CN101910416A - 在癌症患者中诊断性使用的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文中公开了对于鉴定有可能给癌症患者赋予最佳临床好处的疗法有用的方法和组合物。

Description

在癌症患者中诊断性使用的方法和组合物

相关申请

本申请要求2007年11月9日提交的美国临时申请流水号60/986,884(通过述及将其完整内容收入本文)的优先权。

发明领域

本发明涉及对于监测用抗血管发生疗法治疗的癌症患者和预测临床结果有用的方法和组合物。

发明背景

癌症是对人类健康的最致命威胁之一。仅在美国，癌症每年影响近130万新患者，而且是位于心血管疾病之后的第二位死因，占4例死亡中的大约1例。实体瘤对大多数那些死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步，但是所有癌症的总体5年存活率在最近20年里只改进了约10％。癌症(或称作恶性肿瘤)以不受控制的方式快速生长和转移，使得及时检测和处理极端困难。

根据癌症类型，患者通常有数个治疗选项可用，包括化疗、辐射和基于抗体的药物。对于预测不同治疗方案的临床结果有用的诊断方法会大大有利于这些患者的临床管理。数项研究探索了基因表达与特定癌症类型的鉴定(例如通过突变特异性测定法、微阵列分析、qPCR、等)的关联。此类方法对于患者所呈现的癌症的鉴定和归类可能是有用的。然而，关于基因表达对临床结果的预测或预后价值所知道的要少得多。

如此，需要客观的、可再现的方法来预测癌症患者的治疗结果(诸如无进展存活)或监测此类治疗的进展并由此为每位患者选择最佳的治疗方案。

发明概述

本发明的方法可以在多种设置中利用，包括例如帮助治疗癌症患者的方法或药物开发过程期间的患者选择、预测用特定治疗方案治疗患者个体时成功的可能性；评估疾病进展；监测治疗功效；为患者个体确定预后及评估个体受益于特定抗癌疗法的倾向。

本发明部分基于如下的发现，即患有癌症的患者中某些生物标志物的表达水平与单独的抗血管发生疗法的临床好处降低有关。因而，在一个方面，本发明提供了一种鉴定会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的癌症患者的方法，包括检测自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平的步骤，其中所述样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达与参照样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法(anti-cancertherapy other than or in addition to anti-angiogenic therapy)。在一个实施方案中，所述来自患者的样品是在抗血管发生疗法之前或开始时获得的。

在另一个方面，本发明提供了一种预测癌症患者对抗血管发生疗法的响应性的方法，包括测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，其中所述样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与参照样品相比升高指示所述患者不太可能响应单独的抗血管发生疗法。在一个实施方案中，所述来自患者的样品是在抗血管发生疗法之前或开始时获得的。

本发明还提供了一种治疗癌症患者的方法，包括给所述患者施用不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法，其中自所述患者获得的样品与参照样品相比显示表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平升高。在一个实施方案中，所述来自患者的样品是在抗血管发生疗法之前或开始时获得的。

在又一个方面，本发明提供了一种为癌症患者制备个性化基因组学序型(personalized genomics profile)的方法，包括测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，比较所述表达水平与参照样品中相应基因或基因产物的表达水平，并创建总结自此类分析获得的数据的报告，其中所述报告包括为所述患者预测单独的抗血管发生疗法的临床好处的可能性，其中自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与所述参照样品中的表达水平相比升高指示不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的临床好处的可能性升高。在一个实施方案中，所述来自患者的样品是在抗血管发生疗法之前或开始时获得的。

临床好处可以通过评估各种终点来测量，例如一定程度地抑制疾病进展，包括减缓和完全阻滞；减少疾病发作和/或症状的数目；缩小损害尺寸；抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病细胞浸润入临近周围器官和/或组织；抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病扩散；减轻自身免疫应答，其可以但非必然导致疾病损害的消退或消融；一定程度地减轻与病症有关的一种或多种症状；治疗后无疾病呈现(例如无进展存活)的长度延长；总体存活延长；响应率升高；和/或治疗后给定时间点的死亡率降低。

还提供了包括阵列的试剂盒，所述阵列包含能够特异性杂交表1所列一种或多种基因的多核苷酸，其中所述试剂盒进一步包括使用所述阵列来预测对单独的抗血管发生疗法的响应性的指令，其中所述一种或多种基因的表达与参照样品中相应基因的表达水平相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

本发明还提供了能够检测表1所列两种或更多种基因或基因产物的表达水平的化合物套组(set of compound)，其中使用所述化合物套组测定得出，自癌症患者获得的样品中所述两种或更多种基因或基因产物的表达与参照样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。在一个实施方案中，所述化合物套组能够检测表1所列所有基因或基因产物的表达水平。所述化合物套组可以是例如多核苷酸或蛋白质。在一个实施方案中，所述来自患者的样品是在抗血管发生疗法之前或开始时获得的。

本发明还部分基于对于监测抗血管发生疗法治疗进展有用的生物标志物的鉴定。如此，本发明提供了一种监测正在用抗血管发生疗法治疗的癌症患者中的治疗进展的方法，包括测定第一次肿瘤评估时自患者获得的样品中表2所列一种或多种基因或基因产物的表达水平的步骤，其中第一次肿瘤评估时所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平相比升高指示所述患者倾向于对单独的抗血管发生疗法的临床好处降低。

在另一个方面，本发明提供了一种鉴定会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的癌症患者的方法，包括测定第一次肿瘤评估时自患者获得的样品中表2所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，其中第一次肿瘤评估时所述一种或多种基因或基因产物的表达与在治疗之前或开始时自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症患者的方法，包括给所述患者施用不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法，其中自所述患者获得的样品显示第一次肿瘤评估时表2所列一种或多种基因或基因产物的表达水平与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品相比升高。

还提供了包括阵列的试剂盒，所述阵列包含能够特异性杂交表2所列一种或多种基因的多核苷酸，其中所述试剂盒进一步包括使用所述阵列来检测对单独的抗血管发生疗法的响应性的指令，其中第一次肿瘤评估时所述一种或多种基因的表达与在治疗之前或开始时所述一种或多种基因的表达水平相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

本发明还提供了能够检测表2所列两种或更多种基因或基因产物的表达水平的化合物套组，其中使用所述化合物套组测定得出，第一次肿瘤评估时自癌症患者获得的样品中所述两种或更多种基因或基因产物的表达与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。在一个实施方案中，所述化合物套组能够检测表2所列所有基因或基因产物的表达水平。所述化合物套组可以是例如多核苷酸或蛋白质。

在本发明的任何方法中，所述样品可以是组织或细胞样品或者是自血浆和/或血清获得的。

在一些实施方案中，本发明的方法包括测定表1或2所列至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或任何数目直至所有基因的表达水平。

在一些实施方案中，所述一种或多种基因或基因产物的表达水平可以在核酸水平、蛋白质水平或者蛋白质的分泌或表面表达水平测定。

在本发明方法的一些实施方案中，所述癌症是癌或癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、和白血病(leukemia)。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肉瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小无核裂细胞性NHL；贮积病(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)或梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。

在一个实施方案中，所述癌症是肾细胞癌。

本发明的方法可以与抗血管发生疗法一起实施，所述抗血管发生疗法包括施用抗血管发生剂，诸如但不限于VEGF-A或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体或拮抗剂、抗PDGFR抑制剂诸如Gleevec^TM(ImatinibMesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁、内皮他丁、等。参见例如Klagsbrun and D’Amore，Annu.Rev.Physiol.，53：217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene，22：3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中的抗血管发生疗法的表3)；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine5：1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene，22：6549-6556(2003)(例如列举已知的抗血管发生因子的表2)；及Sato.Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。

在一些实施方案中，所述抗血管发生疗法包括施用抗VEGF抗体。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体是贝伐单抗(bevacizumab)。

发明详述

除非另有说明，本发明的实施会采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分解释，诸如″Molecular Cloning：ALaboratory Manual″，second edition(Sambrook et al.，1989)；″OligonucleotideSynthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1987)；″Methods in Enzymology″(Academic Press，Inc.)；″Current Protocols inMolecular Biology″(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，and periodic updates)；″PCR：The Polymerase Chain Reaction″(Mullis et al.，eds.，1994)。

除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导：Singleton et al.，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley & Sons(New York，N.Y.1994)，及March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms andStructure 4th ed.，John Wiley & Sons(New York，N.Y.1992)。

通过述及完整收录本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)。

I.定义

术语“阵列”或“微阵列”在用于本文时指可杂交阵列元素，优选多核苷酸探针(例如寡核苷酸)在基片上的有序排列。基片可以是固体基片(诸如玻璃载玻片)或半固体基片(诸如硝酸纤维素膜)。核苷酸序列可以是DNA、RNA、或其任意排列。

“靶序列”、“靶核酸”或“靶蛋白质”在用于本文时指想要检测的感兴趣的多核苷酸或蛋白质。一般而言，“模板”在用于本文时指包含靶核苷酸序列的多核苷酸。在有些情况中，术语“靶序列”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”、及其变异可互换使用。

“扩增”在用于本文时一般指生成多拷贝的所需序列的过程。“多拷贝”指至少2个拷贝。“拷贝”不必指与模板序列有完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可包括诸如脱氧肌苷的核苷酸类似物、故意引入的序列改变(诸如通过包含能与模板杂交但不互补的序列的引物而引入的序列改变)、和/或在扩增过程中发生的序列错误。

若基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量大于该基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量，则该基因、蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达/量与第二样品中的表达/量相比升高。表达水平/量可以基于本领域已知的任何合适标准来测定，包括但不限于mRNA、cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝。表达水平/量可以定性和/或定量测定。在一个实施方案中，基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量的升高是相应基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量的至少约1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍、或100倍。在一个实施方案中，将样品关于所测定的RNA或蛋白质的量的差异和所使用的RNA或蛋白质样品的质量的变异性二者标准化。此类标准化可以通过测量和引入某些标准化基因(包括公知的持家基因，诸如GAPDH)的表达来实现。或者，标准化可基于所有所测定基因或其大子集的均值或中值信号(整体标准化办法)。以逐个基因为基础，将患者肿瘤mRNA或蛋白质的测量标准化量与参照集中找到的量比较。可以将每位患者的每份测试肿瘤的每种mRNA或蛋白质的标准化表达水平表述成相对于在参照集中测量得出的表达水平的百分比。在要分析的特定患者样品中测量得出的表达水平会落在此范围内的一些百分点处，这可通过本领域公知方法来测定。

“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。

术语“样品”在用于本文时指获得自或衍生自感兴趣的受试者的组合物，其包含有待例如根据物理、生化、化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。此类样品包括自患者获得的组织或细胞样品。样品还可以是自血浆获得。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记用组分偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleicacid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固相支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR₂(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样地且完全适用于寡核苷酸。

“引物”一般是短的单链多核苷酸，一般具有游离的3′-OH基团，其通过与靶序列杂交而结合目的样品中潜在存在的靶，然后促进与靶互补的多核苷酸的聚合。

术语“生物标志物”在用于本文时一般指其在哺乳动物组织或细胞中/上的表达可以通过标准方法(或本文所披露的方法)来检测且预测、诊断和/或预后哺乳动物组织或细胞对基于抑制血管发生的治疗方案(例如抗血管发生剂，诸如VEGF特异性抗体)的敏感性的分子，包括基因、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂。任选的是，此类生物标志物的表达测定出高于在对照/参照组织或细胞样品中所观察到的。此类生物标志物的表达可使用高通量多路免疫测定法来测定，诸如那些可购自Rules Based Medicine，Inc.或MesoScale Discovery的。生物标志物的表达还可使用例如PCR或FACS测定法、免疫组织化学测定法或基于基因芯片的测定法来测定。

“组织或细胞样品”指从受试者或患者的组织得到的细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞；或血浆。组织样品还可以是原代的或培养的细胞或细胞系。任选的是，组织或细胞样品是从癌性组织/器官得到的。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。为本发明目的，组织样品的“切片”指一块或一片组织样品，例如从组织样品上切下来的一薄片组织或细胞。

“关联”或“联系”指以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果进行比较。例如，可以将第一分析或方案的结果用于实施第二分析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的结果来决定是否应当实施第二分析或方案。就基因表达分析或方案的实施方案而言，可以使用基因表达分析或方案的结果来决定是否应当实施特定治疗方案。

术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成手段来生产。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)、及天然存在的等位变体。

多肽“变体”意指与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如在多肽的N-末端或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽将具有至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选的是，至少约90％的氨基酸序列同一性，和甚至更优选的是，至少约95％的氨基酸序列同一性。

“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。应当理解，抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A的抗体、VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂诸如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore，Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene 22：3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等，Oncogene 22：6549-6556(2003)(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。

术语“VEGF”或“VEGF-A”用于指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.Science，246：1306(1989)；及Houck et al.Mol.Endocrin.，5：1806(1991)所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PlGF在内的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外，神经毡蛋白-1已经被鉴定为肝素结合VEGF-A同种型(isoform)的受体，而且可在血管发育中发挥作用。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽或多肽片段。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF₁₆₅”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。

“VEGF生物学活性”包括对任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性，调节诸如对正常的和异常的血管发生(angiogenesis)和脉管发生(vasculogenesis)(Ferrara和Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18：4-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77：527-543)；促进胚胎脉管发生和血管发生(Carmeliet etal.(1996)Nature 380：435-439；Ferrara et al.(1996)Nature 380：439-442)；及调控雌性生殖道中的和为了骨生长和软骨形成的周期性血管增殖(Ferrara et al.(1998)Nature Med.4：336-340；Gerber et al.(1999)Nature Med.5：623-628)。在作为血管发生和脉管发生中的血管发生因子之外，VEGF，作为多效生长因子，在生理过程诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙内流中展现出多种生物学效应(Ferrara和Davis-Smyth(1997)，见上文；及Cebe-Suarez et al.Cell.Mol.Life Sci.63：601-615(2006))。此外，最近的研究报道了VEGF对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、胰导管细胞、和许旺(Schwann)细胞的促有丝分裂效应(Guerrin et al.(1995)J.CellPhysiol.164：385-394；Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126：125-132；Sondell et al.(1999)J.Neurosci.19：5731-5740)。

“VEGF特异性拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子(肽基或非肽基分子)。优选的是，VEGF特异性拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。优选的是，受到VEGF特异性拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)、或VEGF₁₆₅。在本发明的方法中有用的VEGF特异性拮抗剂包括特异性结合VEGF的肽基或非肽基化合物，诸如抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF的多肽或其片段、和特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体(例如可溶性VEGF受体蛋白质或其VEGF结合片段，或嵌合VEGF受体蛋白质)结合的受体分子及衍生物、至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的反义核酸寡聚物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体(peptibodies)；及VEGF适体。

“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。所选择的抗体通常会具有足够强的对VEGF的结合亲和力，例如，该抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可用作治疗剂，用于靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患。还有，该抗体可进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。例子包括HUVEC抑制测定法(如下文实施例中所描述的)；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO 89/06692中所记载的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)；及激动活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。优选的抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1；依照Presta etal.(1997)Cancer Res.57：4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体结合相同表位的单克隆抗体，包括但不限于称作贝伐单抗(Bevacizumab，BV；AVASTIN

)的抗体。贝伐单抗包括突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的优选的抗体包括G6或B20系列抗体(例如，G6-31、B20-4.1)，如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的。关于别的优选的抗体，参见美国专利No.7,060,269；6,582,959；6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP0666868B1；美国专利申请公开文本No.2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409，和20050112126；及Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。其它优选的抗体包括那些结合人VEGF上功能性表位的，所述功能性表位包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103、和C104或者包含残基F17、Y21、Q22、Y25、D63、I83和Q89。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。例如，例如，VEGF特异性拮抗性抗体结合VEGF并抑制VEGF诱导血管内皮细胞增殖的能力。优选的是，阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。

除非另有说明，表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体优选改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。

“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合(该结合的本质可以是共价的，例如在scFv中)的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上限定了抗原结合位点。六个CDR或其子集一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是通常亲和力低于完整结合位点。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler etal.，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)及Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)(1984)。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmannet al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.，Nature Biotechnology 14：309-314(1996)；Sheets et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.95：6157-6162(1998)；Hoogenboomand Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来生成。在受到攻击时，观察到人抗体生成，它在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及以下科学出版物：Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg andHuszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole et al.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)；及美国专利No.5,750,373。

“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的。多肽或抗体的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽或抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽或抗体重量超过95％且最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选的银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽或抗体包括重组细胞内的原位多肽或抗体。然而，分离的多肽或抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。

在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于试图延迟疾病或病症的发生/发展。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。治疗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该抗体在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该治疗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量低于治疗有效量。在癌变前、良性、早期或晚期肿瘤的情况中，血管发生抑制剂的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小原发性肿瘤尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与病症有关的一种或多种症状。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。

“无进展存活短”指第一次肿瘤评估时的进展。根据癌症或肿瘤的类型，第一次肿瘤评估的时间发生于治疗启动后约4、3、2或1个月。第一次肿瘤评估的时间取决于特定疾病进展有多快。在一个实施方案中，肾癌的第一次肿瘤评估的时间是抗癌疗法开始后56天。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。

“受试者”或“患者”指哺乳动物，包括但不限于人和非人哺乳动物，诸如牛、马、犬、绵羊、或猫。优选的是，受试者或患者是人。

术语“抗癌疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂，诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(Tarceva^TM))、血小板衍生生长因子抑制剂(例如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如celecoxib)、干扰素、细胞因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂(例如中和性抗体)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2、和其它生物活性和有机化学剂，等。本发明还包括它们的组合。

术语“抗血管发生疗法”指对于抑制血管发生有用的疗法，其包括施用抗血管发生剂。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyn；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如TAXOL

帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE

多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE

长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(Tarceva^TM))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。

该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX

他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON

托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE

醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN

依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA

来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX

阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZYME

核酸)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN

疫苗、LEUVECTIN

疫苗和VAXID

疫苗；PROLEUKIN

rIL-2；LURTOTECAN

拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX

rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。

“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会，本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。

“降低/减轻或抑制”指与参照相比降低活性、功能、和/或量。“降低或抑制”指引起优选20％或更多、更优选50％或更多、和最优选75％、85％、90％、95％、或更多的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、原发性肿瘤的大小、或血管发生性病症中血管的大小或数目。

术语“诊断”在用于本文时指鉴定分子或病理状态、疾病或疾患，诸如鉴定癌症，或者指鉴定会受益于特定治疗方案的癌症患者。术语“预后”在用于本文时指预测抗癌疗法的治疗好处的可能性。术语“预测”在用于本文时指患者将对特定抗癌疗法有好的或不好的响应的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者在治疗(例如用特定治疗剂的治疗)后是否存活或改善和/或存活或改善且某段时间不复发疾病的可能性。本发明的预测方法在临床上可用于做出治疗决定，为任何特定患者选择最适宜的治疗形式。本发明的预测方法是有价值的工具，用于预测患者是否可能对治疗方案有好的响应，诸如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合、外科手术干预、类固醇治疗等，或用于预测患者在治疗方案后是否可能长期存活。

“患者响应”可利用表明对患者有益处的任何终点来评估，包括但不限于：(1)一定程度地抑制疾病进展，包括减缓和完全阻滞；(2)缩小损害尺寸；(3)抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病细胞浸润入临近周围器官和/或组织；(4)抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病扩散；(5)一定程度地减轻与病症有关的一种或多种症状；(6)治疗后无疾病呈现的长度延长；和/或(8)治疗后给定时间点的死亡率降低。

术语“长期”存活在用于本文时指治疗性处理后存活至少1年、5年、8年、或10年。

II.血管发生抑制剂

抗血管发生剂包括但不限于下列药剂：VEGF抑制剂，诸如VEGF特异性拮抗剂、EGF抑制剂、EGFR抑制剂、TIE2抑制剂、IGF1R抑制剂、COX-II(环氧合酶II)抑制剂、MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、和MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂、CP-547,632(Pfizer Inc.，NY，USA)、Axitinib(PfizerInc.；AG-013736)、ZD-6474(AstraZeneca)、AEE788(Novartis)、AZD-2171)、VEGF Trap(Regeneron/Aventis)、Vatalanib(也称作PTK-787，ZK-222584：Novartis & Schering A G)、Macugen(pegaptanib octasodium，NX-1838，EYE-001，Pfizer Inc./Gilead/Eyetech)、IM862(Cytran Inc.of Kirkland，Wash.，USA)；和angiozyme，来自Ribozyme(Boulder，Colo.)和Chiron(Emeryville，Calif.)的一种合成核酶，及其组合。VEGF抑制剂披露于美国专利No.6,534,524和6,235,764，将它们完整收入本文用于所有目的。

VEGF特异性拮抗剂指能够结合VEGF，降低VEGF表达水平，或者中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物学活性(包括VEGF与一种或多种VEGF受体的结合及由VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖)的分子。在本发明的方法中有用的VEGF特异性拮抗剂包括特异性结合VEGF的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物、融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron))、和VEGF121-白树毒素(Peregrine)。VEGF特异性拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗性变体、针对VEGF的反义核碱基寡聚物、针对VEGF的小RNA分子、RNA适体、肽体、和针对VEGF的核酶。下文描述了这些每一项的例子。

VEGF抑制剂诸如抗VEGF抗体包括以足够亲和力和特异性结合VEGF且能降低或抑制VEGF生物学活性的任何抗体或其抗原结合片段。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。优选的抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1；依照Presta et al.(1997)见上文生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体结合相同表位的单克隆抗体，包括但不限于称作贝伐单抗(Bevacizumab，BV；AVASTIN

)的抗体。贝伐单抗包括突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的优选的抗体包括G6或B20系列抗体(例如，G6-31、B20-4.1)，如PCT申请公开No.WO2005/012359中所记载的。关于别的优选的抗体，参见美国专利No.7,060,269，6,582,959，6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请公开No.2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409，及20050112126；及Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。其它优选的抗体包括那些结合人VEGF上功能性表位的抗体，所述功能性表位包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103、和C104或者包含残基F17、Y21、Q22、Y25、D63、I83和Q89。

两种表征最全面的VEGF受体是VEGFR1(也称作Flt-1)和VEGFR2(鼠同系物也称作KDR和FLK-1)。每一种受体对每一种VEGF家族成员的特异性有所不同，但是VEGF-A结合Flt-1和KDR二者。全长Flt-1受体包括具有七个Ig结构域的胞外结构域、跨膜结构域、和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及VEGF结合，而胞内结构域涉及信号转导。

特异性结合VEGF的VEGF受体分子或其片段可以在本发明的方法中用作结合和隔绝VEGF蛋白，由此阻止它发信号的VEGF抑制剂。优选的是，VEGF受体分子或其VEGF结合片段是可溶性形式，诸如sFlt-1。受体的可溶性形式发挥对VEGF蛋白生物学活性的抑制效应，其通过结合VEGF，由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体来实现。还包括VEGF受体融合蛋白，下文描述了它们的例子。

嵌合VEGF受体蛋白指具有自至少两种不同蛋白质(其中至少一种是VEGF受体蛋白，例如flt-1或KDR受体)衍生的氨基酸序列且能够结合并抑制VEGF生物学活性的受体分子。优选的是，本发明的嵌合VEGF受体蛋白由自只有两种不同VEGF受体分子衍生的氨基酸序列组成；然而，可以将包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、或所有七个来自flt-1和/或KDR受体胞外配体结合区的Ig样结构域的氨基酸序列连接至来自其它无关蛋白质的氨基酸序列，例如免疫球蛋白序列。与Ig样结构域组合的其它氨基酸序列对于本领域普通技术人员会是显而易见的。优选的嵌合VEGF受体蛋白的例子包括可溶性Flt-1/Fc、KDR/Fc、或FLt 1/KDR/Fc(也称作VEGF Trap)(参见例如PCT申请公开文本No.WO97/44453)。

本发明的可溶性VEGF受体蛋白或嵌合VEGF受体蛋白包括没有经跨膜结构域而固定至细胞表面的VEGF受体蛋白。因此，VEGF受体(包括嵌合受体蛋白)的可溶性形式，虽然能够结合并灭活VEGF，但是不包含跨膜结构域，并如此一般不会变成与该分子在其中表达的细胞的细胞膜相结合。

别的VEGF抑制剂记载于例如WO 99/24440，PCT国际申请PCT/IB99/00797，WO 95/21613，WO 99/61422，美国专利No.6,534,524，美国专利No.5,834,504，WO 98/50356，美国专利No.5,883,113，美国专利No.5,886,020，美国专利No.5,792,783，美国专利No.6,653,308，WO 99/10349，WO 97/32856，WO 97/22596，WO 98/54093，WO 98/02438，WO 99/16755，及WO 98/02437，通过述及将它们都完整收入本文。

III.本发明的方法

本发明部分基于与抗血管发生疗法用于治疗癌症的临床好处降低有关的特定生物标志物的鉴定。如此，所公开的方法和测定法提供了便利的、有效的、和潜在划算的手段来获得在评估用于治疗癌症患者的适宜或有效疗法中有用的数据和信息。例如，可以对癌症患者实施活检以获得组织或细胞样品，并通过各种体外测定法来检查所述样品以确定表1所列一种或多种基因的表达与对照或参照样品相比是否升高。如果检测到表达升高，那么所述患者可能受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。如此，本发明提供了一种鉴定会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的癌症患者的方法，包括测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，其中自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与参照样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。本发明还提供了一种筛选癌症患者以确定用不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法治疗的合适性的方法，包括测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，其中自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与参照样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。本发明进一步提供了一种预测癌症患者对抗血管发生疗法的响应性的方法，包括测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，其中自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与参照样品相比升高指示所述患者不太可能响应单独的抗血管发生疗法。还提供了一种治疗癌症患者的方法，包括给患者施用不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法，其中自患者获得的样品显示与参照样品相比表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平升高。

还鉴定了对于监测抗血管发生疗法的进展有用的生物标志物。如此，本发明提供了一种监测正在用抗血管发生疗法治疗的癌症患者中的治疗进展的方法，包括测定第一次肿瘤评估时自患者获得的样品中表2所列一种或多种基因或基因产物的表达水平的步骤，其中第一次肿瘤评估时所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平相比升高指示所述患者倾向于对单独的抗血管发生疗法的临床好处降低。本发明还提供了一种鉴定会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的癌症患者的方法，包括测定第一次肿瘤评估时自患者获得的样品中表2所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，其中第一次肿瘤评估时所述一种或多种基因或基因产物的表达与在治疗之前或开始时自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。本发明进一步提供了一种治疗癌症患者的方法，包括给患者施用不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法，其中第一次肿瘤评估时自患者获得的样品显示与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品相比表2中一种或多种基因或基因产物的表达水平升高。

本发明的方法涉及癌症患者。所述癌症可以是例如癌或癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和/或白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小无核裂细胞性NHL；贮积病(bulkydisease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)或梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。在一个实施方案中，所述癌症是肾细胞癌。

包含靶生物标志物的样品可通过本领域公知的方法获得，而且它们适于特定类型和位置的感兴趣癌症。组织活检通常用于获得有代表性的癌性组织片。或者，可以已知或认为包含感兴趣癌细胞的组织/流体的形式间接获取细胞。例如，癌性损害的样品可通过切除术、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰/唾液、胸膜液或血液中获得。可从癌症或肿瘤组织或从其它身体样品诸如尿、痰、血清或血浆中检测出基因或基因产物。上述用于检测癌性样品中靶基因或基因产物的同样技术可用于其它身体样品。癌细胞从癌症损害部位脱落下来，并出现在这些身体样品中。通过筛选这些身体样品，可实现对于这些癌症的简单早期诊断。另外，通过对这些身体样品测试靶基因或基因产物，可以更加容易地监测治疗的进程。

对组织制备物富集癌细胞的手段是本领域已知的。例如，可以从石蜡或低温保存的切片中分离组织。癌细胞也可通过流式细胞术或激光捕捉显微解剖而与正常细胞分开。这些以及其它从正常细胞中分离癌性细胞的技术是本领域公知的。如果癌组织被正常细胞高度污染，那么检测签名基因(signaturegene)或蛋白质表达序型可能更为困难，然而最小化污染和/或假阳性/阴性结果的技术是已知的，其中一些在下文有描述。例如，也可以对样品评估生物标志物的存在情况，所述标志物已知与感兴趣的癌细胞有关但与相应的正常细胞无关，反之亦然。

在本发明的方法中，获得哺乳动物组织或细胞样品并分析一种或多种生物标志物的表达。样品中各种生物标志物的表达可通过多种方法来分析，其中许多是本领域已知的和熟练技术人员了解的，包括但不限于免疫组织化学和/或Western印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光活化的细胞分拣(FACS)等等、基于定量血液的测定法(例如血清ELISA)(用于检查例如蛋白质表达水平)、生化酶促活性测定法、原位杂交、Northern分析和/或PCR分析mRNA、以及可通过基因和/或组织阵列分析来实施的极其多种测定法之任一。用于评估基因和基因产物的状态的典型方案可见于例如Ausubel et al.eds.，1995，Current Protocols In Molecular Biology，单元2(Northern印迹)、单元4(Southern印迹)、单元15(免疫印迹)和单元18(PCR分析)。也可使用多路免疫测定法，诸如那些自Rules Based Medicine或MesoScale Discovery(MSD)可得的。

在本发明的一些实施方案中，使用免疫组织化学和染色方案来检验样品中靶蛋白质的表达。组织切片的免疫组织化学染色已经显示为评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体来探查和原位显现细胞抗原，一般通过显色或荧光方法。

对于样品制备，可以使用来自哺乳动物(典型的是人类患者)的组织或细胞样品。样品的例子包括但不限于组织活检、血液、肺吸出物、痰、淋巴液、血浆等。可以通过本领域已知的多种规程来获得样品，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，样品是固定和包埋在石蜡或类似物中的。

可以通过常规方法来固定(即保存)组织样品(参见例如“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，”3rdedition(1960)Lee G.Luna，HT(ASCP)Editor，The Blakston DivisionMcGraw-Hill Book Company，New York；The Armed Forces Institute ofPathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel，Editor，Armed Forces Institute of Pathology，American Registryof Pathology，Washington，D.C.)。本领域普通技术人员将领会，固定剂的选择由样品是用于组织学染色还是其它分析的目的来决定。本领域普通技术人员还将领会，固定时长取决于组织样品的大小和所使用的固定剂。例如，可以使用中性缓冲的福尔马林、Bouin氏液或低聚甲醛来固定样品。

一般而言，将样品首先固定，然后通过酒精递增系列脱水，用石蜡或其它切片介质渗透和包埋使得该组织样品可以切片。或者，可以将组织切片并将所得切片固定。例如，可以通过常规方法学将组织样品包埋和加工(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute ofPathology″，见上文)。可以使用的石蜡的例子包括但不限于Paraplast、Broloid、和Tissuemay。一旦将组织样品包埋，就可以用切片机等等将样品切片(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology”，见上文)。对于此规程，例如，切片的厚度范围可以是约3微米至约5微米。一旦切片，就可以通过数种标准方法将切片附着至载玻片。载玻片粘合剂的例子包括但不限于硅烷、明胶、聚L-赖氨酸等等。例如，可以将石蜡包埋的切片附着于带正电荷的载玻片和/或聚L-赖氨酸包被的载玻片。

若使用石蜡作为包埋材料，则一般将组织切片脱石蜡和复水。可以通过数种方法学将组织切片脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和酒精逐渐递减系列(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology”，见上文)。或者，可以使用商品化的脱石蜡用非有机试剂，诸如Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。

任选的是，在样品制备后，可以使用IHC来分析组织切片。IHC可以联合别的技术进行，诸如形态学染色和/或荧光原位杂交。可利用IHC的两种常用方法，即直接和间接测定法。依照第一种测定法，直接测定抗体对靶抗原的结合。此直接测定法使用经过标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的一抗，其可以在没有进一步抗体相互作用的情况下显现。在一种典型的间接测定法中，未偶联的一抗结合至抗原，然后经过标记的二抗结合至一抗。若二抗偶联有酶标记物，则添加显色或荧光底物以提供抗原显现。因为数个二抗可以与一抗上的不同表位起反应，所以发生了信号放大。

用于免疫组织化学的一抗和/或二抗通常用可检测模块标记抗体。可利用许多标记物，一般可分成以下几类：

(a)放射性同位素，诸如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I。例如，可使用CurrentProtocols in Immunology，Volumes 1 and 2，Coligen等，Ed.，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.1991中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。

(b)胶体金颗粒。

(c)荧光标记物，包括但不限于稀士螯合物(铕螯合物)、德州红、若丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或商品化荧光团诸如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任一种或多种的衍生物。例如，可使用Current Protocols in Immunology，见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。

(d)可利用各种酶-底物标记物且美国专利No.4,275,149中提供了有关它们中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量(例如使用化学发光计)或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O′Sullivan等Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，Methods inEnzym.，J.Langone & H.Van Vunakis Ed.，Academic Press，New York，73：147-166(1981)。

酶-底物组合的例子包括例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，其以过氧化氢为底物，其中过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；

(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和

(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物(例如4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷)。

本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述四大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。

在上文讨论的样品制备规程外，可能还需要在IHC之前、期间或之后对组织切片进行进一步的处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中对组织样品进行加热(参见例如Leong et al.Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。

在任选的封闭步骤后，组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间，使得第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验来确定。抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定。优选的是，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化生色底物诸如3，3′-二氨基联苯胺色原体(chromogen)的化学变化。优选的是，将酶标记物偶联至特异性结合第一抗体的抗体(例如第一抗体是兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗兔抗体)。可以将如此制备的标本封固并盖上盖玻片。然后进行载玻片评估，例如利用显微镜，并且可以采用本领域常规使用的染色强度标准。

在备选方法中，可以在足以使抗体-生物标志物复合物形成的条件下使样品接触对所述生物标志物特异性的抗体，然后检测所述复合物。可以以多种方式来检测生物标志物的存在，诸如通过Western印迹和ELISA规程，其用于测定极其广泛的组织和样品，包括血浆或血清。可利用多种使用这样测定法的免疫测定技术，参见例如美国专利4,016,043；4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“三明治/夹心式”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法也包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。

三明治测定法是最有用且常用的测定法之一。三明治测定技术有许多变化形式，本发明意图涵盖所有这些变化形式。简言之，在一种典型的正向测定法(forward assay)中，将未标记的抗体固定化在固体基片上，使待测试的样品接触所结合的分子。温育足以容许抗体-抗原复合物形成的合适长度的一段时间后，添加对抗原特异性的、用能够生成可检测信号的报道分子标记的第二抗体并温育足以使另一复合物即抗体-抗原-标记抗体形成的一段时间。洗去任何未反应的物质，并通过由报道分子生成的信号的观察结果来测定抗原的存在。结果可以是定性的，即通过可见信号的简单观察，或者可以量化，即通过与包含已知量生物标志物的对照样品比较。

这项测定法的变化形式包括同时测定法，其中将样品和经标记抗体二者同时添加至所结合的抗体。这些技术是本领域技术人员所熟知的，包括任何显而易见的微小变化。在一种典型的正向三明治测定法中，具有针对生物标志物的特异性的第一抗体或是共价的或被动的结合至固体表面。所述固体表面典型地是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙稀或聚丙烯。所述固体支持物可以是管、珠、微孔板的盘、或适于实施免疫测定法的任何其它表面的形式。结合过程是本领域众所周知的，一般由交联、共价结合或物理吸附组成，清洗聚合物-抗体复合物，为测试样品做好准备。将待测样品的等分试样添加至固相复合物，并在合适条件(例如室温至40℃，诸如25℃和32℃之间，含两端值)下温育足够时间(例如2-40分钟或过夜，如果更方便的话)以容许抗体中存在的任何亚基结合。温育期后，将抗体亚基固相清洗并干燥并与对生物标志物的一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接有用于指示第二抗体对分子标志物结合的报道分子。

一种备选方法牵涉将样品中的靶生物标志物固定化，然后将固定化的靶物暴露于未标记的或用报道分子标记的特异性抗体。根据靶物的量和报道分子信号的强度，所结合的靶物可以是通过用抗体直接标记而可检测的。或者，将经标记的、对第一抗体特异性的第二抗体暴露于靶物-第一抗体复合物以形成靶物-第一抗体-第二抗体三元复合物。该复合物通过报道分子发射的信号来检测。“报道分子”在用于本说明书时指通过其化学本质提供分析上可鉴定的信号从而容许检测抗原所结合抗体的分子。这类测定法中最常用的报道分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。

在酶免疫测定法的情况中，有酶偶联至第二抗体，一般通过戊二醛或高碘酸的手段。然而，正如易于领会的，有极其多种不同偶联技术可供技术人员使用。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。与特定酶一起使用的底物一般选择成在被相应的酶水解后生成可检测的颜色变化。合适的酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也有可能采用荧光底物，其生成荧光产物而非上文所述显色底物。在所有情况中，将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志物复合物，容许结合，然后洗去过量的试剂。然后将含有适宜底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合物。底物与第二抗体所连接的酶起反应，给出定性可视信号，其可以进一步量化，通常通过分光光度法，以给出样品中存在的生物标志物的量的指示。或者，可以将荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)化学偶联至抗体而不改变其结合能力。在被特定波长的光照射而激活后，荧光团标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发状态，接着以光学显微镜在视觉上可检测的特征性颜色发光。在EIA中，容许荧光标记的抗体结合至第一抗体-分子标志物复合物。洗去未结合的试剂后，将剩余的三元复合物然后暴露于适宜波长的光，所观察到的荧光指示存在感兴趣的分子标志物。免疫荧光和EIA技术都是本领域已完善建立的。然而，也可以采用其它报道分子，诸如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。

本发明涵盖，上文所述技术也可用于检测表1或2所列一种或多种靶基因的表达。

本发明的方法进一步包括检验组织或细胞样品中表1或2所列一种或多种靶基因的mRNA的存在和/或表达的方案。用于评估细胞中mRNA的方法是众所周知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法(诸如使用经标记的对表1或2所列一种或多种基因特异性的RNA探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(诸如使用对表1或2所列一种或多种基因特异性的互补引物的RT-PCR，及其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。

可以使用Northern、点印迹或PCR分析对来自哺乳动物的组织或细胞样品测定mRNA。例如，RT-PCR测定法(诸如定量PCR测定法)是本领域众所周知的。在本发明的一个例示性实施方案中，用于检测生物学样品中的靶mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；使用靶多核苷酸作为有义和反义引物扩增如此生成的cDNA以扩增其中的靶cDNA；并检测所扩增靶cDNA的存在。另外，此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中靶mRNA的水平(例如通过同时检验“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平)。任选的是，可以测定所扩增靶cDNA的序列。

本发明的任选方法包括通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中mRNA(诸如靶mRNA)的方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录和标记以生成cDNA探针。然后将所述探针杂交至在固体支持物上固定化的核酸阵列。所述该阵列配置成阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将其表达与抗血管发生疗法的临床好处升高或降低有关的基因选集在固体支持物上形成阵列。经标记探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析可提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在单一实验中评估数以千计基因的mRNA表达序型(expression profile)(参见例如2001年10月11日公布的WO 01/75166；参见例如美国专利5,700,637；5,445,934；和5,807,522；Lockart，Nature Biotechnology，14：1675-1680(1996)；Cheung，V.G.et al.，Nature Genetics 21(Suppl)：15-19(1999)，关于阵列制作的讨论)。DNA微阵列是包含基因片段的微型阵列，所述基因片段或是在玻璃或其它基质上直接合成或是点到玻璃或其它基质上。单一阵列中通常呈现数以千计的基因。一个典型的微阵列实验牵涉以下步骤：1)自分离自样品的RNA制备荧光标记的靶物；2)将经标记的靶物杂交至微阵列；3)清洗，染色，和扫描阵列；4)分析扫描图像；并5)生成基因表达序型。当前使用两种主要类型的DNA微阵列：包含自cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列和寡核苷酸(通常25-70聚物)阵列。在形成阵列时，寡核苷酸可以是预制并点到表面上的，或者是直接在表面上合成的(原位)。

Affymetrix GeneChip

系统是包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列的商品化微阵列系统。探针/基因阵列：寡核苷酸(通常25聚物)通过组合基于半导体的光刻和固相化学合成技术直接合成到玻璃晶片上。每个阵列包含多至400,000种不同寡聚物，每种寡聚物以数以百万计拷贝存在。因为寡核苷酸探针是在阵列上已知位置合成的，所以杂交样式和信号强度可以通过Affymetrix Microarray Suite软件解读成基因身份和相对表达水平。每种基因通过一系列不同寡核苷酸探针呈现在阵列上。每个探针对由完全匹配寡核苷酸和错配寡核苷酸组成。完全匹配探针具有与特定基因精确互补的序列，因而测量该基因的表达。错配探针因中央碱基位置的单一碱基替代而不同于完全匹配探针，从而扰乱了靶基因转录物的结合。这有助于测定有助于对完全匹配寡聚物测得的信号的背景和非特异性杂交。Microarray Suite软件将错配探针的杂交强度从完全匹配探针的杂交强度中扣除，以确定每个探针集的绝对或特异强度。探针的选择基于Genbank和其它核苷酸库的当前信息。认为其序列识别基因3’末端的独特区域。使用基因芯片杂交炉(“电转烤炉”)来进行多至64个阵列的同时杂交。射流站实施探针阵列的清洗和染色。它是完全自动化的，包括四个模块，每个模块持有一个探针阵列。每个模块经由Microarray Suite软件使用预编程射流方案独立控制。扫描仪是共焦激光荧光扫描仪，其测量由结合至探针阵列的经标记cRNA发射的荧光强度。安装有Microarray Suite软件的计算机工作站控制射流站和扫描仪。Microarray Suite软件可以控制多至八个射流站，使用探针阵列的预编程的杂交、清洗、和染色方案。该软件还获取杂交强度数据并使用适宜的算法将其转变成每种基因的有/无呼叫(presence/absence call)。最后，该软件通过比较分析来检测各实验间基因表达的变化，并将输出格式化为.txt文件，其可以与其它软件程序一起用于进一步的数据分析。

组织或细胞样品中选定生物标志物的表达还可以通过基于功能或活性的测定法来检验。例如，若生物标志物是酶，则可以实施本领域已知测定法来测定或检测组织或细胞样品中给定酶活性的存在。

本发明的试剂盒具有许多实施方案。一个典型的实施方案是包括容器、所述容器上的标签、和所述容器内的组合物的试剂盒，其中所述组合物包含能结合靶多肽序列(对应于表1或2所列一种或多种基因)的第一抗体，所述容器上的标签指出该组合物可用于评估至少一种类型的哺乳动物细胞中靶蛋白质的存在，及使用抗体来评估至少一种类型的哺乳动物细胞中靶蛋白质存在的说明书。该试剂盒可以进一步包含一套用于制备组织样品并将抗体和探针应用于组织样品的同一切片的说明书和材料。该试剂盒可以包括第一抗体和第二抗体二者，其中所述第二抗体偶联有标记物，例如酶标记物。

另一个实施方案是包括容器、所述容器上的标签、和所述容器内的组合物的试剂盒，其中所述组合物包含能在严格条件下与表1或2所列一种或多种基因的多核苷酸序列杂交的一种或多种多核苷酸，所述容器上的标签指出该组合物可用于评估至少一种类型的哺乳动物细胞中表1或2所列一种或多种靶基因的存在，及使用多核苷酸来评估至少一种类型的哺乳动物细胞中靶RNA或DNA存在的说明书。

试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种缓冲剂(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂(诸如可以被酶标记物化学改变的底物，例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。

剂量和施用

对于本发明的方法，抗癌治疗剂、抗血管发生剂和/或化疗剂依照已知方法施用给人类患者，诸如静脉内施用，例如作为推注或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面或吸入路径。优选静脉内或皮下施用抗体。

本发明的治疗可涉及抗VEGF抗体与一种或多种化疗剂的联合施用。本发明涵盖不同化疗剂的混合物(cocktail)的施用。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药物配制剂的共施用，及任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥其生物学活性。此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的说明书使用或由熟练从业人员根据经验确定。化疗的制备和剂量给药方案还可参阅Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams &Wilkins，Baltimore，MD(1992)。化疗剂可以在施用抗体之前或之后，或者可以同时给予。

为了预防或治疗疾病，抗癌治疗剂或抗血管发生剂的适宜剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、是为了预防还是治疗目的施用药剂、先前的疗法、患者的临床史及对药剂的响应、及主治医师的判断。恰当的将药剂一次性或在一系列治疗中施用给患者。在联合治疗方案中，以治疗有效量或协同量施用本发明的组合物。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂是抗VEGF抗体。根据疾病类型和严重性，例如，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或是通过连续输注。根据上述因素，典型的每日剂量的范围可以是约1μg/kg至约100mg/kg或更多。对于持续数天或更长时间的重复施用，根据状况，维持治疗直到发生对疾病症状的期望遏制。然而，可以用其它剂量方案。在一个优选的方面，本发明的抗体每两至三周施用一次，剂量范围为约5mg/kg至约15mg/kg。更优选的是，此类剂量给药方案与化疗方案联合使用，作为治疗转移性结肠直肠癌的一线疗法。在一些方面，化疗方案包括传统的高剂量间歇性施药。在一些其它方面，用更小且更频繁的剂量施用化疗剂而无预定的中断(“节奏性化疗(metronomicchemotherapy)”)。本发明疗法的进展可容易地通过常规技术和测定法来监测。

在一些实施方案中，本发明方法中所使用的抗VEGF抗体是贝伐单抗。在某些实施方案中，例如当联合使用时，以约0.05mg/kg至约15mg/kg的范围施用贝伐单抗。在一个实施方案中，可以给受试者施用约0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg、10mg/kg或15mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。这些剂量可间歇施用，例如每天、每三天、每周或每两至三周。在另一个实施方案中，例如当联合使用时，以隔周10mg/kg或每三周15mg/kg给受试者静脉内施用贝伐单抗。

仅仅出于例示目的，提供下列实施例，不应解释为限制本文中的教导。

实施例

实施例1：自肾细胞癌患者的样品收集生物标志物数据

在基线和治疗第56天(第一次肿瘤评估)自转移性肾细胞癌患者收集血浆样品。所有样品是自用10mg/kg贝伐单抗IV q2wks治疗24个月的患者获得的。在测定样品中特定基因的蛋白质水平的测定法之前，在缓冲液中稀释样品。一式一份或一式两份为每份患者样品生成四个稀释点，它们在预备试验中确定为落在每种测定法的标准范围内。使用ELISA测定法或使用多路免疫测定法对样品分析各蛋白质的表达水平。

通用ELISA测定法规程

将ELISA孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中的1μg/ml捕捉抗体于2-8℃包被过夜。清除包被液后，通过封闭液(PBS/0.5％ BSA，150μl/孔)与一起温育1-2小时，封闭非特异性结合位点。用清洗液(PBS/0.05％ Tween)清洗板后，添加在测定缓冲液(PBS/0.5％ BSA/0.05％ Tween-20/10ppm Proclin 300/0.25％ CHAPS/0.35M NaCl/5mM EDTA，pH 7.4)中稀释的标准品或样品(100μl/孔)。温育2小时后，清洗板，添加偶联有HRP的抗体(100μl/孔)并再温育1小时。再次清洗后，添加100ul四甲基联苯胺底物(TMB)，容许显色15-30分钟，并通过添加1M磷酸(100μl/孔)来终止反应。使用微量板读板仪(ThermoLabsystems，Finland)于450-630nm波长读板。自标准曲线的4参数拟合外推样品中的蛋白质浓度。

多路免疫测定法数据

还使用General Meso Scale Discovery MSD多路规程(血管损害组I、II和生长因子组)收集免疫测定法数据。简言之，将板在150ul/孔封闭液A(组I、II)或酪蛋白缓冲液(生长因子组)中于室温在摇动中封闭至少1小时。将板用PBS/0.05％ Tween-20(组I、II)或PBS(生长因子组)清洗3次。向板添加40μl/孔(组I、II)测定稀释液和10μl/孔校准品或样品(在封闭液A中1∶5预稀释(组I、II))或25μl/孔测定稀释液和25μl/孔校准品或样品(在测定稀释液中1∶5预稀释(生长因子组))，并将这些于室温在摇动中温育2小时。将板清洗3次，之后添加25ul/孔检测抗体试剂并于室温在摇动中温育1小时。清洗板并添加150ul/孔含表面活性剂的1X阅读缓冲液T并在MSD 6000成像仪上读数。

还在Rules-Based Medicine(Austin，Texas)使用HumanMAP 1.6版基于珠的测定法收集多路免疫测定法数据。所述测定法是一式三份实施的。

实施例2：生物标志物数据的统计分析

对生物标志物数据的分析是使用热图进行的，热图是研究多变量数据(诸如自DNA微阵列生成的数据)例行实施的一类簇分析(Eisen，M.B.，Spellman，P.T.，Brown，P.O.，and Botstein，D.Cluster analysis and display ofgenome-wide expression patterns.PNAS 95(25)，14863-14868，1998)。为在基线时测量得到的生物标志物数据、在第一次肿瘤评估(第56天)时测量得到的数据、和这两次评估(基线和第56天)之间的差异分开生成热图。分析是使用广泛可得的统计分析程序R实施的。为了为分析准备数据，首先如下将它们相对于Z得分标准化。在每个数据集内，通过减去它们的均值来集中每种生物标志物的数值，然后通过将集中后的数值除以它们的均方根值(这是通过计算集中后的数值的平方的总和的平方根除以数值数目减1获得的)来定标。对于差异热图，作为基线和第56天Z得分之间的差异来计算Z得分，在组合数据集上计算。

观察到的生物标志物数值的Z得分指示该数值比观察到的或建立的均值高或低的标准偏差数目。Z得分的可能范围介于负无穷大和正无穷大之间。为了为簇分析准备好数据，我们将这些Z得分换算成Z得分分位数，它的可能范围介于0和1之间。Z得分分位数为标准正态随机变量会距均值给定数目个标准偏差的概率。

然后使用R中的热图功能以缺省值自Z得分分位数生成热图。这生成了数据的彩色图像，其中生物标志物的高表达以品红色呈现，而低表达以青色呈现，其中表达是相当于数据集中的其它样品而言的。热图还使用分级聚簇算法将生物标志物和样品重排次序，分级聚簇算法是多变量数据分析中已完全建立的规程。分级聚簇算法首先将每种生物标志物指派至其自己的簇，然后迭代连接两个最相似的簇，直至只剩下单个簇。在每个阶段，使用它们的欧几里得距离来计算各簇之间的距离。使用R中的缺省设置，也就是，使用完全连接方法，计算两个最接近的簇。

通过检查临床协变量(也就是，无进展存活、对治疗的响应、和损害尺寸的变化)和生物标志物的生物学特征来解释这些分析生成的簇。在基线数据中，对热图的审查揭示了一簇高表达基因(碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Rantes、P选择蛋白、PDGF、VEGF-C、CD40配体、脑衍生神经营养因子(BDNF)和纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI1))，其符合作为贝伐单抗治疗的好响应者的患者发生率高。然而，不是此类治疗的所有响应者都展现出这些基因的高表达。在基线数据中，对热图的审查还揭示了一簇高表达基因，其符合无进展存活短(例如小于4个月)的相对较高发生率。下文表1列出了这些基因。

表1

血清淀粉状蛋白P

补体C3

ICAM 1

触珠蛋白

C反应性蛋白质

纤维蛋白原

sNRP1

α-1抗胰蛋白酶

VCAM-1

白介素6

血清淀粉状蛋白A

差异热图揭示了与无进展存活短(例如小于4个月)有关的一簇高表达基因。下文表2列出了这些基因。

表2

CD40配体

表皮生长因子(EGF)

1型金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)

脑衍生神经营养因子

1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)

VEGF C

干细胞因子

上皮衍生嗜中性粒细胞激活蛋白78(ENA-78，也称作CXCL5)

碱性成纤维细胞生长因子

PDGF BB

RANTES

P-选择蛋白

白介素18

白介素1ra

白介素8

巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP 1-α，也称作CCL3)

ICAM-1

CD40

ICAM-1

α-1抗胰蛋白酶

肿瘤坏死因子受体II

β-2微球蛋白

免疫球蛋白IgM

免疫球蛋白IgA

白介素6

降钙素

基质金属蛋白酶9(MMP-9)

Claims (24)

1.一种鉴定会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的肾癌患者的方法，包括

测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，

其中自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与参照样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

2.一种预测肾癌患者对抗血管发生疗法的响应性的方法，包括

测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，

其中自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与参照样品相比升高指示所述患者不太可能响应单独的抗血管发生疗法。

3.权利要求1或2的方法，其中所述抗血管发生疗法包含施用VEGF特异性拮抗剂。

4.权利要求3的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂是抗VEGF抗体。

5.权利要求4的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。

6.权利要求1或2的方法，其中自患者获得的样品是组织样品或是自血浆获得的。

7.一种为肾癌患者制备个性化基因组学序型的方法，包括

测定自患者获得的样品中表1所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，

比较所述表达水平与参照样品，并

创建总结自所述测定和/或比较步骤获得的数据的报告，其中所述报告包括为所述患者预测的单独的抗血管发生疗法的临床好处的可能性，

其中自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与参照样品相比升高指示不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的临床好处的可能性升高。

8.一种包括阵列的试剂盒，所述阵列包含能够特异性杂交表1所列一种或多种基因的多核苷酸，其中所述试剂盒进一步包括使用所述阵列来预测肾癌患者对单独的抗血管发生疗法的响应性的指令，其中所述一种或多种基因的表达与参照样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

9.一种能够检测表1所列两种或更多种基因或基因产物的表达水平的化合物套组，其中使用所述化合物套组测定得出，自肾癌患者获得的样品中所述两种或更多种基因或基因产物的表达与参照样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

10.权利要求9的化合物套组，其中所述化合物是多核苷酸。

11.权利要求9的化合物套组，其中所述化合物是蛋白质。

12.权利要求9的化合物套组，其中所述化合物套组能够检测表1所列所有基因或基因产物。

13.一种监测正在用抗血管发生疗法治疗的肾癌患者中的治疗进展的方法，包括

测定第一次肿瘤评估时自患者获得的样品中表2所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，

其中第一次肿瘤评估时所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品相比升高指示所述患者倾向于对单独的抗血管发生疗法的临床好处降低。

14.一种鉴定会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法的肾癌患者的方法，包括

测定第一次肿瘤评估时自患者获得的样品中表2所列一种或多种基因或基因产物的表达水平，

其中第一次肿瘤评估时所述一种或多种基因或基因产物的表达水平与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

15.权利要求13或14的方法，其中所述抗血管发生疗法包含施用VEGF特异性拮抗剂。

16.权利要求15的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂是抗VEGF抗体。

17.权利要求16的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。

18.权利要求13或14的方法，其中自患者获得的样品是组织样品或是自血浆获得的。

19.权利要求13的方法，其中降低的临床好处是无进展存活短、响应率低或总体存活低。

20.一种包括阵列的试剂盒，所述阵列包含能够特异性杂交表2所列一种或多种基因的多核苷酸，其中所述试剂盒进一步包括使用所述阵列来检测肾癌患者对单独的抗血管发生疗法的响应性的指令，其中第一次肿瘤评估时自所述患者获得的样品中所述一种或多种基因的表达与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

21.一种能够检测表2所列两种或更多种基因或基因产物的表达水平的化合物套组，其中使用所述化合物套组测定得出，第一次肿瘤评估时自肾癌患者获得的样品中所述两种或更多种基因或基因产物的表达与在抗血管发生疗法之前或开始时自所述患者获得的样品相比升高指示所述患者会受益于不同于抗血管发生疗法或包括抗血管发生疗法在内的抗癌疗法。

22.权利要求21的化合物套组，其中所述化合物是多核苷酸。

23.权利要求21的化合物套组，其中所述化合物是蛋白质。

24.权利要求21的化合物套组，其中所述化合物套组能够检测表2所列所有基因或基因产物。