C反应0. 5min，然后56°C反应0. 5min，然后72°C反应1min为一个循环，共反应35个循环然后72°C反应7min， 最后4 °C保存；

3）测序反应体系为：4ul的BigdyeV3. 1终结反应混合物、3ul的双蒸水、1ul浓度为10μΜ 的测序引物、, 2ul的 PCR 产物；

4）测序反应步骤为：先94°C反应 0. 5min，然后50°C反应0. 5min，然后60°C反应2.0min为一个循环，共反应30个循环；

5）Sanger测序PCR反应产物；

6）Sanger测序结果分析；

方案二：ARMS-PCR法

在多重PCR中同时扩增多达4个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在4个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型；

联合多重PCR扩增引物和单碱基延伸包括：

5.根据权利要求4所述的一种多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

a.PCR 扩增和延伸反应

1) 通过多重 PCR 扩增，获得靶序列扩增产物：分别在 384 孔里加入 1μl 基因组DNA(5 ng/μl), 4μl PCR 反应混合液；

反应条件为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 20 sec, 56 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 min, 45 个循环；72 ℃ 3 min；

2) 使用虾碱性磷酸酶处理扩增产物，除去扩增产物中的 dNTPs：在 384 孔中加入 2μl SAP 反应混合液，进行 SAP 反应，反应条件为：37 ℃ 40 min, 85 ℃ 10min；

反应完成后降至室温并 4 ℃保存；

3) 加入延伸引物进行单碱基延伸反应，在延伸引物 3’端连接一个与突变位点互补的碱基，获得小片段单链延伸产物；

在 384 孔中加入 2μl 单碱基延伸反应液及适量引物，进行单碱基延伸反应，反应条件为：94 ℃15 min;94 ℃20 sec, 56 ℃30 sec, 72 ℃1 min, 72 ℃3 min; 4 ℃保存；

b. 产物纯化和质谱上机

1） 使用阳离子交换树脂纯化延伸产物，除去延伸产物的阳离子；

在 384 孔中加入 16 μl 去离子水与 6 mg树脂进行脱盐处理；

2）用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）对纯化后的产物进行质谱检测；

c. 数据分析：使用 MassARRAY Typer 系统对HLA-DPB1三等位基因和HLA-DQA2等位基因信息进行数据分析。