CN106164296A - 用于预测对抗血管生成药的应答和癌症预后的分子诊断测试 - Google Patents

Abstract

用于选择是否向受试者施用抗血管生成治疗剂的方法，其包括以下步骤：测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平；从所述一种或多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则抗血管生成治疗剂是禁忌的。还提供了相关的预后方法和治疗方法。本发明特别适用于卵巢和结直肠癌。

Description

用于预测对抗血管生成药的应答和癌症预后的分子诊断测试

发明领域

本发明涉及可用于提供来自不同解剖部位的癌症的预后和引导其治疗的分子诊断测试。本发明包括从基因表达水平导出基因分类模型。一项应用是选择是否将某些治疗剂、如抗血管生成治疗剂施用于接受护理标准癌症疗法的受试者。另一项应用是将癌症患者划分成具有良好临床预后或不良临床预后的那些癌症患者。本发明提供可以在临床试验评价新治疗剂期间指导疗法选择以及为富集策略选择患者组的测试。本发明可以用作某些癌症的预后指标，所述癌症包括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤。可以从新鲜/冷冻的(FF)或福尔马林固定石蜡包埋的FFPE患者样品鉴定血管生成亚型。

背景

制药业不断地追求比目前施用药物更有效、更特异性或具有更少不良副作用的新药物治疗选项。正在持续不断地开发药物治疗替代品，因为人群内部的遗传变异性导致许多既定药物的有效性差异巨大。因此，虽然目前可获得广泛类型的药物治疗选项，但是在患者不反应的情况下总是需要更多的疗法。

传统上，医师使用的治疗范式是开具产生就治疗疾病而言可能的最高成功率的一线药物疗法。如果一线药物疗法无效，则开具替代性药物疗法。这种范式显然不是某些疾病的最好治疗方法。例如，在疾病如癌症中，首次治疗经常最重要并且为成功治疗提供最佳机会，因此选择最有效对抗特定患者疾病的初始药物的需求增加。

卵巢癌是西方国家全部妇科癌症中的主要死亡原因。这种高死亡率归因于大部分患者中在晚期阶段诊断。上皮卵巢癌(EOC)构成90％的卵巢恶性肿瘤并且划分成不同的组织学类别，包括浆液性、粘蛋白状、子宫内膜样、透明细胞、过渡、混合和未分化亚型。这些不同组织学源于不同病因学的证据日益增加。最近在用来划分上皮卵巢癌的方法学方面取得进展(McCluggage，W.G.“Morphological subtypes of ovarian carcinoma:a reviewwith emphasis on new developments and pathogenesis,”Pathology 2011Aug；43(5):420-32)。这种进展的结果之一是先前划归为子宫内膜样的许多肿瘤现划归为浆液性。

卵巢癌现行标准治疗是减积手术和基于铂紫杉烷的标准细胞毒化疗。但是，并非全部患者均响应于这种疗法，并且占约70％的那些患者将遭遇复发。基于组织学或分子分类的卵巢癌特异性靶向疗法尚未上市。类似地，对于其他类型的癌症，仍然不存在选择适当细胞毒化疗药的精确方式。

微阵列和分子基因组学的到来具有显著影响诊断能力和疾病预后分类的潜力，这可能有助于预测个体患者对确定的治疗方案的反应。微阵列提供对大量遗传信息的分析，因而提供个体的遗传指纹。存在这项技术最终将为定制药物疗法方案提供必需的工具的巨大热情。

目前，医疗保健专业人员拥有帮助他们确定将从化疗药得益的癌症患者的少数机制。鉴定最佳一线药物是困难的，因为不可获得精确预测哪种药物治疗将对特定癌症生理学最有效的方法。这种匮乏导致相对差的单药响应速度和癌症发病和死亡增加。另外，患者经常不必要地接受无效、有毒的药物疗法。

血管生成是肿瘤新血管化的关键组分并且是肿瘤形成和转移必需的。因而，它是治疗性介入的关键领域并且已经与不良预后和存活减少关联。这已经促进开发多种靶向血管生成相关过程和途径的药物，包括Genentech/Roche生产的市场领先者和首个FDA批准抗血管生成药-贝伐珠单抗(Avastin)。

包含贝伐珠单抗的治疗方案已经展示广泛的临床活性^1-10。但是，尚未在大多数癌症中在添加贝伐珠单抗至细胞毒化疗后显示总生存期(OS)益处^8,12-13。这表明大比例的肿瘤一开始就耐药或迅速形成对VEGF阻断作用(贝伐珠单抗的作用机理)的抵抗性。实际上，当接受贝伐珠单抗单药疗法时，21％卵巢癌患者、10％肾癌患者和33％直肠癌患者显示部分消退，从而显示贝伐珠单抗可能在少数患者亚组有效，但是这类递增益处在未选择的患者中并未达到显著^15-18。因此，对贝伐珠单抗的反应的生物标志物的使用将改善治疗结果的评估，因此能够确定会从贝伐珠单抗治疗接受最大临床益处的患者亚组。这在转移性乳腺癌的情况下将是特别有意义的，其中不存在临床有益的生物标志物已经削弱贝伐珠单抗的应用。迄今，尚未经临床验证这类生物标志物以预测贝伐珠单抗的功效。高血压和VEGF多态性迄今是显示潜力的仅有生物标志物，但仍存在关于它们在临床环境下使用的重要问题。

抗血管生成疗法的另一种方法是同时靶向多条生血管途径，而非选择性靶向VEGF途径。理论上，多靶向抗血管生成剂应当比如贝伐珠单抗之类的药物更彻底地抑制血管生成并且因此可能产生更大的治疗益处。已经推测在某些肿瘤中，血管生成可能仅在疾病早期需要VEGF，但随着疾病进展受额外的生血管途径驱动。因此，通过靶向多条途径，可以对抗可能导致抵抗VEGF抑制作用的代偿性逃避机制。

对其他类型的癌症，仍然不存在选择哪些患者将响应或将不响应于抗血管生成治疗性疗法或抗血管生成单药疗法标准护理的精确方式。

因此需要这样一种分子诊断测试，所述测试将基于患者对联合标准护理或作为单药治疗剂的抗血管生成治疗剂的预期反应，促进患者分类。这将允许快速鉴定应当接受替代疗法的那些患者。这种分子诊断测试应当预示以足够的准确度预示不同癌症类型之间的治疗响应性。

发明概述

公开了使用癌症中表达的一种或多种生物标志物或生物标志物集合的方法，其鉴定与涉及免疫反应的分子信号传导的上调和涉及血管生成和血管发育的分子信号传导的下调相关的癌症亚型，在本文中被称为“无血管生成”或“免疫”亚型。生物标志物集合可以由表达特征标识(expression signature)限定，并且表达特征标识用来向生物标志物集合的测量表达值赋予累积得分。在不同方面，生物标志物和表达特征标识可以形成单参数或多参数预测检验的基础，可以使用本领域已知的方法如微阵列、下一代测序(NGS)、Q-PCR、免疫组织化学、ELISA或可以定量mRNA或蛋白质表达的其他技术，发布所述检验。

此外，本文所述的癌症亚型是许多类型的癌症共有的并且不限于单一癌症疾病类型。因此，本发明的表达特征标识不限于单一癌症类型。在某些示例实施方案中，无血管生成表达特征标识包含选自表1中列出的生物标志物的两种或更多种生物标志物。在另一个示例实施方案中，无血管生成表达特征标识包含表2或3中列出的两种或更多种生物标志物。在某些其他示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2PA、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3和TMEM45A中的一种或多种。在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。在另一个示例实施方案中，无血管生成特征标识包含表2中列出的生物标志物和它们如使用PLS分类器(classifier)所确定的相应权重。在另一个示例实施方案中，无血管生成特征标识包含表3中列出的生物标志物和它们在判定功能内的相应等级。

在一个方面，本发明提供了用于选择是否向受试者施用抗血管生成治疗剂的方法，其包括：测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平；从所述一种或多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则抗血管生成治疗剂是禁忌的。在某些实施方案中，评价所述样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括：测定一种或多种生物标志物的样品表达得分；将样品表达得分与阈值得分进行比较；和确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。在进一步实施方案中，所述受试者正在接受或已经接受化疗剂的治疗。

在一个进一步方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向受试者施用化疗剂且不施用抗血管生成治疗剂，其中基于如本文所述的方法选择受试者用于治疗，且所述受试者对于所述生物标志物特征标识是阳性的。根据本发明的一个进一步方面，提供了治疗癌症的方法，其包括向受试者施用化疗剂且不施用抗血管生成治疗剂，其中通过测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平来选择受试者用于治疗；从所述生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则选择受试者用于治疗。在又一个进一步方面，本发明涉及用于治疗受试者中的癌症的化疗剂，其中受试者基于如本文所述的方法被选择用于治疗，且对于所述生物标志物特征标识是阳性的，且其中所述受试者不用抗血管生成治疗剂治疗。本发明还涉及用于治疗受试者中的癌症的化疗剂，其中通过测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平来选择受试者用于治疗；从所述生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则选择受试者用于治疗，且其中所述受试者不用抗血管生成治疗剂治疗。在一个进一步方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括向受试者使用化疗剂，其中受试者对于通过选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平定义的生物标志物特征标识是阳性的，且其中不施用抗血管生成治疗剂。在又一个进一步方面，本发明涉及用于治疗受试者中的癌症的化疗剂，其中受试者对于通过选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平定义的生物标志物特征标识是阳性的，且其中所述受试者不用抗血管生成治疗剂治疗。在某些实施方案中，所述化疗剂包含基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物(如5FU)、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。所述化疗剂可以包含基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。在具体实施方案中，所述化疗剂包含卡铂和/或紫杉醇。所述化疗剂可以反映癌症的护理治疗标准。所述护理治疗标准对于不同类型的癌症可以是不同的-例如卵巢癌中的卡铂，结直肠癌中的5-FU，头颈癌中的铂。根据本发明的所有方面，评价样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的可以包括测定一种或多种生物标志物的样品表达得分；将样品表达得分与阈值得分进行比较；和确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。根据本发明的所有方面，所述受试者可以正患有癌症。所述癌症可以是卵巢癌，任选高级浆液性卵巢癌。本文中，“施用”药剂与用药剂“治疗”互换使用。

根据本发明的一个进一步方面，提供了用于确定具有癌症的受试者的临床预后的方法，其包括：测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平；从所述一种或多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则所述受试者具有良好预后。评价所述样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的可以包括：测定生物标志物的样品表达得分；将样品表达得分与阈值得分进行比较；和确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。在某些实施方案中，良好预后表明与生物标志物特征标识阴性的样品相比，任选地与样品表达得分低于阈值得分的样品相比，增加的无进展存活率或总存活率。在某些实施方案中，所述受试者正在接受、已经接受和/或将接受化疗治疗和/或将不接受用抗血管生成治疗剂的治疗。所述化疗治疗可以包括施用基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。所述化疗治疗可以包括施用基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。在具体实施方案中，所述化疗治疗包括施用紫杉醇和卡铂。所述癌症可以是卵巢癌或结直肠癌。

在一个进一步方面，本发明涉及用于选择是否向受试者施用贝伐珠单抗的方法，其包括：在从患有卵巢癌的受试者获得的测试样品中，所述受试者正在、已经和/或将使用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗；测量选自表2的生物标志物中的一种、两种或更多种、最多达所有的表达水平；从一种、两种或更多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，基于所述样品对于生物标志物特征标识是否是阳性的来选择治疗，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则贝伐珠单抗是禁忌的。在某些实施方案中，评价样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括测定一种、两种或更多种生物标志物的样品表达得分；将样品表达得分与阈值得分进行比较；和确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。

本发明还涉及用于确定受试者的临床预后的方法，其包括：(a)在从患有卵巢癌的受试者获得的测试样品中，所述受试者正在、已经和/或将使用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗；(b)测量选自表2或表3的生物标志物中的一种或多种、最多达所有的表达水平；(c)从所述一种或多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则所述受试者具有良好预后。评价所述样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的可以包括：(i)测定一种或多种生物标志物的样品表达得分；(ii)将样品表达得分与阈值得分进行比较；和(iii)确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。在某些实施方案中，良好预后表明与生物标志物特征标识阴性的样品相比，任选地与样品表达得分低于阈值得分的样品相比，增加的无进展存活率或总存活率。

根据本发明的所有方面，可以测量来自受试者的样品中选自表2或表3的两种或更多种生物标志物的表达水平。可以测量来自受试者的样品中选自表2或表3的五种或更多种生物标志物的表达水平。评价所述样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的可以包括使用分类树或随机森林。

分类树(Breiman,Leo；Friedman,J.H.；Olshen,R.A.；Stone,C.J.(1984).Classification and regression trees.Monterey,CA:Wadsworth&Brooks/ColeAdvanced Books&Software.ISBN 978-0-412-04841-8)提供了基于逻辑和规则预测结果的方式。通过被称为二进制递归分割(这是将数据分成分区/分支的迭代过程)的过程建立分类树。目标是建立区别预定义的类别的树。树中的每个节点对应于变量。为了选择在节点处的最佳分割，进而考虑每个变量，其中尝试和考虑每一可能的分割，并且最佳分割是在每个分区内的分类标记的多样性中产生最大减少的分割。将其针对所有变量进行重复，并且选择胜者作为用于该节点的最佳分割器。在下一节点且以该方式继续该过程，生成完整树。分类树相对于其他监督学习方法如判别分析的优点之一是，用于构建树的变量可以是分类的，或数值的，或两者的混合物。以该方式，可以生成用于基于基因表达的方向性预测结果的分类树。随机森林算法(Breiman,Leo(2001)."Random Forests".Machine Learning 45(1):5-32.doi:10.1023/A:1010933404324)提供了对分类树的进一步延伸，由此随机生成分类树的集合以形成“森林”，并且从每个树预测的结果的平均值用于进行关于该结果的推理。

在一个方面，提供了用于使用本文中公开的表达特征标识选择是否向受试者施用抗血管生成治疗剂的方法，所述方法包括从受试者获得测试样品，从测试样品测量生物标志物组的表达水平，测定生物标志物组的样品表达得分；将样品表达得分与阈值得分进行比较，和基于表达得分是否等于或高于阈值而选择治疗。在某些示例实施方案中，样品表达得分等于或高于阈值得分表明抗血管生成剂是禁忌的且不应施用于受试者。在某些示例实施方案中，低于阈值得分的样品表达得分表明抗血管生成剂不是禁忌的且可以施用于受试者。如果癌症的生长速率与不与治疗剂接触的其生长相比由于与治疗剂接触而加快，则治疗剂对于患者是“禁忌的”或“有害的”。可以以各种方式测量癌症的生长。例如，肿瘤的大小，或测量对于该肿瘤类型适当的肿瘤标志物的表达。如果治疗剂的施用降低患者的总体预后(无进展存活率和总存活率)，则治疗剂也可以被认为是“禁忌的”或“有害的”。在一个示例实施方案中，本文中公开的表达特征标识可以确定在遵循标准癌症疗法施用抗血管生成剂后的患者的临床预后。

在某些示例实施方案中，所述受试者患有癌症。所述癌症可以包括，但不限于，卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，胶质母细胞瘤，肾癌，包括肾细胞癌，肝细胞癌，甲状腺癌，胰腺癌，神经内分泌癌，食道癌，胃肠道间质瘤(GIST)，胃癌，肝癌，包括成人原发性肝癌，淋巴瘤，黑色素瘤，或多发性骨髓瘤。在某些示例实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些其他示例实施方案中，所述卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。在某些示例实施方案中，所述患者可能已经接受、正在接受和/或将接受治疗，所述治疗可以是受试者的癌症类型的护理治疗标准。在某些示例实施方案中，该可以是护理治疗标准的治疗可以包括用化疗剂治疗。所述化疗治疗可以包括施用基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。在某些示例实施方案中，所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。在某些其他示例实施方案中，所述化疗治疗包括施用卡铂和紫杉醇。在一个示例实施方案中，所述受试者具有高级浆液性卵巢癌，且先前已经接受基于铂的化疗剂和有丝分裂抑制剂。在另一个示例实施方案中，所述受试者具有高级浆液性卵巢癌，且先前已经接受卡铂和紫杉醇。所述抗血管生成治疗剂可以是靶向VEGF-途径的治疗剂(如贝伐珠单抗或阿柏西普(aflibercept))，血管生成素-TIE2途径抑制剂，内源性血管生成抑制剂或免疫调节剂。在一个示例实施方案中，所述抗血管生成治疗剂是靶向VEGF-途径的治疗剂。在另一个示例实施方案中，所述抗血管生成治疗剂是贝伐珠单抗。

在另一个方面，提供了用于使用本文中公开的表达特征标识选择受试者的临床预后的方法，所述方法包括从受试者获得测试样品，从测试样品测量生物标志物组的表达水平，测定生物标志物组的样品表达得分；将样品表达得分与阈值表达得分进行比较，其中如果所述表达得分等于或高于阈值表达得分，则临床预后是良好预后。在某些示例实施方案中，良好预后表明与表达得分低于阈值得分的受试者相比增加的存活率。在某些示例实施方案中，所述受试者患有癌症。所述癌症可以包括，但不限于，卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌或胶质母细胞瘤。在某些示例实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些其他示例实施方案中，所述卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。在某些示例实施方案中，所述受试者可以接受、已经接受和/或将接受化疗治疗。所述化疗治疗可以包括施用基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。在某些示例实施方案中，所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。在某些其他示例实施方案中，所述化疗治疗包括施用卡铂和紫杉醇。在一个示例实施方案中，所述受试者具有高级浆液性卵巢癌，且可以接受、已经接受和/或将接受基于铂的化疗剂和有丝分裂抑制剂，如紫杉烷。在另一个示例实施方案中，所述受试者具有高级浆液性卵巢癌，且可以接受、已经接受和/或将接受卡铂和紫杉醇。

在另一个方面，本发明涉及用于上文所列常规诊断用途如qPCR、NGS、微阵列和免疫测定法如免疫组织化学、ELISA蛋白质印迹法等的试剂盒。这类试剂盒包含分析基因或基因产物表达和定量mRNA或蛋白质表达的适当试剂和说明书。

还公开了用于鉴定具有或没有无血管生成表型的人肿瘤的方法。在某些示例实施方案中，这类方法可以用来鉴定对药物敏感并对药物有反应的患者，其中所述药物直接或间接抑制涉及血管生成的过程。在某些其他示例实施方案中，这类方法可以用来鉴定对药物抵抗或对药物不反应或将以不利方式反应的患者，其中所述药物直接或间接抑制涉及血管生成的过程。

本发明还涉及指导有效治疗患者。另外，提供涉及选择患者治疗方案和为当前临床试验或直接或间接影响血管生成的开发阶段药物选择患者的方法。

此外，本文中描述了允许使用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的归档活组织检查材料以及新鲜/冷冻(FF)的组织以分析全部转录物并因此与大部分广泛可获得类型的活组织检查材料相容的方法。可以使用从FFPE组织、新鲜的冷冻组织或已经在溶液如中贮存的新鲜组织所获得的RNA，确定生物标志物表达水平。

附图简述

图1提供了显示265份高级浆液性卵巢癌中的基因表达数据的无监督层次聚类分析的热图。每一列表示一个肿瘤中这些探针组的表达。水平表示所有聚类间的探针组表达。热图上方的条通过如说明框中所述的聚类颜色编码。第二条针对类别标记进行颜色编码，如说明框中所述。对应于各探针组聚类的功能过程被标记于该图的右侧。

图2提供了来自265份高级浆液性卵巢癌中的基因表达的无监督分析的通过聚类的总存活率的Kaplan-Meier分析。

图3提供了通过爱丁堡(发现)数据集中的63-基因特征标识分类器定义的两个类别的存活率的Kaplan-Meier分析。促血管生成组由血管生成(Angio)和血管生成-免疫(Angioimmune)亚组。A.无进展存活率。B.总存活率。

图4提供了通过Tothill(验证)数据集中的63-基因特征标识分类器定义的两个类别的存活率的Kaplan-Meier分析。促血管生成组由血管生成(Angio)和血管生成-免疫(Angioimmune)亚组。A.无进展存活率。B.总存活率。

图5提供了ICON7试验组群中的患者的免疫(图5A)和促血管生成(图5B)亚组中的无进展存活率的Kaplan Meier曲线。在每个图内，显示跨越2个随机化治疗组间的存活率差异：1)卡铂加上紫杉醇化疗和2)卡铂加上紫杉醇化疗加上贝伐珠单抗。

图6提供了ICON7试验组群中的患者的免疫(图6A)和促血管生成(图6A)亚组中的总存活率的Kaplan Meier曲线。在每个图内，显示跨越2个随机化治疗组间的存活率差异：1)卡铂加上紫杉醇化疗和2)卡铂加上紫杉醇化疗加上贝伐珠单抗。

图7提供了通过63基因特征标识定义的卡铂和紫杉醇治疗的ICON7试验患者的无进展生存期(A)和总生存期(B)的Kaplan Meier曲线。

图8A和8B是表明如适用于结直肠癌样品的示例非血管生成特征标识的特定分类性能基准的图。

图9：特征标识开发：CV下的训练集的AUC。

图10：特征标识开发：CV下的训练集的C-指数。

图11：特征标识开发：CV下的训练集的HR。

图12：特征标识开发：CV下的ICON7SOC样品的HR。

图13：特征标识开发：CV下的ICON7SOC样品的C-指数。

图14：特征标识开发：CV下的ICON7免疫样品的HR。

图15：特征标识开发：CV下的ICON7ProAngio样品的HR。

图16：核心集合分析：Immune63GeneSig_CoreGenes_Internal Val.png。

图17：核心集合分析：Immune63GeneSig_CoreGenes_Tothill.png.

图18：核心集合分析：Immune63GeneSig_CoreGenes_ICON7_SOC.png。

图19：最小基因集合分析：Immune63GeneSig_MinGenes_Tothill.png。

图20：ICON7SOC：最小基因集合分析：Immune63GeneSig_MinGenes_ICON7_SOC.png。

图21：ICON7免疫：最小基因集合分析：Immune63GeneSig_MinGenes_ICON7_Immune.png。

图22：显示通过63基因特征标识预测为血管生成-关(Angio-Off)(无活性)的样品相比于预测为血管生成-开(Angio-On)(活性)的样品之间的无进展存活概率的差异的Kaplan Meier。

图23：使用血管生成定义基因列表对Marrisa等人(2013)公开的529份CRC样品的半监督层次聚类分析。

图24：显示Marissa CRC数据中的血管生成活性亚型和血管生成无活性亚型之间的63基因特征标识得分的区别的ROC曲线。

图25：显示如通过GSE14333CRC数据中的63基因特征标识所预测血管生成活性和血管生成无活性患者(仅治疗的)之间的存活率差异的Kaplan Meier曲线。

发明详述

除非另外定义，本文中所用的技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：Benjamin Lewin,Genes IX,2008年Jones和Bartlet出版(ISBN 0763752223)；Kendrew等人,(编著),The Encyclopedia of Molecular Biology,1994年Blackwell Science Ltd.出版(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(编著),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,1995年VCH Publishers,Inc.出版(ISBN 9780471185710)；Singleton等人,Dictionary of Microbiology and MolecularBiology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)以及March,Advanced OrganicChemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)。

除非上下文另外清楚地指出，单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数称谓。类似地，除非上下文另外清楚地指出，词语“或”意指包括“和”。术语“包含”意指“包括”。在矛盾的情况下，本说明书(包括术语的解释)将居主导。

如本文所用，术语“生物标志物组”、“表达分类器”、“分类器”、“表达特征标识”或“特征标识”可以互换地使用。所述组通常包括多种生物标志物，但可以仅包括单一生物标志物，其中该生物标志物单独可用于本发明的方法中。

全部出版物、公开的专利文献和在本申请中援引的专利申请显示本申请所属领域的技术水平。全部出版物、公开的专利文献和本文中援引的专利申请因而通过引用的方式以相同程度并入本文，如同通过引用方式专门且独自地并入每份单独的出版物、公开的专利文献或专利申请。

概述

当前癌症研究努力的主要目的是通过将分子参数并入临床治疗决策，增加围术期全身性疗法在患者中的疗效。药物遗传学/基因组学是涉及个体对外来化合物或药物反应的遗传/基因组因素的研究。对本发明生物标志物表达具有刺激性或抑制性作用的药物或调节物可以向个体施用以(预防或治疗性)治疗患者中的癌症。理想的是结合这种治疗，还考虑该个体的药物基因组学。治疗剂代谢的差异有可能因改变药理活性药物的剂量和血液浓度之间的关系而导致严重毒性或治疗失败。因此，理解个体的药物基因组学允许选择有效药剂(例如，药物)用于预防性或治疗性治疗。这种药物基因组学还可以用来确定适当的剂量和治疗方案。因此，可以确定个体中本发明生物标志物的表达水平，以便因而选择适当药剂用于个体的治疗性或预防性治疗。

本发明涉及可用于诊断来自不同解剖部位的癌症的分子诊断测试，其包括使用与血管生成相关的一种或多种常见亚型。本发明包括将受试者鉴定为具有良好或不良临床预后的表达特征标识，和表明是否向受试者施用抗血管生成治疗剂的表达特征标识。通过从病理学和/或临床结果已知的样品集合获得样品的表达概况，导出该表达特征标识。样品可以源自相同的样品组织类型或不同的组织类型。如本文所用，“表达概况”包含一组值，所述值代表从给定样品分析出的每种生物标志物的表达水平。

随后使用数学模型分析来自样品集合的表达概况。不同数学模型可以应用并且包括但不限于来自以下领域的模型：模式识别(Duda等人,Pattern Classification,第2版,John Wiley,New York 2001)、机器学习(等人,Learning with Kernels,MITPress,Cambridge 2002,Bishop,Neural Networks for Pattern Recognition,ClarendonPress,Oxford 1995)、统计学(Hastie等人,The Elements of Statistical Learning,Springer,New York 2001)、生物信息学(Dudoit等人,2002,J.Am.Statist.Assoc.97:77-87,Tibshirani等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6567-6572)或化学计量学(Vandeginste等人,Handbook of Chemometrics and Qualimetrics,Part B,Elsevier,Amsterdam 1998)。数学模型鉴定一种或多种在样品集合中表达的最能预示给定疾病表型的生物标志物。一种或多种这些生物标志物限定一个表达特征标识。因此，表达特征标识包含被鉴定为最能预示给定疾病表型的生物标志物。在某些示例实施方案中，该数学模型为每种鉴定生物标志物定义变量，如权重。在某些示例实施方案中，该数学模型定义决策函数。决策函数还可以定义将样品集合分成两个疾病表型(如，但不限于具有良好和不良临床预后的样品)的阈值得分。在一个示例实施方案中，线性分类器限定决策函数和表达特征标识。

为了使用限定的表达特征标识将新样品分类，分离由该表达特征标识定义的生物标志物(也称为生物标志物组)并且确定该生物标志物组的表达概况。以用来定义该表达特征标识的相同数学模型分析新样品的生物标志物组表达概况。所述生物标志物组可以包含通过表达特征标识定义的生物标志物中的一种或多种。所述生物标志物组可以包含通过表达特征标识定义的生物标志物中的一种或多种。在某些示例实施方案中，所述生物标志物组包含表2中列出的生物标志物中的一种或多种。在某些其他示例实施方案中，所述生物标志物组包含表2中列出的所有生物标志物。在某些示例实施方案中，所述生物标志物组包含表2中列出的生物标志物中的一种或多种。在某些其他示例实施方案中，所述生物标志物组包含表2中列出的所有生物标志物。在某些示例实施方案中，该数学模型限定新样品的表达得分。可以通过使用非线性、几何、三角学或相关手段，将生物标志物的表达值与相应标量权重合并以导出单个标量值，确定该表达得分。将该表达得分与阈值得分比较并且基于表达得分是否大于或等于、或小于阈值得分，将样品分类。在某些示例实施方案中，等于或大于阈值得分的样品表达得分表明受试者具有良好预后，且低于阈值得分的样品表达得分表明受试者具有不良的临床预后。在某些示例实施方案中，等于或大于阈值得分的样品表达得分表明受试者具有所述特征标识。这可以表明良好的临床预后。低于阈值得分的样品表达得分表明受试者不具有特征标识。这可以表明不良的临床预后。

本文中公开的表达特征标识的一项应用是鉴定具有良好和不良临床预后的患者。良好或不良预后可以特定治疗背景(如卡铂/紫杉醇，如本文所讨论)的上下文中确定。例如，所述受试者可以正在接受或已经接受用于受试者的癌症类型的标准化疗治疗。考虑到治疗背景，本文中公开的表达特征标识还可以用于确定是否应当向患者施用额外治疗剂如抗血管生成治疗剂。通过检查肿瘤中至少一种鉴定的生物标志物、任选鉴定的生物标志物的集合的表达，可能确定患者的可能临床结果。通过检查至少一种生物标志物、任选生物标志物的集合的表达，因此可能鉴定最需要更激进治疗方案的那些患者并且同样消除不必要的治疗性疗法或不可能显著改善或可能损害患者临床结果的那些疗法。本发明涉及使用至少无进展存活率和总存活率预测临床预后。因此，“良好预后”表明具有与其他癌症亚型相比表明增强存活率的癌症亚型的受试者群体，而“不良预后”或“较差预后”表明具有与其他癌症亚型相比表明降低存活率的癌症亚型的受试者群体。可以考虑的额外预后因素是种族性和人种、年龄、疾病阶段、组织学、肿瘤等级、肿瘤标志物(例如，CA125)、位点特异性外科疗法、残余疾病的尺度和肿瘤应答。在某些示例实施方案中，将表达得分等于或高于阈值得分的受试者分类为具有无血管生成亚型。在另一个示例实施方案中，将样品表达得分高于阈值得分的受试者分类为具有良好临床预后。在又另一个示例实施方案中，样品表达得分高于或等于阈值得分的受试者表明，如果施用抗血管生成治疗剂，受试者将可能经历不利影响，或具有较差临床预后。

在某些示例实施方案中，受试者的临床预后的确定或额外治疗剂的选择可以在过去、目前或计划的化疗治疗的背景下作出。例如，受试者可以设置为开始，目前正在接受，或已经刚刚完成，用于受试者的癌症类型的护理化疗治疗标准。在某些示例实施方案中，所述化疗治疗可以包括施用烷基化剂、抗代谢物、基于铂的药物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇、基于激素的治疗剂或其组合。示例性烷化剂包括氮芥类、亚硝基脲类、烷基磺酸盐类、三嗪类和乙烯亚胺类。示例性铂药物包括顺铂、卡铂和奥沙利铂。示例性抗代谢物包括5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁和硫鸟嘌呤。示例性抗肿瘤抗生素包括柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、放线菌素-D、博莱霉素、丝裂霉素-C和米托蒽醌。示例性拓扑异构酶抑制剂包括拓扑替康、伊立替康、依托泊苷和替尼泊苷。示例性有丝分裂抑制剂包括紫杉烷类、埃博霉素类、长春花生物碱类和雌莫司汀。示例性皮质类固醇包括强的松、甲基强的松龙和地塞米松。在某些示例实施方案中，所述化疗可以包括用以下治疗：L-门冬酰胺酶、伊马替尼、吉非替尼、舒尼替尼、硼替佐米、视黄醇、维甲酸、bexaroten、三氧化二砷、fluvestrant、他莫昔芬、托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、孕激素类、雌激素类、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、gonadotropoin释放激素激动剂或类似物、利妥昔单抗、阿仑珠单抗、BCG、白介素-2、干扰素-α、沙利度胺和来那度胺。

在某些示例实施方案中，所述化疗治疗可以包括环磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶(CMF)治疗方案，环磷酰胺、阿霉素和氟尿嘧啶(CAF)治疗方案，表柔比星和环磷酰胺(EC)治疗方案，氟尿嘧啶、表阿霉素和环磷酰胺(FEC)治疗方案，紫杉醇和环磷酰胺治疗方案，紫杉醇和卡铂治疗方案，多柔比星和环磷酰胺治疗方案，或阿霉素和紫杉醇治疗方案。在一个示例实施方案中，肿瘤辅助癌症疗法包含基于铂的化疗治疗方案。在一个示例实施方案中，基于铂的化疗治疗方案包含紫杉醇和卡铂。

本文中公开的表达特征标识的另一项应用是将针对涵盖抗血管生成疗法的治疗药物类别的反应分类并针对治疗药物类别选择这些患者。通过检查肿瘤中一组已鉴定生物标志物的表达，可以确定哪种治疗药或药物组合将最有可能减少癌症生长速率。还可以确定哪种治疗药或药物组合将最不可能减少癌症生长速率和/或哪种可以引起不良影响且因此是禁忌的。通过检查一组生物标志物的表达，因此可能消除无效或不适当的治疗药。重要地，在某些实施方案中，可以基于每位患者或基于每种药物进行这些确定。因此，可以决定特定治疗方案是否有可能有益于特定患者或患者类型，和/或特定方案是否应当继续进行。本发明提供可以在临床试验评价新治疗剂期间指导疗法选择以及为富集策略选择患者组的实验。例如，当评价推定性抗血管生成药或治疗方案时，本文所公开的表达特征标识和方法可以用来为临床试验选择具有响应于抗血管生成剂的癌症亚型的个体。

如果与不接触治疗剂时的癌症生长相比，癌症的生长速率因接触于治疗剂被抑制，则这种癌症“响应于”该治疗剂。可以按多种方式测量癌的生长。例如，肿瘤的大小或测量适用于该肿瘤类型的肿瘤标记的表达。在一个示例实施方案中，本文所公开的表达特征标识可以确定在遵循用于患者的癌症类型的护理化疗疗法标准施用抗血管生成剂后的患者的临床预后。

与不接触治疗剂时的癌症生长相比时，癌症的生长速率不因接触于治疗剂被抑制或被抑制到极低程度，则这种癌症“不响应于”该治疗剂。如上文所述，可以按多种方式测量癌症的生长，例如，肿瘤的大小或测量适用于该肿瘤类型的肿瘤标记的表达。不响应于治疗剂的性质是一种高度变异的性质，不同的癌症在不同条件下针对给定治疗剂显示不同水平的“无响应性”。另外，可以使用肿瘤生长尺寸之外的额外标准评估无响应性的量值，但不限于患者生活质量和转移程度。

可以从新鲜/冷冻的(FF)或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的患者样品鉴定血管生成亚型。在一个示例实施方案中，癌症类型是卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌或胶质母细胞瘤。在另一个示例实施方案中，癌症类型是卵巢癌。在又一个示例实施方案中，癌症类型是乳腺癌。在另一个示例实施方案中，癌症类型是肺癌。在另一个示例实施方案中，癌症类型是结肠癌。在另一个示例实施方案中，癌症类型是前列腺癌。在另一个示例实施方案中，癌症类型是胶质母细胞瘤。

鉴定表达特征标识

通过分析患者样品集合中某些生物标志物的表达概况鉴定本发明的表达特征标识。适用于本发明中的生物标志物包括DNA、RNA和蛋白质。在一个示例实施方案中，适合于用于本发明中的生物标志物包括RNA和cDNA。从患者样品分离生物标志物并且测定它们的表达水平以导出患者样品集合中分析的每份样品的一组表达概况。在某些示例实施方案中，表达特征标识鉴定癌组织中观察到的无血管生成表型，其被鉴定为生物标志物组合的高于或等于阈值的特征标识得分，所述表型以免疫反应相关的基因的上调和与血管生成和血管发育相关过程相关的基因的下调为特征。

a.表达概况

在某些实施方案中，获得的表达概况是基因组或核酸表达概况，其中测定一种或多种核酸在样品中的量或水平。在这些实施方案中，经分析以产生诊断方法或预测方法中使用的表达概况的样品是核酸样品。核酸样品包括核酸群体包含正在分析的细胞或组织的表型决定性生物标志物的表达信息。在一些实施方案中，核酸可以包括RNA或DNA核酸，例如，mRNA、cRNA、cDNA等，只要样品保留获得该核酸的宿主细胞或组织的表达信息即可。样品可以如本领域已知，以众多不同方式制备，例如，通过从细胞分离mRNA，其中使用分离的mRNA作为分离、扩增或使用以制备cDNA、cRNA等，如差异性基因表达领域中已知。因此，测定样品中mRNA的水平包括从mRNA制备cDNA或cRNA并随后测量cDNA或cRNA。一般从需要治疗的受试者中收获(例如，使用标准方案通过组织活检)的细胞或组织制备样品，其中可以从中生成这类核酸的细胞类型或组织包括其中存在待确定表型的表达模式的任何组织，包括但不限于疾病细胞或组织、体液等。

可以使用任何便利方案从初始的核酸样品生成表达概况。尽管已知产生表达概况的多种不同方式，如差异性基因表达/生物标志物分析领域中所用的那些，但是一种生成表达概况的代表性和便利方案类型是基于阵列的基因表达概况生成方案。这类应用是杂交测定法，其中使用这样的核酸，所述核酸对待生成的图谱中待测定/概况分析的每个基因展示“探针”核酸。在这些测定法中，首先从正在分析的初始核酸样品制备靶核酸样品，其中制备可以包括用标志物(例如，信号产生系统的成员)标记靶核酸。在制备靶核酸样品之后，将样品与阵列在杂交条件下接触，因而在与连接至阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。随后定性或定量检测杂交的复合物的存在。可以实施以生成主题方法中所用表达概况的特异性杂交技术包括在以下文献中描述的技术：美国专利号5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；所述专利的公开内容所述文献通过引用的方式并入本文；以及WO 95/21265；WO 96/31622；WO 97/10365；WO 97/27317；EP 373 203；和EP785 280。在这些方法中，“探针”核酸阵列与如上文所述的靶核酸接触，所述阵列包含正在确定其表达的每种生物标志物的探针。在杂交条件(例如，如上文所述的严格杂交条件)下实施接触，并且随后移除未结合的核酸。所得到的杂交核酸样式提供已经探测到的每种生物标志物的表达信息，其中表达信息涉及基因表达与否和一般处于何种水平，其中表达数据，即，表达概况，可以是定性和定量的。

b.疾病和样品组织来源

在某些示例实施方案中，患者样品包括癌症组织样品，如归档样品。患者样品优选地来自癌组织，且可以来自已经通过预后、复发可能性、长期存活、临床结果、治疗反应、诊断、癌症分类或个性化基因组图谱表征的样品。如本文所用，癌症包括但不限于白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌症、子宫内膜癌、食管癌、胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌症、肾癌等。如本文所用，结直肠癌涵盖可能在直肠和其他结肠端口的组织中涉及癌症的癌症以及可以单独划归为结肠癌或直肠癌的癌症。在一个实施方案中，本文所述的方法指用抗血管生成剂、抗血管生成靶向疗法、血管生成信号传导抑制剂(但不限于这些类别)治疗过的癌症。这些癌症还包括这些癌症的处于多种发病阶段的亚类和亚型。在某些示例实施方案中，患者样品包含卵巢癌样品。在某些示例实施方案中，所述卵巢癌样品是浆液性卵巢癌样品，如高级浆液性卵巢癌样品。在另一个示例实施方案中，所述患者样品包含乳腺癌样品。在又另一个示例实施方案中，所述患者样品包含胶质母细胞瘤样品。

“生物样品”、“样品”和“测试样品”在本文中可互换地用来指从个体获得或衍生的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、暗黄覆盖层、血浆和血清)、痰、泪、粘液、鼻洗液、经鼻抽吸物、呼吸、尿、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺体液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、腹水、细胞、细胞提取物和脑脊液。这还包括前述全部样品的实验分离部分。例如，血液样品可以分离成血清或分离成含有特定类型血细胞(如红细胞或白细胞(白血球))的部分。如果需要，样品可以是来自个体的样品的组合，如组织和流体样品的组合。术语“生物样品”还包括含有(例如来自粪便样品、组织样品或组织活检样品的)均化固形物的材料。术语“生物样品”还包括从组织培养或细胞培养物(包括组织切除和活检样品)衍生的材料。可以使用获得生物样品的任何合适方法；示例性方法例如包括静脉切开术、棉拭子(例如，颊拭子)和细针抽吸活组织检查术。也可以例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱冲洗、涂片(例如，PAP涂片)或乳管灌洗法采集样品。从个体获得或衍生的“生物样品”包括从个体获得后已经按任何适合方式加工(例如，新鲜冷冻的或福尔马林固定和/或石蜡包埋)的任何此种样品。如本文定义的本发明方法可以始于获得的样品，因此并不必然地并入从患者获得样品的步骤。这些方法可以是对分离样品进行的体外方法。

如本文所用，术语“患者”包括人和非人动物。用于治疗的优选患者是人。“患者”、“个体”和“受试者”在本文中互换地使用。

c.生物标志物

如本文所用，术语“生物标志物”可以指基因、mRNA、cDNA、反义转录物、miRNA、多肽、蛋白质、蛋白质片段或指示基因表达水平或蛋白质产生水平的任何其他核酸序列或多肽序列。当生物标志物指示个体中异常过程、疾病或其他状况或是其迹象时，通常将这种生物标志物描述为与表示个体中正常过程、不存在疾病或其他状况或是其迹象的生物标志物的表达水平或值相比过量表达或表达不足。“上调”、“上调的”、“过量表达”、“过量表达的”和其任何变型互换地用来指生物样品中某生物标志物的值或水平，所述值或水平大于一般在来自健康或正常个体的相似生物样品中检测到的该生物标志物的值或水平(或值或水平范围)。本术语还可以指生物样品中生物标志物的值或水平，所述值或水平大于可以在特定疾病的不同阶段检测到的该生物标志物的值或水平(或值或水平范围)。

“下调”、“下调的”、“表达不足”、“表达不足的”和其任何变型互换地用来指生物样品中某生物标志物的值或水平，所述值或水平小于一般在来自健康或正常个体的相似生物样品中检测到的该生物标志物的值或水平(或值或水平范围)。本术语还可以指生物样品中生物标志物的值或水平，所述值或水平小于可以在特定疾病不同阶段检测到的该生物标志物的值或水平(或值或水平范围)。

进一步，过量表达或表达不足的生物标志物与该生物标志物的表示个体中正常过程或不存在疾病、疾病亚型或其他状况或是其迹象的“正常”表达水平或值相比，也可以称作“差异性表达”或称作具有“差异性水平”或“差异性值”。因此，某生物标志物的“差异性表达”也可以称作距该生物标志物“正常”表达水平的变化。

术语“差异性生物标志物表达”和“差异性表达”互换用来指这样的生物标志物，其中所述生物标志物在患有特定疾病的受试者中的表达相对正常受试者中其表达、或相对不同地响应于特定疗法或具有不同预后的患者中其表达被激活到更高或更低的水平。该术语还包括在相同疾病的不同阶段其表达被激活到更高或更低水平的生物标志物。还应当理解，差异性表达的生物标志物可以在核酸水平或蛋白质水平激活或受抑制，或可以经受可变剪接以产生不同的多肽产物。这类差异可以由多种变化佐证，所述变化包括多肽的mRNA水平、miRNA水平、反义转录物水平或蛋白质表面表达、分泌或其他分配作用。差异性生物标志物表达可以包括比较两种或更多种基因或其基因产物之间的表达；或比较两种或更多种基因或其基因产物之间表达的比率；或甚至比较相同基因的两种不同加工产物，所述加工产物在正常受试者和患有疾病的受试者之间或在相同疾病的各个阶段之间差异。差异性表达包括例如正常细胞和患病细胞之间或已经经历不同疾病事件或疾病阶段的细胞之间生物标志物的空间或细胞表达模式的定量差异以及定性差异。

在某些示例实施方案中，生物标志物是RNA转录物。如本文所用，“RNA转录物”指编码性RNA和非编码性RNA，包括信使RNA(mRNA)、可变剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核小RNA(snRNA)和反义RNA。测量生物样品中的mRNA可以用作检测生物样品中相应蛋白质和基因水平的替代。因此，也可以通过检测适当的RNA，检测本文所述的任何生物标志物或生物标志物组。生物标志物表达概况分析方法包括但不限于定量PCR、NGS、RNA印迹、DNA印迹、微阵列、SAGE、免疫测定法(ELISA、EIA、凝集法、散射比浊法、浊度测定法、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、免疫细胞化学、流式细胞术、Luminex测定法)和质谱法。给定样品的总体表达数据可以使用本领域技术人员已知的方法归一化，以校正起始物质的不同量、提取和扩增反应的不同效率。

在某些示例实施方案中，可用于区分表明良好临床预后和不良临床预后的癌症亚型的生物标志物可以通过鉴定下述生物标志物确定，其中所述生物标志物显示患者数据集中样品之间如使用上文讨论的表达检测方法和患者样品集所确定的最高程度变异性。本领域已知的用于鉴定表达数据中高度变异性数据点的标准统计方法可以用来鉴定高度变异性生物标志物。例如，针对患者数据集的联合背景和方差过滤程序。背景程序基于选择表达E和表达方差var_E高于下述阈值的探针组，其中所述述阈值由背景标准偏差σBg(来自表达控制台(Expression Console)软件)和指定显著性时标准正态分布z_α的分位数限定，如果下述满足，则保留a探针组：

E>log₂((z_aσ_Bg))；log₂((var_E)>2[log₂(σ_Bg)-E-log₂(log(2))]

其中a定义显著性阈值。在某些示例实施方案中，显著性阈值是6.3·10^-5。在另一个示例实施方案中，显著性阈值可以在1.0·10^-7至1.0·10^-3之间。

在某些示例实施方案中，可以进一步分析高度变异性生物标志物，以将患者数据集中的样本基于相似的基因表达概况分组成亚型或聚类。例如，可以将生物标志物基于其表达上调或下调多大程度地彼此相互关联来聚类。可以使用本领域已知的多种聚类分析技术。在一个示例实施方案中，凝聚层次聚类法用来鉴定癌症亚型。为了确定每个亚型的生物学意义，每个聚类内部的生物标志物可以进一步定位到它们的相应基因并通过交叉引用一个或多个基因本体论数据库注释，所述数据库含有与基因相关的生物活性和生物学途径的信息。在另一个示例实施方案中，将聚类中上调并对免疫反应通用函数项富集的生物标志物分组成推定性无血管生成样品组并用于表达特征标识生成。在另一个示例实施方案中，将聚类中下调并对血管生成和血管发育富集并上调和对免疫反应通用函数项富集的生物标志物分组成推定性无血管生成样品组并用于表达特征标识生成。在以下实施例部分中提供实施生物标志物聚类的泛函分析的进一步的细节。

在一个示例实施方案中，可用于导出用于本发明中的表达特征标识的生物标志物是在表1中列出的标志物列出的那些生物标志物。发现这些生物标志物具有确定患者对治疗剂反应的预测价值和/或在鉴定临床预后良好或不良的个体方面具有预后价值。

在某些示例实施方案中，本文所公开的生物标志物的表达与患者是否将由于施用抗血管生成治疗剂而经历不利或有利作用相关。通过检查一组生物标志物的表达，因此可能消除无效或不适当的治疗剂。重要地，在某些实施方案中，可以基于每位患者或基于每种药物进行这些确定。因此，可以决定特定治疗方案是否有可能有益于特定患者或患者类型，和/或特定方案是否应当继续进行。

在某些其他示例实施方案中，本文中公开的生物标志物的表达与患者的总体临床预后相关。通过检查肿瘤中鉴定到的一组生物标志物的表达，可以确定个体是否患有与良好临床预后或不良临床预后相关的癌症亚型。重要地，在某些实施方案中，可以基于每位患者进行这些确定。因此，本领域普通技术人员可以使用预测的预后辅助选择适当的治疗方案以治疗基础性疾病，同时消除很可能产生不利或医学上无保障的不良副作用的那些治疗方案。

表1中列出的SEQ ID NO指用来测量示例性转录组阵列上基因表达水平的探针组标识符。已经使用来自具有不同探针组的不同阵列的表达数据交叉验证本发明的表达特征标识，如以下实施例部分中进一步详述。因此，本文所公开的表达特征标识和方法不限于使用本文中公开的探针组测量的表达值。

表1：图1的聚类中的基因

在某些示例实施方案中，表1中列举的全部或部分生物标志物可以用于表达特征标识中。例如，包含表1中生物标志物的表达特征标识可以使用本文提供的方法生成并且可以包含表1中所述的一个和全部之间的生物标志物和其间的每个和每种组合(例如，4个选择的标志物、16个选择的标志物、74个选择的标志物等)。在一些实施方案中，所述表达特征标识包含至少5、10、20、40、60、100、150、200、或300或更多个标志物。在其他实施方案中，预测性生物标志物组包含不多于5、10、20、40、60、100、150、200、300、400、500，600或700个标志物。在一个示例实施方案中，表达特征标识包括表1中列出的多个标志物。在一些实施方案中，表达特征标识包括至少约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％在表1中列出的标志物。可以使用本文所述的方法和本领域已知的类似方法，从提供的生物标志物装配出选择的表达特征标识。在一个实施方案中，表达特征标识含有表1中的全部基因或基因产物。

4.数学模型

以下方法可以用来导出区分响应或不响应于抗血管生成治疗剂的受试者的表达特征标识，或用作某些癌症类型的预后指示剂，包括从上文公开的生物标志物导出的表达特征标识。在某些其他示例实施方案中，使用决策树(Hastie等人,The Elements ofStatistical Learning,Springer,New York 2001)、随机森林法(Breiman,2001 RandomForests,Machine Learning 45:5)、神经网络法(Bishop,Neural Networks for PatternRecognition,Clarendon Press,Oxford 1995)、判别分析(Duda等人,PatternClassification,第2版,John Wiley,New York 2001)，包括但不限于线性、对角线性、二次和对数判别分析、微整列预测分析(PAM,(Tibshirani等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:6567-6572))或类模拟软独立建模分析(SIMCA,(Wold,1976,Pattern Recogn.8:127-139))导出表达特征标识。

可以联合幅度变动的真比例尺上的相应标量权重，限定生物标志物表达值，所述生物标志物表达值进一步通过线性或非线性、几何、三角学或相关手段，借助几何算法、统计学习算法、贝叶斯算法、消退算法或相似算法合并成单个标量值，所述算法与基于标量值的数学推导的决策函数一起提供预测模型，其中来自样品的表达概况可以借助所述预测模型解析成独立类别：指定药物、药物类别、分子亚型或治疗方案的反应个体或无反应个体、对其抵抗或不抵抗。从源自药物反应和/或耐药性已知的患者历史样品的一组代表性表达概况中，在交叉验证、自展或相似采样技术下，通过针对灵敏度、特异性、负和正预示值、风险比或其任意组合优化的学习权重和决策阈值，形成这类预测模型。

在一个实施方案中，生物标志物用来形成其信号的权重总和，其中各项权重可以为正或负。所产生的总和(“表达得分”)与预定的参考点或值比较。参考点或值的比较可以用来诊断或预测临床状况或结果。

如上文描述，本领域普通技术人员将理解，在表1中提供的分类器内所包含的生物标志物将携带用于确定临床预后的分类器的不等权重。因此，尽管少至一种生物标志物可以用来诊断或预测临床预后或对治疗剂的反应，可以使用更多生物标志物增加特异性和灵敏度或诊断或预测准确度。

如本文所用，术语“权重”指统计计算中某项的绝对量级。可以使用本领域已知的学习方法，基于患者样品的数据集确定基因表达分类器中每种生物标志物的权重。如本文所用术语“偏差”或“偏置”指使用培训集中的特征标识基因的平均表达所导出的常数项并且用来平均中心化检验数据集中分析的每个基因。

在某些示例实施方案中，表达特征标识由决策函数限定。决策函数是使用线性分类器导出的一组权重表达值。全部线性分类器使用以下等式定义决策函数：

f(x)＝w’·x+b＝∑w_i·x_i+b (1)

特定样品的全部测量值，如微阵列基因表达强度x_i归集于矢量x中。每种强度随后乘以相应权重w_i以在增加偏离项b后获得决策函数f(x)的值。在导出决策函数时，线性分类器将进一步定义将基因表达数据空间分割成两个不相交部分的阈值。示例性线性分类器包括但不限于部分最小二乘(PLS)，(Nguyen等人,Bioinformatics 18(2002)39-50)、持向量机(SVM)(等人,Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002)和收缩判别分析(SDA)(等人,Annals of applied statistics 4,503-519(2010))。在一个示例实施方案中，线性分类器是PLS线性分类器。

基于训练样品大集合经验地导出决策函数，例如从显示良好或不良临床预后的患者导出。基于不同特征如但不限于给定治疗性治疗之前或之后的临床预后，阈值将患者组分开。在形成阶段(“训练”)从一组结果已知的患者导出对这种量(即临界阈值)的解释。从训练数据通过本领域技术人员已知的方法先验地固定相应的权重和决策得分的反应性/抗性临界阈。在一个示例实施方案中，部分最小二乘判别分析(PLS-DA)用于确定权重。(L.S.Wold,J.Chemom.1(1987)185-196；D.V.Nguyen,D.M.Rocke,Bioinformatics 18(2002)39-50)。

有效地，这意味数据空间，即生物标志物表达值全部可能组合的集合，分裂成两个对应于不同临床分类或预测的互斥组，例如，一组对应于良好临床预后和不良临床预后。在整体分类器的背景下，某种生物标志物的相对过量表达可以增加决策得分(正权重)或减少决策得分(负权重)并且因此有助于例如良好临床预后的总决策。

在本发明的某些示例实施方案中，将数据在应用如上文所述的加权总和之前进行非线性转化。这种非线性转化可能包括增加数据的维度。还可能隐含地进行非线性转化和加权加合，例如，通过使用kernel函数进行。(等人,Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002)。

在某些示例实施方案中，通过来自相应癌症组织样品集合的分离RNA和借助分离的RNA与微阵列杂交确定表达值，导出患者培训集数据。在某些示例实施方案中，导出表达特征标识中使用的微阵列是转录组阵列。如本文所用，“转录组阵列”指含有探针组的微阵列，所述探针组设计成与已经验证在目的患病组织中表达的序列杂交。鉴于组织和生物学背景之间可变剪接作用和可变的多聚A尾加工，针对衍生自另一个组织源或生物学背景的相同基因序列设计的探针可将并不与目的患病组织中表达的转录物有效结合，导致丢失可能有意义的生物学信息。因此，在导出微阵列探针组之前证实什么序列在患病目的组织中表达是有益的。可以例如通过以下方式验证特定疾病背景下表达的序列：从患病组织样品集合分离总RNA并测序并且将分离的序列与已知的核酸序列数据库交叉参考以证实针对目的患病组织中实际表达的序列设计转录组阵列上的探针组。用于制造转录组阵列的方法是本领域熟知的并且在通过引用方式并入本文的美国专利申请专利公开号2006/0134663中描述。在某些示例实施方案中，转录组阵列的探针组设计成在转录物3’末端的300核苷酸内部结合。在通过引用方式并入本文的美国专利申请专利公开号2009/0082218中描述了用结合于靶转录物3’末端的300个核苷酸内部的探针组设计转录组阵列的方法。在某些示例实施方案中，在导出本发明基因表达概况中使用的微阵列是Almac卵巢癌DSA^TM微阵列(AlmacGroup,Craigavon，英国)。

可以通过使用这类诊断法如“曲线下面积”(AUC)评价线性分类器的性能，选择最佳线性分类器。AUC指接收者操作特征(ROC)曲线的曲线下面积，二者均是本领域熟知的。AUC量值可用于完整数据范围内比较分类器的准确性。AUC更高的线性分类器具有在两个目的组(例如，卵巢癌样品和正常或对照样品)之间正确划分未知事物的更大能力。ROC曲线可用于测算特定特征(例如，本文所述的任何生物标志物和/或额外生物医学信息的任何项)在区分两个群体(例如，响应于和不响应于治疗剂的个体)时的性能。一般，基于单一特征的值以递增顺序在整个群体(例如，病例和对照)范围内分选特征数据。随后，对于该特征的每个值，计算数据的真阳性率和假阳性率。通过计数在该特征的值以上的病例数并且随后除以总阳性例数，确定真阳性率。通过计数在该特征的值以上的对照数并且随后除以总对照数，确定假阳性率。虽然这个定义涉及其中与对照相比情况下特征升高的情形，但是这个定义也适用于其中与对照相比情况下特征降低的情形(在这种情形下，将计数在该特征的值以下的样品)。可以对单个特征以及对其他单一输出生成ROC曲线，例如，两种或更多种特征的组合可以按数学方式合并(例如，相加、相减、相乘等)以提供单一总和值，并且可以在ROC曲线中绘制这个单一总和值。另外，可以在ROC曲线中绘制多个特征的任何组合，其中该组合导出单一输出值。这些特征组合可以包括一项检验。ROC曲线是检验的真阳性率(灵敏度)对该检验的假阳性率(1-特异性)的曲线。

在一个示例实施方案中，血管生成表达特征标识涉及表2中详述的63种生物标志物与该表中详述的相应排序、权重和相关的偏差或替代性排序、权重和偏差，这取决于例如疾病背景。在复合决策得分函数中，表2在示例分类器中按绝对递减权重的顺序排序生物标志物。本发明的方法可以依赖于测量表2中列出的生物标志物中的一种或多种、最多达所有。本发明的方法可以包括测量来自表2的生物标志物中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60种或每种。在某些实施方案中，所述方法可以包括测量来自表2的生物标志物中的2至5种的表达水平。

表2

在另一个示例实施方案中，血管生成表达特征标识涉及表3中详述的63种生物标志物与该表中详述的相应排序或替代性排序，这取决于例如疾病背景。在复合决策得分函数中，表3在示例分类器中按绝对递减权重的顺序排序生物标志物。本发明的方法可以依赖于测量表3中列出的生物标志物中的一种或多种、最多达所有。本发明的方法可以包括测量来自表3的生物标志物中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60种或每种。在某些实施方案中，所述方法可以包括测量来自表3的生物标志物中的2至5种的表达水平。

表3

可用于测量生物标志物的表达的探针组显示于表4中。

表4

在一个示例实施方案中，表达特征标识包含以下生物标志物中的所有或部分；IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3、RTP4、COL3A1、CDR1、RARRES3、TNFSF10、NUAK1、SNORD114-14、SRPX、SPARC、GJB1、TIMP3、ISLR、TUBA1A、DEXI、BASP1、PXDN、GBP4、SLC28A3、HLA-DRA、TAP2、ACSL5、CDH11、PSMB9、MMP14、CD74、LOXL1、CIITA、ZNF697、SH3RF2、MIR198、COL1A2、TNFRSF14、COL8A1、C21orf63、TAP1、PDPN、RHOBTB3、BCL11A、HLA-DOB、XAF1、ARHGAP26、POLD2、DPYSL2、COL4A1、ID3、CFB、NID1、FKBP7、TIMP2、RCBTB1、ANGPTL2、ENTPD7、SHISA4和HINT1。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、SOX11、INS和CXCL17以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。

另一个示例实施方案中，表达特征标识包含至少INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1。另一个示例实施方案中，所述表达特征标识包含至少IGF2、SOX11、INS和CXCL17。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含IGF2以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含SOX11以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含INS以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含CXCL17以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含CDR1和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含COL3A1和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含SPARC和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含TIMP3和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含COL8A1和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含NUAK1和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含MATN3和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含TMEM45A和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含CXCR2P1和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含SRPX和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含CDH11和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含BC11A和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含LOXL1和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，表达特征标识包含MMP14和选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，以及选自表2中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一个示例实施方案中，实例表达特征标识包含表2中列出的生物标志物和相应生物标志物加权值。在另一个示例实施方案中，实例表达特征标识由表2中列出的生物标志物和相应生物标志物加权值组成。在另一个示例实施方案中，实例表达得分包含表3中列出的生物标志物和等级。在另一个示例实施方案中，实例表达特征标识由表3中列出的生物标志物和相应等级组成。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含表2或3中列出的生物标志物中的所有或部分。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2、SOX11、INS和CXCL17以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。

另一个示例实施方案中，生物标志物组包含至少INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1。另一个示例实施方案中，所述生物标志物组包含至少IGF2、SOX11、INS和CXCL17。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含IGF2以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含SOX11以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含INS以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含CXCL17以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含SPARC以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含TMEM45A以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含COL8A1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含COL3A1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含CDR1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含NUAK1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含TIMP3以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含LOXL1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含CXCR2P1以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含SPARC以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含MATN3以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含SNORD114-14以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含SRPX以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含CDH11以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含BC11A以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一个进一步方面，本发明的方法包括对来自个体的生物样品进行测定以确定生物标志物组中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物组包含MMP14以及选自表2或3中的生物标志物列表的至少N种额外生物标志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

使用表达特征标识将新测试样品分类

为了使用表达特征标识(如上文描述的那些)将新测试样品分类，测量癌症组织中一种或多种生物标志物的相对表达水平以形成测试样品表达概况。在某些示例性实施方案中，测试样品表达概况以复合决策得分的形式(“表达得分”)总结并且与从患者数据的培训集导出的阈值得分比较。为了使基于特征如但不限于良好/不良临床预后将患者组分为不同组的能力最大化，建立得分阈值。患者培训集数据优选地从已经通过预后、复发可能性、长期存活、临床结果、治疗反应、诊断、癌症分类或个性化基因组图谱表征的癌症组织样品导出。来自患者样品的表达概况和相应决策得分可以与培训集中处于数学导出的得分决策阈值的相同侧上的患者样品特征相关。在某些示例实施方案中，优化线性分类器标量输出的阈值以使交叉验证下敏感性和特异性的总和最大化，如训练数据集内部所观察那样。

使用本领域技术人员已知的方法归一化给定样品的总体表达数据，以校正起始物质的不同量、提取和扩增反应的不同效率等。

在一个实施方案中，通过线性分类器评价患者组织样品的生物标志物表达概况。如本文所用，线性分类器涉及个体生物标志物强度并入复合决策得分(“决策函数”)的权重总和。决策得分随后与预定的临界得分阈值比较，所述临界得分阈值与敏感性和特异性方面的某个调定点相对应，所述调定点显示样品是否等于或高于得分阈值(决策函数为正)或低于得分阈值(决策函数为正负)。

对归一化数据使用线性分类器以得出诊断性或预后性识别(例如良好或不良临床预后)有效地意指，借助分割超平面，将数据空间即分类器中全部基因的表达值的全部可能组合分割成两个不相交的部分。基于训练例子大集合经验地导出这种分割，例如从显示治疗剂响应性或耐药性的患者导出。在不丧失一般性的情况下，可以对除一个生物标志物之外其余生物标志物假定某个固定的值集合，所述值集合将自动限定这个剩余生物标志物的阈值，其中决策将因例如治疗剂响应性或耐药性而改变。高于这种动态阈值的表达值则将表明不良临床预后(对于具有负权重的生物标志物)或良好临床预后(对于具有正权重的生物标志物)。这个阈值的精确值取决于分类器内部全部其他生物标志物的实际测量表达概况，但是某些生物标志物的总体指示作用保持固定，即高值或“相对过量表达”总是有助于良好临床预后(具有正权重的基因)或不良临床预后(具有负权重的基因)。因此，在整体基因表达分类器的背景下，相对表达可以表示某个生物标志物上调或下调是否表示良好或较差临床预后。在某些示例实施方案中，高于阈值表达得分的样品表达得分表明受试者具有无血管生成亚型。在某些其他示例实施方案中，高于阈值得分的样品表达得分表明受试者与样品表达得分低于阈值得分的受试者相比具有良好临床预后。在某些其他示例实施方案中，高于阈值得分的样品表达得分表明，如果施用抗血管生成治疗剂，则受试者将可能经历不利影响，或具有不良预后。

存在许多测量测试样品表达概况的适合方法，这取决于待测定生物标志物的类型。测量生物样品中的mRNA可以用作检测生物样品中相应蛋白质水平的替代。因此，也可以通过检测适当的RNA，从而检测本文所述的任何生物标志物或生物标志物组。基因表达概况分析方法包括但不限于微阵列、RT-PCT、qPCR、NGS、RNA印迹法、SAGE、质谱法。

通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，接着qPCR)测量mRNA表达水平。RT-PCR用来从mRNA产生cDNA。cDNA可以用来在qPCR测定法中随着DNA扩增过程进行而产生荧光。通过与标准曲线比较，qPCR可以产生绝对量值如每细胞的mRNA拷贝数。RNA印迹法、微阵列、Invader测定法和RT-PCR联合毛细管电泳法已经全部用来测量样品中mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling:Methods and Protocols,Richard A.Shimkets编者,Humana Press,2004。

miRNA分子是不编码但可以调节基因表达的小RNA。适于测量mRNA表达水平的任何方法也可以用于相应的miRNA。最近，许多实验室已经研究使用miRNA作为疾病的生物标志物。许多疾病涉及广泛转录性调节，并且miRNA可能具有生物标志物作用不令人惊讶。在miRNA浓度和疾病之间的联系甚至往往比蛋白质水平和疾病之间的联系更不清楚，然而miRNA生物标志物的价值可能巨大。当然，与疾病期间差异性表达的任何RNA一样，开发体外诊断产品面临的问题将包括如下要求：miRNA幸存于患病细胞中并容易提取以便分析，或miRNA释放至血液或其他基质中，其中它们必须长时间幸存足以接受测量。蛋白质生物标志物具有相似的要求，不过许多潜在的蛋白质生物标志物在病变部位被有意地分泌并在疾病期间以旁分泌方式发挥作用。许多潜在的蛋白质生物标志物设计成在合成这些蛋白质的细胞外部发挥作用。

也可以使用质谱方法评价基因表达。多种构造的质谱仪可以用来检测生物标志物值。几个类型的质谱仪是可获得的或可以按各种构造产生。从总体上看，质谱仪具有以下主要组件：样品入口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统和仪器控制系统及数据系统。样品入口、离子源和质量分析器的差异通常限定仪器类型和其能力。例如，入口可以是毛细管柱液相色谱源或可以是如基质辅助激光解吸附中所用的直接探头或阶梯。常用离子源例如是电喷雾，包括纳米喷雾和微量喷雾或基质辅助激光解吸附。常用的质量分析器包括四极质量滤器、离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器。额外的质谱法方法是本领域熟知的(参见Burlingame等人,Anal.Chem.70:647R-716R(1998)；Kinter和Sherman,New York(2000))。

可以通过以下任何方法检测并测量蛋白质生物标志物和生物标志物值：电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质-辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、表面-增强激光解吸附/电离飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)、硅表面解吸附/电离(DIOS)、次级离子质谱法(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、串联飞行时间(TOF/TOF)技术、所谓的ultraflex III TOF/TOF、常压化学电离质谱法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)^N、常压光离子化质谱法(APPI-MS)、APPI-MS/MS、和APPI-(MS)^N、四极质谱法、傅立叶变换质谱法(FTMS)、定量质谱法和离子阱质谱法。

样品制备策略在质谱表征蛋白质生物标志物和确定生物标志物值之前用来标记和富集样品。标记方法包括但不限于相对定量和绝对定量的同量异位素标签(iTRAQ)和细胞培养物中稳定同位素标记氨基酸(SILAC)。在质谱分析之前用来为候选生物标志物蛋白选择性富集样品的捕获试剂包括但不限于适配体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、F(ab')₂片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、结合配体的受体、亲和体(affybody)、纳米体、锚蛋白、结构域抗体、替代性抗体支架(例如双体抗体等)、印迹聚合物、高亲和性多聚体、肽模拟物、类肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体和合成性受体和前述的修饰物及片段。

前述测定法能够检测可用于确定患者的临床预后和选择适当治疗方案的方法中的生物标志物值，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少N个生物标志物值，所述生物标志物值对应于从表1或表2中提供的生物标志物中选出的生物标志物，其中如下文详细描述，使用所述生物标志物值划分指明该个体具有良好预后还是较差预后，或者如果施用特定治疗剂，将接受不利或有利影响。尽管一些所述的预测性生物标志物可单独用于预测临床预后，但本文还描述了将生物标志物的多个子集分组的方法，所述多个子集各自可用作一组两种或更多种生物标志物。因此，本申请的多种实施方案提供包含N个生物标志物的组合，其中N是至少三个生物标志物。将可以理解可以选择N是来自前述任一个所描述范围以及相似但高阶范围的任何数字。根据本文所述的任何方法，可以将生物标志物值分别检测并分类或可以将它们整体检测并分类，例如以多重分析模式进行。

b)微阵列方法

在一个实施方案中，本发明利用“寡核苷酸阵列”(本文中也称作“微阵列”)。微阵列可以用于分析细胞中生物标志物的表达，并特别用于测量癌症组织的生物标志物表达。

在一个实施方案中，通过可检测标记的代表细胞中存在的mRNA转录物的多核苷酸(例如，从总细胞mRNA合成的荧光标记cDNA或标记的cRNA)与微阵列杂交，产生生物标志物阵列。微阵列是针对细胞或生物体的基因组中多种基因(优选地大部分或几乎全部基因)的产物具有结合(例如，杂交)位点的有序阵列的表面。微阵列可以按本领域已知的许多方式制造。无论怎样产生，微阵列总是共有某些特征。阵列是可重复的，允许产生给定阵列的多个副本并且容易彼此比较。优选地，微阵列微小，通常小于5cm²，并且它们由结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中的给定结合位点或独特结合位点集合将特异性结合细胞中的单基因产物。在一个具体实施方案中，使用位置可寻址的阵列，所述阵列在每个位置含有序列已知的固定核酸。

将可以理解，当产生与细胞的RNA互补的cDNA并使其与微阵列在合适的杂交条件下杂交时，与阵列中对应于任何特定基因的位点杂交的水平将反映细胞中从该基因/生物标志物转录的mRNA的普遍程度。例如，当可检测标记(例如，荧光团可检测标记)的cDNA或与总细胞mRNA互补的cRNA与微阵列杂交时，阵列上与细胞中不转录的基因相对应(即，能够特异性结合该基因的产物)的位点将几乎没有信号或无信号(例如，荧光信号)，并且其编码的mRNA占优势的基因将具有相对强的信号。选择核酸杂交条件和洗涤条件，从而使探针“特异性结合”或“特异性杂交”至特定阵列位点，即，探针与具有互补核酸序列的序列阵列位点杂交、形成双链体或结合，但是不与具有非互补核酸序列的位点杂交。如本文所用，如果较短多核苷酸小于或等于25个碱基，则使用标准碱基配对规则时不存在错配或如果较短的多核苷酸比25个碱基长，则不存在超过5％错配时，则认为一个多核苷酸序列与另一个多核苷酸序列互补。优选地，多核苷酸是完美互补的(无错配)。可以通过使用例行实验，实施包含阴性对照的杂交分析，展示特异性杂交条件导致特异性杂交。

最佳杂交条件将取决于标记探针和固定化多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如，寡聚物与超过200个碱基的多核苷酸)和类型(例如，RNA、DNA、PNA)。核酸特异性(即，严格)杂交条件的一般参数在如下文献中描：Sambrook等人,上文，和Ausubel等人,“CurrentProtocols in Molecular Biology",Greene Publishing and Wiley-interscience,NY(1987)，所述文献出于全部目的完整并入本文。当使用cDNA微阵列时，常见杂交条件在65℃在5x SSC外加0.2％SDS中杂交4小时，随后在25℃在低严格性洗涤缓冲液(1x SSC外加0.2％SDS)中洗涤，随后在25℃在高严格性洗涤缓冲液(0.1SSC外加0.2％SDS)中洗涤10分钟(参见Shena等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第93卷,第10614页(1996))。还例如在Tijessen,Hybridization With Nucleic Acid Probes",Elsevier Science PublishersB.V.(1993)和Kricka,"Nonisotopic DNA Probe Techniques",Academic Press,SanDiego,Calif.(1992)中提供可用的杂交条件。

c)免疫测定方法

免疫测定方法基于抗体与其相应的靶或分析物的反应并且根据具体分析模式，可以检测样品中的分析物。为了改善基于免疫反应性的分析方法的特异性和灵敏度，经常使用单克隆抗体，原因在于它们的特异性表位识别作用。多克隆抗体也已经成功地用于各种免疫测定法中，因为与单克隆抗体相比，它们对靶的亲和力增加。已经设计免疫测定法用于广泛类型的生物样品基质。免疫测定法样式已经设计成提供定性、半定量和定量结果。

可以通过使用标准曲线生成定量结果，所述标准曲线用浓度已知的待检测特定分析物产生。将源自未知样品的响应或信号绘制到标准曲线上，并且确立与未知样品中的靶相对应的量或值。

已经设计许多免疫测定法样式。ELISA或EIA可以定量检测分析物/生物标志物。这种方法依赖于标志物与分析物或抗体接合并且标志物组分直接或间接地包含酶。ELISA试验可以设定成直接、间接、竞争性或夹心检测分析物。其他方法依赖于标志物，例如，放射性同位素(I¹²⁵)或荧光。额外的技术例如包括凝集法、散射比浊法、浊度测定法、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、Luminex测定法和其他方法(参见ImmunoAssay:A Practical Guide,Brian Law编辑，Taylor&Francis,Ltd.出版,2005年版)。

示例性分析模式包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、荧光、化学发光和荧光共振能量转移(FRET)或时间分辨-FRET(TR-FRET)免疫测定。用于检测生物标志物的方法的例子包括生物标志物免疫沉淀法，随后是允许区分大小和肽水平的定量方法，如凝胶电泳法、毛细管电泳法、薄层电色谱法等。

检测和/或定量可检测标志物或信号发生物质的方法取决于标志物的性质。适当酶催化的反应(其中可检测标志物是酶；见上文)的产物可以是，而不限于具有荧光、发光性或放射性或它们可以吸收可见光或紫外光。适于检测这类可检测标志物的检测器的例子包括而不限于x射线胶片、放射性活度计数器、闪烁计数器，分光光度计、比色计、荧光计，光度计和光密度计。

任何检测方法可以按允许任何合适制备、处理和分析反应的任何形式进行。这可以例如在多孔分析平板(例如，96孔或384孔)中或使用任何合适的阵列或微阵列。可以手工或自动地产生多种试剂的母液，并且可以使用能够检测可检测标志物的市售分析软件、机器人和检测仪器，自动进行后续全部抽吸、稀释、混合、分配、洗涤、温育、样品读出、数据采集和分析。

试剂盒

可以在试剂盒中提供执行本文所述方法的试剂、工具和/或说明书。例如，试剂盒可以含有用于确定癌症患者的适当治疗的试剂、工具和说明书。这种试剂盒可以包括用于从患者(如通过活组织检查)采集组织样品的试剂和用于处理组织的试剂。试剂盒还可以包括用于进行基因或基因产物表达分析的一种或多种试剂，如用于进行核酸扩增(例如RT-PCR、qPCR)、测序(例如下一代测序法)、RNA印迹、蛋白质组分析或免疫组织化学以确定患者样品中基因或基因产物标志物的表达水平的试剂。例如，可以在这类试剂盒包含用于进行RT-PCR的引物、用于进行RNA印迹分析的探针和/或用于进行蛋白质组分析如蛋白质印迹法、免疫组织化学和ELISA分析的抗体。也可以包含用于测定法的适当的缓冲液。也可以包含任何这些测定法所要求的检测试剂。下文更详细地描述适当的试剂和方法。试剂盒可以包含检测表2中至少一种(直至全部)生物标志物的表达水平的合适引物和/或探针。在蛋白质水平确定表达的情况下，试剂盒可以含有对目的蛋白特异的结合试剂。结合试剂可以包括抗体以包含全部片段及其衍生物。在本发明的多种实施方案背景下，术语“抗体”包括对有关蛋白质具有特异性结合亲和力的全部免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子(以举例方式包含而不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物如人、山羊、兔和小鼠中免疫反应期间产生的类似分子)。可用于本发明的多种实施方案中的特定免疫球蛋白包括IgG同种型。可用于本发明的多种实施方案中的抗体可以是单克隆或多克隆来源的，但一般是单克隆抗体。抗体可以是人抗体、非人抗体、或人源化形式的非人抗体、或嵌合抗体。充分建立了用于抗体人源化的多种技术并且可以使用任何合适的技术。术语“抗体”还指包含至少一个特异性识别并结合抗原表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，并且它扩展至保留与有关蛋白质特异性结合能力的全部抗体衍生物和片段。这些衍生物和片段可以包括Fab片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、单链抗体、单结构域抗体、Fc片段等。术语抗体涵盖同时由重链和轻链组成的抗体，还包括(仅)重链抗体(它们可以衍生自软骨鱼类或驼类的多种物种)。在具体实施方案中，抗体可以工程化，从而对多于一种蛋白质特异，例如具有允许结合如本文中鉴定的两种不同靶蛋白(参见表2)的双特异性。

在一些实施方案中，试剂盒还可以含有在测试预测响应性时待施用的特定抗血管生成治疗剂。这种药剂可以按定制用于特定治疗的形式如剂型提供。试剂盒可以配有根据适当治疗方案施用的合适说明书。

本文中表征的试剂盒还可以包括描述如何进行测定法以测量基因或基因产物表达的说明页。说明页还可以包括如何确定参比组群的说明，包括如何测定参比组群中基因或基因产物标志物的表达水平和如何装配表达数据以建立参比以便与试验患者比较。说明页还可以包含用于分析试验患者中基因或基因产物表达和用于将该表达水平与参比组群中的表达比较以随后为试验患者确定适当化疗的说明。用于确定适当化疗的方法在上文描述并且可以在说明页中详述。

试剂盒中包含的信息资料可以是涉及本文所述方法和/或使用本文所述方法的试剂的描述性资料、指导性资料、销售资料或其他资料。例如，试剂盒的信息资料可以含有联系信息，例如，实际地址、电子邮件地址、网址或电话号码，其中试剂盒的用户可以获得关于进行基因表达分析和解读结果的实质信息，特别地当这些结果适用于人对特定治疗剂具有阳性反应的可能性时。

本文中表征试剂盒还可以含有从基因产物标志物表达推断患者对特定治疗剂具有阳性反应的可能性所必需的软件。

治疗剂

如上文描述，本文所述的方法允许将患者划分为在化疗治疗之后或与之组合施用抗血管生成治疗剂之前、之时或之后具有良好或较差临床预后。用来治疗癌症的某些当前这样的抗血管生成治疗剂包括但不限于以下药物；VEGF途径靶向治疗剂，包括多靶向途径抑制剂(VEGF/PDGF/FGF/EGFT/FLT-3/c-KIT)、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、免疫调节剂。VEGF特异性制剂包括但不限于贝伐珠单抗(Avastin)、阿柏西普(VEGFTrap)、IMC-1121B(雷莫芦单抗(ramucirumab))。多靶向途径抑制剂包括但不限于、伊马替尼(Gleevec)、索拉替尼(多吉美(Nexavar))、吉非替尼(易瑞沙(Iressa))、舒尼替尼(索坦(Sutent))、厄洛替尼、Tivozinib、西地尼布(Recentin)、帕唑帕尼(Votrient)、BIBF1120(Vargatef)、度维替尼、司马沙尼(Sugen)、阿昔替尼(AG013736)、凡德他尼(Zactima)、尼洛替尼(Tasigna)、达沙替尼(Sprycel)、伐他拉尼、莫特塞尼、ABT-869、TKI-258。血管生成素-TIE2途径抑制剂包括但不限于AMG-386、PF-4856884 CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠单抗(Herceptin)。内源性血管生成抑制剂包括但不限于血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤抑素(Tumstatin)、血管能抑素(Canstatin)、抑制蛋白、血管抑制素、Vasostatin、干扰素α。免疫调节剂包括但不限于沙立度胺和来那度胺。在一个示例实施方案中，所述抗血管生成剂是贝伐珠单抗。

本发明进一步定义于以下编号项中：

1.用于选择是否向受试者施用抗血管生成治疗剂的方法，其包括：

从受试者获得测试样品；

从获得自所述受试者的测试样品测量生物标志物组的表达水平，其中所述生物标志物组包含选自表2或表3的一种或多种生物标志物；

测定所述生物标志物组的样品表达得分；

将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

基于所述样品表达得分是否等于或高于阈值表达得分而选择治疗，其中如果所述样品表达得分高于阈值得分，则抗血管生成治疗剂是禁忌的。

2.项1的方法，其中所述受试者正患有癌症。

3.项2的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

4.项3的方法，其中所述卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

5.项1至4中任一项的方法，其中所述受试者正在接受或已经接受化疗治疗。

6.项5的方法，其中所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

7.项6的方法，其中所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

8.项6的方法，其中所述化疗治疗包括施用卡铂和紫杉醇。

9.项1至8中任一项的方法，其中所述抗血管生成治疗剂是靶向VEGF-途径的治疗剂，血管生成素-TIE2途径抑制剂，内源性血管生成抑制剂或免疫调节剂。

10.项9的方法，其中所述靶向VEGF-途径的治疗剂包括贝伐珠单抗(Avastin)、阿柏西普(VEGF Trap)、IMC-1121B(雷莫芦单抗(ramucirumab))、伊马替尼(Gleevec)、索拉替尼(多吉美(Nexavar))、吉非替尼(易瑞沙(Iressa))、舒尼替尼(索坦(Sutent))、厄洛替尼、Tivozinib、西地尼布(Recentin)、帕唑帕尼(Votrient)、BIBF 1120(Vargatef)、度维替尼、司马沙尼(Sugen)、阿昔替尼(AG013736)、凡德他尼(Zactima)、尼洛替尼(Tasigna)、达沙替尼(Sprycel)、伐他拉尼(vatalanib)、莫特塞尼、ABT-869、TKI-258或其组合。

11.项16的方法，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂包括AMG-386、PF-4856884CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠单抗(Herceptin)或其组合。

12.项9的方法，其中所述内源性血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤抑素(Tumstatin)、血管能抑素(Canstatin)、抑制蛋白、血管抑制素、Vasostatin、干扰素α或其组合。

13.项9的方法，其中所述免疫调节剂包括沙利度胺和来那度胺。

14.项10的方法，其中所述靶向VEGF-途径的治疗剂是贝伐珠单抗。

15.项1至14中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

16.项1至14中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含表2中列出的生物标志物。

17.项16的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值列于表2中。

18.项16的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

19.项1至14中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

20.项1至14中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

21.用于确定受试者的临床预后的方法，其包括：

从患有癌症的受试者获得测试样品；

从获得自所述受试者的测试样品测量生物标志物组的表达水平，其中所述生物标志物组包含选自表2的一种或多种生物标志物；

测定所述生物标志物组的样品表达得分；

将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

基于所述样品表达得分是否高于阈值表达得分而确定所述受试者的临床预后，其中如果所述样品表达得分高于或等于所述阈值表达得分，则所述临床预后是良好预后。

22.项21的方法，其中所述良好预后表明与样品表达得分低于所述阈值得分的样品相比增加的无进展存活率或总存活率。

23.项21或项22的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

24.项23的方法，其中所述卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

25.项21至24中任一项的方法，其中所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

26.项25的方法，其中所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

27.项25的方法，其中所述化疗治疗包括施用紫杉醇和卡铂。

28.项21至27中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

29.项21至28中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含表2中列出的生物标志物。

30.项29的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值列于表2中。

31.项29的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

32.项21至28中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

33.项21至28中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

34.用于选择是否向受试者施用贝伐珠单抗的方法，其包括：

在从患有卵巢癌的受试者获得的测试样品中，所述受试者正在、已经和/或将使用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗；

测量选自表2的生物标志物中的一种或多种、最多达所有的表达水平；

测定一种或多种生物标志物的样品表达得分；

将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

基于所述样品表达得分是否高于所述阈值表达得分而选择治疗，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则贝伐珠单抗是禁忌的。

35.项34的方法，其中所述卵巢癌包含浆液性卵巢癌。

36.项35的方法，其中所述浆液性卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

37.项34至35中任一项的方法，其中如果贝伐珠单抗是禁忌的，则所述患者用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗。

38.项34至37中任一项的方法，其中如果所述样品表达得分低于所述阈值得分，则所述患者用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂连同贝伐珠单抗进行治疗。

39.项34至38中任一项的方法，其中所述基于铂的化疗剂包含卡铂。

40.项34至39中任一项的方法，其中所述有丝分裂抑制剂包括紫杉烷，任选紫杉醇。

41.项34至40中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

42.项34至40中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含表2中列出的生物标志物。

43.项42的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值列于表2中。

44.项42的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

45.项34至40中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

46.项34至40中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

47.确定受试者的临床预后的方法，其包括：

a.在从患有卵巢癌的受试者获得的测试样品中，所述受试者正在、已经和/或将使用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗；

b.测量选自表2的生物标志物中的一种或多种、最多达所有的表达水平；

c.测定一种或多种生物标志物的样品表达得分；

d.将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

e.基于所述样品表达得分是否等于或高于所述阈值表达得分而确定所述临床预后，其中如果所述样品表达得分高于或等于所述阈值得分，则所述临床预后是良好的临床预后。

48.项47的方法，其中所述卵巢癌包含浆液性卵巢癌。

49.项48的方法，其中所述浆液性卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

50.项47至48中任一项的方法，其中如果所述患者具有良好预后，则使用贝伐珠单抗的治疗是禁忌的。

51.项47至50中任一项的方法，其中如果所述样品表达得分低于所述阈值得分，则所述患者用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂连同贝伐珠单抗进行治疗。

52.项47至51中任一项的方法，其中所述基于铂的化疗剂包含卡铂。

53.项47至52中任一项的方法，其中所述有丝分裂抑制剂包括紫杉烷，任选紫杉醇。

54.项47至53中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

55.项47至53中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含表2中列出的生物标志物。

56.项55的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值列于表2中。

57.项55的方法，其中使用所述生物标志物组中的各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

58.项47至52中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

59.项47至52中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

本发明由以下实施例进一步说明，所述实施例不应当以任何方式解释为对本发明的范围加以限制。相反，应当清楚地理解，可以求助于可在阅读本说明书后本身启发本领域技术人员而不脱离本发明精神的多种其他实施方式、修改及其等同物。

实施例

实施例1：组织加工、层次聚类、亚型鉴定和分类器开发

肿瘤材料

从大体解剖的上皮浆液性卵巢肿瘤FFPE组织样品组群的基因表达分析鉴定示例表达特征标识，所述组织样品源自NHS Lothian和爱丁堡大学。

表3：357份上皮卵巢癌样品的病理学检查结果。

来自FFPE的基因表达概况分析

使用高纯RNA石蜡试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,曼海姆，德国)从大体解剖的FFPE组织提取总RNA。将RNA转化成互补性脱氧核糖核酸(cDNA)，随后使用WT-Ovation^TMFFPE RNA扩增系统V2的技术(NuGEN Technologies Inc.,San Carlos,CA,USA)，将所述cDNA扩增并转化成单链形式。随后将扩增的单链cDNA片段化并使用FL-Ovation^TMcDNA生物素模块V2(NuGEN Technologies Inc.)进行生物素标记。随后片段化和标记的cDNA与Almac卵巢癌DSA^TM杂交。已经优化Almac的卵巢癌DSA^TM研究工具用于分析FFPE组织样品，这使得利用有价值的归档组织库成为可能。Almac卵巢癌DSA^TM研究工具是展示正常卵巢组织和癌性卵巢组织中转录组的创新微阵列平台。因此，卵巢癌DSA^TM提供了卵巢疾病和组织背景内部转录组的全面展示，这是使用一般微阵列平台不可获得的。使用Affymentrix扫描仪7G(Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA)扫描阵列。

数据准备

使用MAS5预处理算法实施概况分析样品的质量控制(QC)。解决了不同的技术方面：平均噪声和背景均匀性、当前识别百分数(阵列质量)、信号质量、RNA质量和杂交质量。分析相应参数的分布和中位绝对偏差并用来鉴定可能的离群值。

Almac的卵巢癌DSA^TM含有主要靶向距3’末端300个核苷酸内部的区域的探针。因此，调整标准Affymetrix RNA质量量值，对于持家基因，除常规3’/5’比率之外，还使用附带3’末端探针组强度对平均背景强度的3’末端探针组强度。检验杂交对照以确保它们的强度和当前识别与Affymetrix规定的要求相符。

层次聚类和功能分析

样品前处理使用强大的多阵列平均法(Robust Multi-array Average,RMA)[16]来实施。通过减少变异、降低强度和增加与cDNA产量的相关性分选数据矩阵。过滤与cDNA产量相关的探针组之后，测试数据矩阵的增量子集的聚类稳定性：应用GAP统计[17]以计算样品和探针组聚类的数目，而使用部分比较方法[18,19]评价聚类组合物的稳定性。基于选择数目的样品聚类的最小且最稳定的数据矩阵确定最终最可变的探针组列表。

将数据矩阵针对中值探针组表达值均一化之后，使用Euclidean距离和Ward氏关联法[20]进行凝聚层次聚类(agglomerative hierarchical clustering)[20]。使用GAP统计[17]确定样品和探针组聚类的最佳数目。使用ANOVA(连续因子)或卡方分析(离散因子)评价跨样品聚类的临床参数因子水平的分布的显著性，并将其针对错误发现率(进行的测试的p-值和数目的乘积)进行校正。0.05的经校正p-值阈值用作显著性的标准。

使用基于Ensembl v60[http://oct2012.archive.ensembl.org/]的注释管线将卵巢癌探针组重新映射至基因。使用基因本体论生物过程分类[21]进行功能富集分析以鉴定和排序被发现为与成聚类基因集合相关的生物学实体。将实体根据统计学推导的富集得分[22]排序，并针对多次测试[23]调整。0.05的经校正p-值用作显著性阈值。将鉴定的富集过程总结成每个探针组/基因聚类的总体组功能。

特征开发和评价

亚型鉴定之后，开发基因特征用于预测分子组。为了便于将特征应用于在不同平台上概况分析的样品，通过将所有探针组总结成其中值表达和log2转换数据而将探针组重新映射至基因。使用偏最小二乘法[24]用基于五倍交叉验证的10次重复期间的过滤特征选择选择功能/基因而进行特征生成。

使用R 2.15.0中的存活包[25]进行单变量和多变量存活分析。多变量分析校正以下因素：高级浆液性：减瘤状态、分期、化疗和诊断时的年龄；Tothill：分级、分期、肿瘤辅助治疗和残余疾病。所有Kaplan-Meier图都是存活数据的单变量表示。

结果

265份HGS肿瘤经历基于1400个最可变的探针组(对应于1040种基因)的无监督层次聚类。鉴定了三个样品聚类和四个基因聚类(图1)。HGS聚类和临床病理特征之间没有显著关联。功能分析(图1)揭示，聚类HGS3的特征在于与免疫反应和血管生成/血管发育相关的基因的上调(简称为血管生成-免疫(Angioimmune)的聚类)。聚类HGS1与血管生成/血管发育的上调(尽管程度明显小于聚类HGS3)相关、但不与参与免疫反应基因的高表达相关(简称为血管生成(Angio)的聚类)。聚类HGS2的特征在于参与免疫反应的基因的上调，无参与血管生成或血管发育的基因的上调(简称为免疫(immune)的聚类)。

根据亚组的多变量存活分析揭示，与血管生成-免疫(Angioimmune)(HR＝0.58[0.41-0.82],padj＝0.001)和血管生成(Angio)聚类(HR＝0.55[0.37-0.80],padj＝0.001)两者中的患者相比，免疫(Immune)聚类中的患者具有显著延长的OS。Kaplan-Meier曲线显示于图2中(显示单变量HR和p-值)。

由于免疫(Immune)聚类中的患者比其他聚类中的那些具有显著更好的结果，我们继续开发测定以便在临床中前瞻性鉴定这些患者。此外，鉴于免疫聚类中的血管生成基因的低表达，我们假设该测定可以鉴定不受益于靶向血管生成的疗法的群体，尽管需要额外的数据集来测试该理论。为了特征标识生成的目的，将血管生成(Angio)和血管生成-免疫(Angioimmune)聚类分组在一起，并标记为“促血管生成”组。

然后开发可以鉴定免疫(immune)聚类中的患者的63-基因生物标志物测定法(表2)。与层次聚类分析一致，与其他HGS患者相比，通过该测定法分类为免疫(Immune)聚类中的患者具有显著改善的无进展存活率(PFS)(多变量分析；HR＝0.72[0.52-0.99],p＝0.043)和OS(多变量分析；HR＝0.61[0.44-0.86],p＝0.004)。这些多变量分析针对减瘤状态、分期、化疗和诊断时的年龄进行校正。根据爱丁堡数据集中的特征标识识别的PFS和OS的Kaplan-Meier曲线分别显示于图3A和3B中，其中单变量HR性能表示于每个图中。

为了将我们的生物标志物独立地验证为预后测定法，将其应用于Tothill等人.Clinical Cancer Research 2008:14(16):5198-208的数据集内的HGS卵巢肿瘤。与其他HGS患者相比，被鉴定为免疫(immune)聚类中的患者具有显著改善的PFS(多变量分析；HR＝0.62[0.41-0.95],p＝0.029)和OS(多变量分析；HR＝0.32[0.19-0.54],p＝0.00001)。这些多变量分析针对分级、分期、肿瘤辅助治疗和残留疾病进行校正。根据Tothill数据集中的特征标识识别的PFS和OS的Kaplan-Meier曲线分别显示于图4A和4B中，其中单变量HR性能表示于每个图中。

实施例2：“免疫”特征标识的预测效用的独立验证

背景

国际卵巢肿瘤合作7(ICON7)试验是一项妇科癌组间III期试验，该试验评估向卡铂和紫杉醇标准化疗同步添加贝伐珠单抗和添加贝伐珠单抗作为延续治疗在原发性腹膜癌、输卵管癌、和上皮卵巢癌患者中的效果(Perren TJ,Swart AM,Pfisterer J,LedermannJA,Pujade-Lauraine E,Kristensen G等人,A phase 3trial of bevacizumab inovarian cancer.N Engl J Med.365(26):2484-96,Aghajanian C,Blank SV,Goff BA,Judson PL,Teneriello MG,Husain A等人,OCEANS:A randomized,double-blind,placebo-controlled phase III trial of chemotherapy with or withoutbevacizumab in patients with platinum-sensitive recurrent epithelial ovarian,primary peritoneal,or fallopian tube cancer.Journal of ClinicalOncology.2012；30(17):2039-45)。

已经从ICON7报告患者特征、无进展生存期、毒性和初步总生存期数据及生活质量(QoL)数据概要。在标准化疗组中，764位女性中696位(91％)按研究方案接受18周化疗。在贝伐珠单抗组中，764位女性中719位(94％)接受18周化疗和贝伐珠单抗，并且472位(62％)继续接受贝伐珠单抗至第54周时方案完成为止。采用标准化疗和贝伐珠单抗时无进展生存期的风险比是0.81(95％CI 0.70-0.94，p＝0.004)。在面临高进展风险(定义为减积手术后残余病灶大于1.0cm的国际妇科学和产科联盟(FIGO)IV期疾病或III期疾病)的患者中，贝伐珠单抗组中的死亡风险比是0.64(95％CI 0.48-0.85；p＝0.002)。

方法

经由医学研究理事会(MRC)获得ICON7跟踪样品。诚实的中间人保留来自MRC的相关临床数据。已经基于临床因素进行用于分析样品概况的随机化策略。先前测试所有试剂、阵列和参考样品并通过合格标准。

为了证实诊断和组织学类型，两个专业妇科病理学家使用H+E载片独立地检查所有样品，并且使用WT1染色来证实有问题病例中的浆液性组织学。从FFPE块(几乎完全从附件肿块，而非腹膜或网膜疾病)取切片，并在明场显微镜下大体解剖(macrodissected)以尽可能减少基质污染(<10％)。使用的10μm切片的数量取决于块中的肿瘤的百分比：块中的>50％、25-50％和<25％肿瘤含量分别为二、三和四。

使用高纯RNA石蜡试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,曼海姆，德国)从大体解剖的FFPE组织提取总RNA。将RNA转化成互补性脱氧核糖核酸(cDNA)，随后使用WT-Ovation^TMFFPE RNA扩增系统V2的技术(NuGEN Technologies Inc.,San Carlos,CA,USA)，将所述cDNA扩增并转化成单链形式。随后将扩增的单链cDNA片段化并使用FL-Ovation^TMcDNA生物素模块V2(NuGEN Technologies Inc.)进行生物素标记。随后片段化和标记的cDNA与Almac卵巢癌DSA杂交，以此为基础，形成这种特征标识。使用Affymentrix扫描仪7G(Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA)扫描阵列。

病理学检查之后，在具有高级浆液性卵巢癌的样品中存在286个患者；144个患者来自贝伐珠单抗组，而142个患者来自无贝伐珠单抗组。据估计，69％的患者将在促血管生成患者组中，并且，这在两个研究组中将是相同的。

初步研究假设是，与免疫亚组相比，在“促血管发生”亚组内，将存在贝伐珠单抗的显著影响，这对应于无进展存活的风险比的至少对半。相比之下，期望的是，在“免疫”亚组中，贝伐珠单抗将充其量没有效果，或者甚至可以是稍微不利的。

五个样品未通过处理QC，从而在高级浆液性临床研究数据集中存在238个无进展存活事件(83％)。检测θ＞2(对应于前面段落中概述的贝伐珠单抗的差异作用)的估计的研究能率(study power)(利用C Schmoor,W Sauerbrei和M Schumacher Sample sizeconsiderations for the evaluation of prognostic factors in survival analysisStatist.Med.2000；19:441-452中的公式6)以10％单侧水平的统计学显著性为88％。数据集中存在147例死亡，且关于存活的相同分析能率为75％。

无进展存活率为主要终点；这是数据集中提供的MRC计算的时间。这是从随机化至进展或死亡(由于任何原因)(无论哪个在先)的时间。总存活率是次要研究终点。这是从随机化至由于任何原因的死亡的时间。

首先将分层Cox-比例风险模型拟合至无进展存活率数据。该模型具有随机化研究组的单一作用项。然后将第二分层Cox-比例风险模型拟合至无进展存活率数据。还将该模型分层，但具有用于各层内的随机化研究组的作用的分开项。

比较两种拟合模型的对数似然性，以确定随机化研究组的作用是否依赖于促血管发生状态(卡方检验，其中自由度对应于层-1的数目)。如果上面检验以5％水平的统计学显著性是统计学显著的，则将评价具有各层内的随机化研究组的分开项的模型的比例风险假设的适当性。

经由Grambsch-Therneau检验[P.Grambsch和T.Therneau(1994),Proportionalhazards tests and diagnostics based on weighted residuals.Biometrika,81,515-26]进行比例风险的检验。将无进展存活时间转化为对数标度用于检验。分别使用5％水平的统计学显著性评价对各层内的研究组的各项的检验。如果在所述层中的一个或多个内排斥比例风险的检验，然后使用灵活参数存活模型在各层内拟合受限平均存活模型[PRoyston,MKB Parmar The use of restricted mean survival time to estimate thetreatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazardsassumption is in doubt Stat Med,30(2011),pp.2409-2421]。这些模型将使用3自由度来估计基线分布函数和1自由度来估计时间依赖性治疗效果。在每种情况下计算受限平均值的最大时间为3年。

对于总存活率将重复上述分析。

结果

对于分类为免疫亚型中的患者(39％)，当与促血管生成的患者相比时，贝伐珠单抗的添加赋予更差的无进展存活率(HR 1.73(1.12-2.68))和总存活率(HR 2.00(1.11-3.61))。参见图5A-B和6A-B。因此，与没有免疫癌症亚型的受试者相比，当将贝伐珠单抗添加至其治疗方案时，具有免疫癌症亚型的受试者表现出不良预后。

实施例3：免疫特征标识的预后效用的独立验证

研究的主要目标是：1.对患者的基因表达数据使用63-基因特征标识预测肿瘤复发的个体风险；2.评估关于患者无进展存活(PFS)结果以及总生存期(OS)的特征标识预后预测的性能；3.研究临床协变量对关于无进展存活事件的特征标识预后性能的影响。

该探索性研究在研究的对照组中包括所有139个患者。据估计，85个患者(61.2％)将通过基因特征标识归类为促血管发生(特征标识为负)。图表和后续检查表明，72例具有无进展存活事件，其中该组中发生46例死亡(关于患者数和百分比的信息由Jim Paul提供)。

在Cox比例风险回归下使用样品大小和能率计算方法的回顾性能率计算((Freedman,L.S.(1982).Tables of the number of patients required in clinicaltrials using the log-rank test.Statistics in Medicine.1:121-129)表明，当以双侧5％水平的显著性比较“仅免疫”与“促血管生成”分子亚组患者的无进展存活率时，上述研究图将提供约85％能率来检测0.5的风险比(HR)。

进行使用无进展存活作为结果的至事件的时间(存活)分析以评估特征标识的预后效果。使用Kaplan-Meier(KM)曲线显现通过血管生成状态(“促血管生成或特征标识为负”和“仅免疫或特征标识为正”)定义的患者群体的存活分布。

进行Cox比例风险回归，以便将患者的血管生成状态(负或正)与无进展存活事件关联。除了单变量(未调整)探索以外，进行多变量(调整)Cox模型，以探索特征标识分子亚组(正或负)对针对其他重要临床协变量的PFS和OS调整的影响。从其中包括特征标识和标准预后变量的分析以95％置信区间报道所有估计的影响，而不论其显著性(P Royston,MKBParmar The use of restricted mean survival time to estimate the treatmenteffect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumptionis in doubt Stat Med,30(2011),pp.2409-2421)。由于大小限制，仅考虑少数重要协变量；这些包括FIGO分期，肿瘤分级，减瘤状态，表现状态(ECOG)和患者年龄。

在解释Cox模型结果之前，研究跨分子亚组的比例风险假设的适当性。与研究试验数据的前述分析一致，如果排斥比例风险的检验，则对于各分子亚组拟合受限平均存活模型。计算受限平均值的最大时间为4年。

结果

63-基因特征标识在ICON7试验数据的对照组(接受卡铂加上紫杉醇化疗治疗)中的高级浆液性(HGS)卵巢癌患者中是预后性的。使用Cox比例风险回归的结果显示，与针对其他临床协变量(包括年龄、分级、ECOG、减瘤状态和分期)调整之前(单变量HR＝0.48,95％CI＝0.32,0.72；p<0.001)和之后(多变量HR＝0.50；95％CI＝0.32,0.79；p＝0.003)被分类为促血管发生的患者相比，通过基因特征标识分类为“免疫”分子亚组的患者具有统计学显著性改进的无进展存活，参见图7A。类似地，与针对其他临床协变量调整之前(单变量HR＝0.46；95％CI＝0.26,0.80；p＝0.006)和之后(多变量HR＝0.53；95％CI＝0.29,0.97；p＝0.041)被分类为促血管发生的患者相比，分类为免疫分子亚组的患者具有统计学显著性更好的总存活率，参见图7B。该数据显示未严重偏离比例假设。

实施例4：无血管生成特征标识在结直肠癌中的预测性应用

获得了在plus 2阵列(E-GEOD-19862)上从患有复发性或转移性结直肠癌的贝伐珠单抗反应个体和反应个体组群的基因表达综合数据库获得的公共阵列数据集并使用表2的示例63基因特征标识分析。63基因卵巢免疫特征标识以AUC：0.86(0.60-1.00)预测响应于贝伐珠单抗。参见图8。

实施例5：63基因特征标识的概述

样品：

·内部训练样品：该样品集由从爱丁堡卵巢癌数据库中检索到的193份高级浆液性卵巢样品组成

·Tothill样品：这是公开获得的数据集，其中152份高级浆液性卵巢样品用于分析

·ICON7样品：该样品集由来自卡铂和紫杉醇的III期随机化试验(有或没有贝伐珠单抗第一线癌症治疗)的284份高级浆液性样品组成，其通过MRC(医学研究理事会)获得。

οICON7SOC(护理标准)-140个样品-是指没有接受贝伐珠单抗的添加的患者

οICON7免疫组-116个样品：这是指通过免疫63基因特征标识预测为免疫组中的ICON7样品

οICON7促血管生成(ProAngio)组-168个样品：这是指通过免疫63基因特征标识预测为促血管生成组中的ICON7样品

方法：

特征标识开发

在5-倍交叉验证(CV)的10次重复期间使用193个卵巢HGS样品的平衡样品集来开发使用PLS(Dejong S.Simpls-an Alternative Approach to Partial Least-SquaresRegression.Chemometr Intell Lab 1993；18:251-63)(偏最小二乘)方法的特征标识。在特征标识开发中使用以下步骤：

·使用各基因的中值探针组表达的log₂转化映射至测量的基因和基因表达的探针组

·在巢式CV内，遵循预过滤进行分位数归一化以去除具有低方差、低强度和与cDNA产量的高相关性的75％基因

·基于关联调整的t-得分和涉及的特征减少将基因/特征排序，丢弃10％的重要性最低的基因，直到剩余5个基因

·将63基因特征标识鉴定为在交叉验证下预测无进展存活(PFS)的风险比(HR)为最佳的特征集合

已经在CV内评估以下数据集以确定63基因特征标识的性能：

·内部训练集-193个样品

·ICON7SOC(护理标准)-140个样品

·ICON7免疫组-116个样品

·ICON7促血管生成(ProAngio)组-168个样品

核心基因分析

评估特征标识的核心基因集合的目的是基于其对当从特征标识去除时的性能的影响确定基因的排序。

该分析涉及来自原始63特征标识基因的10种特征标识基因的1,000,000次随机采样。在每次迭代时，去除10种随机选择的特征标识基因，并且当在以下3个数据集中去除这10种基因时，使用PFS终点评估剩余53种基因的性能以确定对HR性能的影响：

·内部验证-72个样品

·Tothill HGS(Tothill RW,Tinker AV,George J,等人Novel molecularsubtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinicaloutcome.Clin Cancer Res 2008；14:5198-208)(高级浆液性)-152个样品

·ICON7 SOC(护理标准)-140个样品

在这3个数据集各自内，基于其纳入或排除，基于HR性能的变化(ΔHR)将特征标识基因加权。排序为“1”的基因对当去除时的性能具有最阴性的影响，且排序为“63”的基因对当去除时的性能具有最小的影响。

最少基因分析

评估最少数量的基因的目的是确定是否可以在原始特征标识的较小子集内实现显著性能。

该分析涉及63特征标识基因的10,000次随机采样，其在1种基因/特征开始，最多达最多25种基因/特征。对于各随机选择的特征长度，使用PLS机器学习方法在推导的CV和模型参数下重新开发特征标识。在各特征长度，对于以下3个数据集，应用所有随机选择的特征标识以计算特征标识得分：

·Tothill HGS(高级浆液性)-152个样品

·ICON7 SOC(护理标准)-140个样品

·ICON7免疫组-116个样品

用PFS(无进展存活)评估连续特征标识得分，以确定HR(风险比)影响。概述在每一特征长度的所有随机特征标识的HR，且生成图以显现经CV的性能。

结果

特征标识开发

本部分呈现CV内的特征标识开发的结果。

·内部训练集合：图9、10和11显示其中鉴定63基因特征标识的训练集的AUC(受试者工作曲线下面积)、C-指数(一致性指数)和HR。

·ICON7 SOC:图12和13显示CV下的ICON7SOC样品的HR和C-指数。

·ICON7免疫组：图14显示CV下的ICON7免疫样品的HR(如通过63基因特征标识鉴定)。

·ICON7促血管生成(ProAngio)组：图15显示CV下的ICON7促血管生成(ProAngio)样品的HR(如通过63基因特征标识鉴定)。

核心基因分析

本部分中提供3个数据集中的63基因特征标识的核心基因分析的结果。

·内部验证：该数据集中对于63个特征标识基因测量的ΔHR性能显示于图16中。该图突出特征标识中的10个排序最前的基因，其在保留该数据集内的良好HR性能中是最重要的。

·Tothill HGS：该数据集中对于63个特征标识基因测量的ΔHR性能显示于图17中。该图突出特征标识中的10个排序最前的基因，其在保留该数据集内的良好HR性能中是最重要的。

·ICON7 SOC：该数据集中对于63个特征标识基因测量的ΔHR性能显示于图18中。该图突出特征标识中的10个排序最前的基因，其在保留该数据集内的良好HR性能中是最重要的。

·评估这3个数据集间的ΔHR以获得每个特征标识基因的组合基因排序。基于核心集合分析指定给特征标识基因的排序已经概述于Immune63GeneSig_CoreGenes_HR.txt中。

最少基因分析

本部分中提供3个数据集中的63基因特征标识的最少基因分析的结果。

·Tothill HGS:该数据集中使用1..25的特征长度的特征标识基因的随机采样测量的平均HR性能显示于图19中。该图显示，为了保留显著HR性能(即HR<1)，必须选择最少5个特征标识基因。

·ICON7 SOC：该数据集中使用1..25的特征长度的特征标识基因的随机采样测量的平均HR性能显示于图20中。该图显示，为了保留显著HR性能(即HR<1)，必须选择最少2个特征标识基因。

·ICON7免疫：该数据集中使用1..25的特征长度的特征标识基因的随机采样测量的平均HR性能显示于图21中。该图显示，为了保留显著HR性能(即HR<1)，必须选择最少5个特征标识基因。

总之，推荐可以使用最少至少5个基因，且将保留显著性能。

实施例6：结肠癌样品

样品和方法

样品

用63-基因特征标识评价来自具有II期、III期或IV期疾病的患者的529份新鲜冷冻(FF)的原代肿瘤样品，其中232份具有在接受辅助化疗之后跟进的无进展存活数据。来自在Affymetrix U133Plus 2.0平台上的基因表达概况分析的微阵列数据获得自公共领域(GEO登录号GSE40967)。

特征标识得分计算

使用以下步骤计算特征标识得分：

·强健多阵列分析(RMA)背景校正。

·使用中值表达将探针概述至探针组。

·使用中值表达将探针组概述至基因。

·以每个样品基础将分位数归一化模型应用至基因水平矩阵(或矢量)，其将个别患者基因概况的分布转化为与训练数据类似的分布。

·使用特征标识中每个样品的表达的加权总和来计算每个样品的特征标识得分：

其中w_i为每个基因的权重，b_i为基因特异性的偏差，x_i为预处理之后观察到的基因表达水平，且k＝0.2953是恒定偏移

统计分析

使用Cox比例风险回归模型来估计63-基因特征标识对辅助化疗之后的无进展存活的单变量风险比(HR)效应。使用对数秩检验计算HR估计的p值。

结果

图22提供了接受辅助化疗的232个患者中的特征标识预测的Kaplan Meier曲线，其显示63基因特征标识可以用于预测预后。从Cox比例风险回归计算的单变量HR是0.49，其中对数秩p＝0.001。“血管生成开”(“Angio on”)相当于生物标志物特征标识为负，且“血管生成关”(“Angio off”)相当于生物标志物特征标识为正。

实施例7：结直肠癌的亚型的预后效用

样品

公共阵列数据集获得自基因表达综合数据库(GSE40967)，其包含529个具有结直肠癌的患者的组群(Marrisa等人,2013)。在Affymetrix Plus 2.0阵列平台上分析样品概况。该数据包含II期、III期和IV期疾病的患者，232个患者接受辅助化疗，其具有随访无复发的存活(RFS)数据。

方法

使用RMA预处理所有样品，并且使用Entrez Gene IDs进行半监督层次聚类分析，其定义图1中的“血管生成”基因聚类(聚类4)以过滤数据矩阵。在针对中值基因表达值将过滤的数据矩阵标准化之后，使用欧几里得距离和Ward关联进行凝聚层次聚类分析。使用GAP统计学确定样品和基因聚类的最佳数目。由于用于聚类分析样品的基因列表对于血管生成生物学是高度富集的，这些基因上调的样品聚类被类别标记为血管生成活性的(或血管生成开(angio on))；且这些基因下调的那些被类别标记为血管发生无活性的(或血管生成关(angio off))。

用63-基因特征标识进一步检测样品，且使用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评估63基因特征标识得分和样品聚类(血管发生活性或血管发生无活性)之间的关联。优化用于将患者分类为结直肠癌内的血管发生活性/血管发生无活性的阈值，以便就如层次聚类分析所定义预测亚型而言尽可能提高灵敏度+特异性。

使用Kaplan Meier曲线和Cox-比例风险存活分析评估63-基因特征标识预测的临床显著性。将终点定义为无进展存活，且Cox-比例风险模型包括针对临床协变量(年龄；性别；分期；肿瘤位置和MSI状态)的调整。

结果

520个样品经历基于219个基因(定义图23中的聚类4的基因)的半监督的聚类分析。鉴定了两个样品聚类和3个基因聚类(图23)。样品聚类1(273个患者)的特征在于血管生成基因的表达的上调，因此被标记为血管生成活性的；且样品聚类2(256个患者)的特征在于血管生成基因的表达的下调，因此被标记为血管生成无活性的。

就预测两个样品聚类而言对于63-基因特征标识计算的AUC为0.86[0.83-0.89]，如图24中的ROC曲线所描绘。以0.6604的特征标识得分阈值定义用于预测亚型的灵敏度和特异性的最大总和；这是应用于将患者预测为血管生成活性或血管发生无活性亚型的阈值。具有特征标识得分>0.6604的患者被分类为血管生成活性的，且具有特征标识得分≤0.6604的患者被分类为血管生成无活性的。

通过特征标识预测的无进展存活的Cox-比例风险建模(针对临床协变量调整)揭示，与血管生成活性组中的患者相比，血管生成无活性组中的患者具有显著改善的无进展存活(表4：HR＝0.47[0.30-0.76])。Kaplan Meier曲线显示于图22中。

表4：使用232个辅助治疗的患者的多变量存活分析

实施例8：63-基因特征标识的预后效用的独立验证

样品

公共阵列数据集获得自基因表达综合数据库(GSE14333)，其包含290个具有结直肠癌的患者的组群(Jorissen等人,2009)。在Affymetrix Plus 2.0平台上分析样品概况。87个患者接受辅助化疗，其具有随访无复发存活(RFS)。

方法

用分类为血管生成活性或血管生成无活性的63-基因特征标识使用如实施例5中所定义的0.6604的阈值测试样品。

使用Kaplan Meier曲线和Cox-比例风险存活分析评估63-基因特征标识预测的临床显著性。将终点定义为无进展存活，且Cox-比例风险模型包括针对所有可得临床协变量(年龄；性别；分期和肿瘤位置)的调整。

结果

接受特征标识得分>0.6604的159个患者被分类为血管生成活性的；且接受特征标识得分≤0.6604的131个患者被分类为血管生成无活性的。

通过特征标识预测的无进展存活的Cox-比例风险建模(针对临床协变量调整)揭示，与血管生成活性组中的患者相比，血管生成无活性组中的患者具有显著改善的无进展存活(表5：HR＝0.33[0.14-0.83])。Kaplan Meier曲线显示于图25中。

表5：使用87个辅助治疗的患者的多变量存活分析

参考文献

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Claims (77)

1.用于选择是否向受试者施用抗血管生成治疗剂的方法，其包括：

测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平；

从所述一种或多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，

其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则抗血管生成治疗剂是禁忌的。

2.权利要求1的方法，其中评价所述样品对于所述生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括：

测定一种或多种生物标志物的样品表达得分；

将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。

3.权利要求1或2的方法，其中所述受试者正患有癌症。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述癌症是卵巢癌或结直肠癌。

5.权利要求4的方法，其中所述卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述受试者正在接受或已经接受用化疗剂的治疗。

7.治疗癌症的方法，其包括向受试者施用化疗剂且不施用抗血管生成治疗剂，其中基于如任一前述权利要求中请求保护的方法选择受试者用于治疗，且所述受试者对于所述生物标志物特征标识是阳性的。

8.治疗癌症的方法，其包括向受试者施用化疗剂且不施用抗血管生成治疗剂，其中通过以下选择所述受试者用于治疗：

测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平；

从所述生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，

其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则选择受试者用于治疗。

9.用于治疗受试者中的癌症的化疗剂，

其中基于如任一前述权利要求中请求保护的方法选择所述受试者用于治疗，且其中如果所述受试者对于所述生物标志物特征标识是阳性的，则不用抗血管生成治疗剂治疗所述受试者。

10.用于治疗受试者中的癌症的化疗剂，

其中通过以下选择所述受试者用于治疗：

测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平；

从所述生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，

其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则选择受试者用于治疗，

且其中所述受试者不用抗血管生成治疗剂治疗。

11.治疗癌症的方法，其包括向受试者施用化疗剂，其中所述受试者对于通过选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平定义的生物标志物特征标识是阳性的，且其中不施用抗血管生成治疗剂。

12.用于治疗受试者中的癌症的化疗剂，

其中所述受试者对于通过选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平定义的生物标志物特征标识是阳性的，且其中所述受试者不用抗血管生成治疗剂治疗。

13.权利要求6至8或11中任一项的方法或权利要求9、10或12中任一项的化疗剂，其中所述化疗剂包含基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

14.权利要求6至8或11中任一项的方法或权利要求9、10或12中任一项的化疗剂，其中所述化疗剂包含基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

15.权利要求6至8或11中任一项的方法或权利要求9、10或12中任一项的化疗剂，其中所述化疗剂包含卡铂和/或紫杉醇。

16.权利要求1至8、11或13至15中任一项的方法或权利要求9、10或12至15中任一项的化疗剂，其中所述抗血管生成治疗剂是靶向VEGF-途径的治疗剂，血管生成素-TIE2途径抑制剂，内源性血管生成抑制剂或免疫调节剂。

17.权利要求16的方法或化疗剂，其中所述靶向VEGF-途径的治疗剂选自贝伐珠单抗(Avastin)、阿柏西普(VEGF Trap)、IMC-1121B(雷莫芦单抗(ramucirumab))、伊马替尼(Gleevec)、索拉替尼(多吉美(Nexavar))、吉非替尼(易瑞沙(Iressa))、舒尼替尼(索坦(Sutent))、厄洛替尼、Tivozinib、西地尼布(Recentin)、帕唑帕尼(Votrient)、BIBF1120(Vargatef)、度维替尼、司马沙尼(Sugen)、阿昔替尼(AG013736)、凡德他尼(Zactima)、尼洛替尼(Tasigna)、达沙替尼(Sprycel)、伐他拉尼(vatalanib)、莫特塞尼、ABT-869、TKI-258或其组合。

18.权利要求16的方法或化疗剂，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂选自AMG-386、PF-4856884CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠单抗(Herceptin)或其组合。

19.权利要求16的方法或化疗剂，其中所述内源性血管生成抑制剂选自血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤抑素(Tumstatin)、血管能抑素(Canstatin)、抑制蛋白、血管抑制素、Vasostatin、干扰素α或其组合。

20.权利要求16的方法或化疗剂，其中所述免疫调节剂选自沙利度胺和来那度胺。

21.权利要求16的方法或化疗剂，其中所述靶向VEGF-途径的治疗剂是贝伐珠单抗。

22.权利要求1至8、11或13至21中任一项的方法或权利要求9、10或12至21中任一项的化疗剂，其中所述生物标志物包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

23.权利要求1至8、11或13至21中任一项的方法或权利要求9、10或12至21中任一项的化疗剂，其中所述生物标志物包含表2中列出的生物标志物。

24.权利要求7至8、11或13至23中任一项的方法或权利要求9、10或12至23中任一项的化疗剂，其中评价所述样品对于所述生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括：

测定一种或多种生物标志物的样品表达得分；

将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。

25.权利要求7至8、11或13至24中任一项的方法或权利要求9、10或12至24中任一项的化疗剂，其中所述受试者正患有癌症。

26.权利要求25的方法或化疗剂，其中所述癌症是卵巢癌，任选高级浆液性卵巢癌，或结直肠癌。

27.权利要求2或24的方法或权利要求24的化疗剂，其中使用各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值定义于表2中。

28.权利要求2或24的方法或权利要求24的化疗剂，其中使用各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

29.权利要求1至8、11或13至28中任一项的方法或权利要求9、10或12至28中任一项的化疗剂，其中生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

30.权利要求1至8、11或13至28中任一项的方法或权利要求9、10或12至28中任一项的化疗剂，其中生物标志物组包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

31.用于确定患有癌症的受试者的临床预后的方法，其包括：

测量来自受试者的样品中选自表2或表3的一种或多种生物标志物的表达水平；

从所述一种或多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，

其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则所述受试者具有良好预后。

32.权利要求28的方法，其中评价所述样品对于所述生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括：

测定所述生物标志物的样品表达得分；

将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。

33.权利要求31或32的方法，其中所述良好预后表明与对于所述生物标志物特征标识为阴性(样品表达得分低于所述阈值得分)的样品相比增加的无进展存活率或总存活率。

34.权利要求31-33中任一项的方法，其中所述癌症是卵巢癌或结直肠癌。

35.权利要求34的方法，其中所述卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

36.权利要求31-35中任一项的方法，其中所述受试者正在接受、已经接受和/或将接受化疗治疗和/或将不接受用抗血管生成治疗剂的治疗。

37.权利要求36的方法，其中所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

38.权利要求36的方法，其中所述化疗治疗包括施用基于铂的化疗剂、有丝分裂抑制剂或其组合。

39.权利要求36的方法，其中所述化疗治疗包括施用紫杉醇和卡铂。

40.权利要求31至39中任一项的方法，其中所述生物标志物包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

41.权利要求31至40中任一项的方法，其中所述生物标志物包含表2中列出的生物标志物。

42.权利要求32至41中任一项的方法，其中使用各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值定义于表2中。

43.权利要求32至41中任一项的方法，其中使用各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

44.权利要求31至43中任一项的方法，其中所述生物标志物包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

45.权利要求31至44中任一项的方法，其中所述生物标志物包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

46.用于选择是否向受试者施用贝伐珠单抗的方法，其包括：

在从患有卵巢癌的受试者获得的测试样品中，所述受试者正在、已经和/或将使用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗；

测量选自表2或表3的生物标志物中的一种、两种或更多种、最多达所有的表达水平；

从一种、两种或更多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，

基于所述样品对于生物标志物特征标识是否是阳性的来选择治疗，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则贝伐珠单抗是禁忌的。

47.权利要求46的方法，其中评价所述样品对于所述生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括：

测定一种、两种或多种生物标志物的样品表达得分；

将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。

48.权利要求46或47的方法，其中所述卵巢癌包含浆液性卵巢癌。

49.权利要求48的方法，其中所述浆液性卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

50.权利要求46至49中任一项的方法，其中如果贝伐珠单抗是禁忌的，则所述患者用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗。

51.权利要求46至49中任一项的方法，其中如果所述样品表达得分低于所述阈值得分，则所述患者用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂连同贝伐珠单抗进行治疗。

52.权利要求46至51中任一项的方法，其中所述基于铂的化疗剂包含卡铂。

53.权利要求46至52中任一项的方法，其中所述有丝分裂抑制剂包括紫杉烷，任选紫杉醇。

54.权利要求46至453中任一项的方法，其中所述生物标志物包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

55.权利要求46至53中任一项的方法，其中所述生物标志物包含表2中列出的生物标志物。

56.权利要求47至55中任一项的方法，其中使用各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值列于表2中。

57.权利要求47至55中任一项的方法，其中使用各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

58.权利要求46至57中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

59.权利要求46至58中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

60.用于确定受试者的临床预后的方法，其包括：

a.在从患有卵巢癌或结直肠癌的受试者获得的测试样品中，所述受试者正在、已经和/或将使用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂进行治疗；

b.测量选自表2或表3的生物标志物中的一种或多种、最多达所有的表达水平；

c.从所述一种或多种生物标志物的表达水平评价来自受试者的样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的，其中如果所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的，则所述受试者具有良好预后。

61.权利要求60的方法，其中评价所述样品对于所述生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括：

a.测定所述一种或多种生物标志物的样品表达得分；

b.将所述样品表达得分与阈值得分进行比较；和

c.确定所述样品表达得分是否高于或等于阈值表达得分，其中如果所述样品表达得分高于或等于阈值得分，则所述样品对于生物标志物特征标识是阳性的。

62.权利要求60或61的方法，其中所述卵巢癌包含浆液性卵巢癌。

63.权利要求62的方法，其中所述浆液性卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。

64.权利要求60至63中任一项的方法，其中如果所述患者具有良好预后，则使用贝伐珠单抗的治疗是禁忌的。

65.权利要求60至63中任一项的方法，其中如果所述样品表达得分低于所述阈值得分，则所述患者用基于铂的化疗剂和/或有丝分裂抑制剂连同贝伐珠单抗进行治疗。

66.权利要求60至65中任一项的方法，其中所述基于铂的化疗剂包含卡铂。

67.权利要求60至66中任一项的方法，其中所述有丝分裂抑制剂包括紫杉烷，任选紫杉醇。

68.权利要求60至67中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一种或多种。

69.权利要求60至67中任一项的方法，其中所述生物标志物组包含表2中列出的生物标志物。

70.权利要求61至69中任一项的方法，其中使用各生物标志物的权重值和偏差值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重值和偏差值定义于表2中。

71.权利要求61至69中任一项的方法，其中使用各生物标志物的权重值计算所述表达得分，且其中各生物标志物的权重排序于如表3中定义的递减绝对值中。

72.权利要求60至71中任一项的方法，其中所述生物标志物包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一种或多种。

73.权利要求60至72中任一项的方法，其中所述生物标志物包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一种或多种。

74.权利要求60至73中任一项的方法，其中所述良好预后表明与对于所述生物标志物特征标识为阴性(样品表达得分低于所述阈值得分)的样品相比增加的无进展存活率或总存活率。

75.权利要求1至8、11或13至74中任一项的方法或权利要求9、10或12至30中任一项的化疗剂，其包括测量来自所述受试者的样品中选自表2或表3的两种或更多种生物标志物的表达水平。

76.权利要求1至8、11或13至74中任一项的方法或权利要求9、10或12至30中任一项的化疗剂，其包括测量来自所述受试者的样品中选自表2或表3的五种或更多种生物标志物的表达水平。

77.权利要求1至8、11或13至76中任一项的方法或权利要求9、10或12至30中任一项的化疗剂，其中评价所述样品对于生物标志物特征标识是阳性还是阴性的包括使用分类树或随机森林。