PT2327792E - Métodos e composições para a detecção de distúrbios autoimunes - Google Patents

Description

ΕΡ2327792Β1

DESCRIÇÃO MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A DETECÇÃO DE DISTÚRBIOS AUTO-

IMUNES

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se geralmente aos campos de determinação molecular de doenças auto-imunes. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos e composições com base em assinaturas moleculares únicas associadas a várias aspectos de distúrbios auto-imunes.

ANTECEDENTES

Agora acredita-se que um número de distúrbios auto-imunes sejam caracterizado pela produção de auto-anticorpos contra uma lvariedade de auto-antigénios. Por exemplo, lúpus eritematoso sistémico (SLE) é uma doença auto-imune em que auto-anticorpos causa dano ao órgão por ligação a células e tecidos hospedeiros e pela formação de complexos imunes que se depositam em tecidos vasculares e activam células imunes. A síndrome de Sjogren é uma doença auto-imune caracterizada por inflamação nas glândulas do corpo. Outros distúrbios auto-imunes são também comummente encontrados, que inclui, mas não são limitados a nefropatia de IgA, psoríase, artrite reumatóide, esclerose múltipla, espondilite anquilosante, etc.

Interferon alfa (IFN-α) é um Tipo I interferon fortemente implicado na etiologia de um número de 1 ΕΡ2327792Β1 distúrbios imunes, tal como SLE. Acredita-se que abordagens de tratamento envolvendo a interrupção da sinalização de IFN-oí pode ser um tratamento eficaz para tais distúrbios. Niveis IFN-oí são conhecidos por serem elevados em SLE, e o tratamento de pacientes com IFN-oí tem sido observado que causa de forma reversível sintomas similares a SLE em recipientes. Outras numerosas linhas de evidência têm ligado IFN-oí e SLE.

Os mecanismos pelos quais IFN-oí exerce seus efeitos sobre a transcrição de genes em células alvo têm sido extensivamente investigado. A segunda cascate de mensageiro foi determinada determinado, locais de ligação cis-reguladoras para factores de transcrição activados têm sido definidos, e diversos estudos têm explorados qual expressão de genes é modulada. 0 mais compreensivo destes estudos foi realizado com micro-arranjos de oligonucleótido, mas definições de perfis de expressão génica de resposta a interferon ainda não são completa porque até recentemente micro-arranjos não continham um conjunto muito completo de repórteres para os genes do genoma humano.

Um dos desafios mais difíceis na gestão clínica de doenças auto-imunes é a identificação precisa e precoce das doenças num paciente. Para este fim, seria altamente vantajoso ter métodos de diagnóstico baseados em molécula que podem ser utilizados para identificar objectivamente a presença e/ou extensão da doença num paciente. A invenção descrita no presente documento fornece estes métodos e outros benefícios.

Os documentos US2004033498 e W003090694 ambos revelam 2 ΕΡ2327792Β1 genes que são diferencialmente expressos em pacientes de SLE em comparação com controlos saudáveis.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos e composições para a identificação de distúrbios auto-imunes com base pelo menos em parte na identificação dos genes cuja expressão é associado a presença e/ou extensão de lúpus eritematoso sistémico (SLE) , em que SLE é, por sua vez, uma doença auto-imune prototípica cujas assinaturas de genes associados a doença são também aplicáveis em outras doenças auto-imunes. Por exemplo, como descrito no presente documento, numa forma de realização, genes modulados em resposta a sinalização por IFN-α foram identificados. A informação gerada por esta abordagem foi então testada e modificada para desenvolver uma medição concisa e quantitativa do grau a que as amostras de célula ou tecido exibem respostas características de distúrbios auto-imunes. Como é mostrado no presente documento, a detecção de um ou mais de genes específicos revelados no presente documento pode ser um indicador útil e informativo de presença e/ou extensão de distúrbios auto-imunes num paciente. Além disso, métricas ou quocientes equivalentes que são indicativo de apresentação doença associada a interferon e/ou gravidade podem ser gerados pela transformação apropriada de informação de expressão de gene biomarcador. Transformações exemplares e métricas resultantes são reveladas no presente documento, geradas com base em dados de expressão de gene que são também revelados no presente documento. 3 ΕΡ2327792Β1 num aspecto, a invenção fornece um método como indicado na reivindicação 1. num aspecto, a invenção fornece um método como indicado na reivindicação 2.

Divulga-se no presente documento um método para a monitorização de doença residual mínima num sujeito tratado para uma doença auto-imune, o dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou qualquer número até a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadroa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (i), 7 (ii) ou 7 (iii) num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula é indicativa de presença de doença residual mínima auto-imune.

Divulga-se no presente documento um método para a detecção de um estado patológico auto-imune num sujeito, o dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou qualquer número até a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadro 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (i), 7 (ii) ou 7 (iii) num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula é indicativa de presença de um estado patológico auto-imune no indivíduo. 4 ΕΡ2327792Β1 num aspecto, a invenção fornece um método como indicado na reivindicação 3.

Divulga-se no presente documento um método para o diagnóstico de um distúrbio auto-imune num sujeito, o dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou qualquer número até a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (i) , 7 (ii) ou 7 (iii) num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula indica que o indivíduo tem o dito distúrbio auto-imune.

Os genes podem ser seleccionados a partir dos genes (ou genes associados aos conjuntos de sondas) listados no Quadro 2, em que os genes no Quadro 2 compreendem um subgrupo dos genes listados no Quadro 1. Os genes seleccionados podem compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados no Quadro 2. Os genes podem também ser seleccionados a partir dos genes (ou genes associados aos conjuntos de sondas) listados nos Quadros

Os métodos da invenção fornecem informação úteis para a determinação de etapas de intervenção clínica apropriada, se e como for apropriado. Portanto, como é revelado no presente documento, o método pode ainda compreender uma etapa de intervenção clínica com base nos resultados da avaliação da expressão de um ou mais dos genes (ou genes 5 ΕΡ2327792Β1 associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Por exemplo, a intervenção apropriada pode envolver etapas profilácticas e de tratamento, ou ajuste(s) de qualquer etapas profiláctica ou tratamento corrente com base em informação de expressão génica obtida por meio de um método da invenção.

Como seria evidente para um perito na especialidade, em qualquer método da invenção, enquanto detecção de expressão aumentada de um gene indicaria positivamente uma caracteristica de uma doença (por exemplo, presença, estágio ou extensão de uma doença), não detecção de expressão aumentada de um gene também seria informativa pelo fornecimento da caracterização reciproca da doença.

Divulga-se no presente documento um conjunto de arranjo/chip de gene/gene que compreende polinucleótidos capaz de hibridizar especificamente com pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, e/ou to pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 2, e/ou a pelo menos 2 ou qualquer número até a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 3, 4, 5, 6 ou 7. Como é indicado na reivindicação 5.

Divulga-se no presente documento um kit que compreende uma composição, e instruções para utilizar a composição para detectar um distúrbio auto-imune pela determinação de 6 ΕΡ2327792Β1 se expressão de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados no Quadro 1, e/ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados no Quadro 2, e/ou pelo menos 2 ou qualguer número até a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 3, 4, 5, 6 ou 7 são num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal. A composição pode ser um conjunto de arranjo/chip de gene/gene capaz de hibridizar especificamente com pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, e/ou to pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 2, e/ou to pelo menos 2 ou qualquer número até a totalidade dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 3, 4, 5, 6 ou 7. A composição pode compreender moléculas de ácido nucleico que codificam pelo menos uma porção de um polipéptido codificado por um gene (ou gene associado a um conjunto de sondas) listadas nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. A composição pode compreender um agente de ligação que especificamente se liga a pelo menos uma porção de um polipéptido codificado por um gene (ou gene associado a um conjunto de sondas) listado nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Métodos e composições revelados no presente documento podem compreender um ou mais dos genes listados nos Quadros 7 ΕΡ2327792Β1 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Se mais de um gene é utilizado ou incluído, o mais de um gene pode ser qualquer combinação de qualquer número dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) como listado (em nenhuma ordem particular) nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Por exemplo, uma combinação de genes compreende somente dois genes que correspondem aos conjuntos de sondas como listados nos Quadros 7 (i) . Divulga-se no presente documento uma combinação de genes compreende os genes associados aos conjuntos de sondas de Quadro 7(i) , e um ou mais do outro gene (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Por exemplo, uma tal combinação pode compreender genes associados aos conjuntos de sondas listados nos Quadros 7 (ii), e outro tal combinação pode compreender genes associados aos conjuntos de sondas listados nos Quadros 7 (iii) . Divulga-se no presente documento uma combinação de genes compreende um ou mais dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, combinada ainda com um ou mais outro genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) que não são listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 (por exemplo, um gene conhecido to ser associado a uma doença auto-imune, mas não associado a indução por interferões. especificamente).

Divulga-se no presente documento um método de identificar um valor métrico correlacionado com presença e/ou extensão de um distúrbio auto-imune num sujeito ou amostra, o dito método compreende: (a) estimar um grupo de conjuntos de sondas que esteja 8 ΕΡ2327792Β1 colectivamente associado a um padrão em que a expressão de genes representada pelos conjuntos de sondas é associada a uma doença característica; (b) gerar um factor de ponderação que pondera conjuntos de sondas de acordo com uma escala que reflecte a extensão de correspondência de cada conjunto de sondas individual à tendência do grupo de conjuntos de sondas, e calcular o coeficiente de correlação de cada perfil do conjunto de sondas ao perfil médio calculado; (c) determinar um factor de escalonamento, em que o factor de escalonamento é o valor requerido para escalonar conjuntos individuais de sondas até 1; (d) multiplicar o factor de escalonamento pelo factor de ponderação para gerar um factor composto; (e) multiplicar assinaturas de uma amostra de sangue normal com o factor composto, e calcular a média dos valores resultantes através de ambos os conjuntos de sondas e amostras para gerar um valor médio, e inverter o valor médio para produzir um factor de escalonamento global; (f) multiplicar cada factor de ponderação pelo factor de escalonamento global para obter um vector de valores de escalonamento, e multiplicar os valores de escalonamento por uma assinatura de expressão de uma amostra de interesse, e calcular a média dos valores resultantes 9 ΕΡ2327792Β1 para produzir uma métrica individual é que indicativo de grau de expressão génica associado a interferões de Tipo I na amostra.

No método do parágrafo anterior, na etapa (a), o grupo de conjuntos de sondas pode compreender conjuntos de sondas que incluem, ou agrupam ao redor, o par correlacionado mais proximamente de núcleo de conjuntos de sondas em subagrupamento associado a uma doença caracteristica.

No método dos parágrafos anteriores, na etapa (b) , o factor é gerado pela transformação de dados de expressão do grupo de conjuntos de sondas em pontuações z que compreendem escalonamento médio até 1, transformação de base-2 log, então escalonamento a um desvio padrão da média de 1.

No método dos parágrafos anteriores, na etapa (e) , o factor de escalonamento global é útil para transformar resultado da média de conjuntos de sondas de uma amostra de interesse numa métrica, em que a métrica é 1 se a amostra for de um sujeito normal, saudável. 0 grupo de conjuntos de sondas podem compreender pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou a totalidade daqueles listados nos Quadros 1, e/ou pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou a totalidade daqueles listados nos Quadros 2, e/ou pelo menos 2 ou qualquer número até a totalidade daqueles listados nos Quadros 3, 4, 5, 6 ou 7. O grupo de conjuntos de sondas pode compreender a totalidade daqueles listados 10 ΕΡ2327792Β1 nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. 0 grupo de conjuntos de sondas pode compreender pelo menos 2 (ou qualquer número inteiro até a totalidade) daqueles listados nos Quadros 3, Quadro 4, Quadro 5 ou Quadro 6. 0 grupo de conjuntos de sondas podem compreender a totalidade daqueles listados nos Quadros 7 (i), 7 (ii) ou 7 (iii) .

Divulga-se no presente documento um método que compreende comparar uma primeira métrica obtida por meio de um método descrito no presente documento para uma amostra obtido de um sujeito de interesse a uma métrica de referência obtida de uma amostra de referência (por exemplo, normal, saudável, não doente), em que uma primeira métrica que é maior que uma métrica de referência indica a presença de um distúrbio auto-imune no sujeito de interesse.

Divulga-se no presente documento um método de predição de receptividade de um sujeito a terapêutica de doença auto-imune, o dito método compreende comparar uma primeira métrica obtida por meio de um método descrito no presente documento para uma amostra obtida do sujeito a uma métrica de referência obtida de uma amostra de referência (por exemplo, normal, saudável, não doente) , em que uma primeira métrica que é maior que uma métrica de referência indica que o indivíduo responderia à terapêutica da doença auto-imune .

Divulga-se no presente documento um método para a monitorização de doença residual mínima num sujeito tratado para uma doença auto-imune, o dito método compreende 11 ΕΡ2327792Β1 comparar uma primeira métrica obtida por meio de um método descrito no presente documento para uma amostra obtida do sujeito a uma métrica de referência obtida de uma amostra de referência (por exemplo, normal, saudável, não doente e/ou não tratado), em que uma primeira métrica que é maior que uma métrica de referência é indicativo de presença de doença residual mínima auto-imune.

Divulga-se no presente documento um método para a detecção de um estado patológico auto-imune, o dito método compreende comparar uma primeira métrica obtida por meio de um método descrito no presente documento para uma amostra de um sujeito suspeito de ter os estados patológicos auto-imunes a uma métrica de referência obtida de uma amostra de referência (por exemplo, normal, saudável, não doente) , em que uma primeira métrica que é maior que uma métrica de referência é indicativo de presença dos estados patológicos auto-imunes no indivíduo.

Divulga-se no presente documento um método para a avaliação de predisposição de um sujeito para desenvolver um distúrbio auto-imune, o dito método compreende comparar uma primeira métrica obtida por meio de um método descrito no presente documento para uma amostra obtida do sujeito a uma métrica de referência obtida de uma amostra de referência (por exemplo, normal, saudável, não doente), em que uma primeira métrica que é maior que uma métrica de referência é indicativo de uma predisposição para o indivíduo desenvolver o distúrbio auto-imune.

Divulga-se no presente documento um método para o diagnóstico de um distúrbio auto-imune num sujeito, o dito 12 ΕΡ2327792Β1 método compreende comparar uma primeira métrica obtida por meio de um método descrito no presente documento para uma amostra obtida do sujeito a uma métrica de referência obtida de uma amostra de referência (por exemplo, normal, saudável, não doente), em que uma primeira métrica que é maior que uma métrica de referência indica que o indivíduo tem o dito distúrbio auto-imune.

Divulga-se no presente documento um método para a distinção de entre estados patológicos activos e inactivos (por exemplo, SLE activo e inactivo) num sujeito, o dito método compreende comparar uma primeira métrica obtida por meio de um método descrito no presente documento para uma amostra obtida do sujeito a uma métrica de referência obtida de uma amostra de referência (por exemplo, normal, saudável, não doente), em que uma primeira métrica que é maior que uma métrica de referência indica que o indivíduo tem o distúrbio auto-imune em seu estado activo.

Uma métrica de referência pode ser obtido utilizando um método descrito no presente documento para uma amostra de uma amostra de controlo (por exemplo, como obtido de um tecido, célula e/ou sujeito saudável e/ou não doente e/ou não tratado).

As etapas nos métodos para examinar a expressão de um ou mais biomarcadores podem ser conduzidas numa variedade de formatos de ensaio, que inclui ensaios que detectam a expressão de ARNm, ensaios enzimáticos que detectam a presença de actividade enzimática, e ensaios de imunohistoquímica. Opcionalmente, a amostra de tecido ou 13 ΕΡ2327792Β1 célula compreende tecido ou células doentes.

Revelado no presente documento são métodos de tratamento de um distúrbio num mamífero, tal como um distúrbio relacionado à imunidade, que compreende as etapas de obter tecido ou uma amostra de célula do mamífero, examinar o tecido ou células para expressão (por exemplo, quantidade de expressão) de um ou mais biomarcadores, e após determinar dita amostra de tecido ou célula expressa ditos um ou mais biomarcadores (por exemplo, em que os biomarcadores são expressos em quantidades superiores a uma amostra de referência (controlo)), administrar uma quantidade eficaz de um agente terapêutico a dito mamífero. As etapas nos métodos para examinar a expressão de um ou mais biomarcadores podem ser conduzidas numa variedade de formatos de ensaio, que inclui ensaios que detectam a expressão de ARNm, ensaios enzimáticos que detectam a presença de actividade enzimática, e ensaios de imunohistoquímica. Opcionalmente, os métodos compreendem tratar um distúrbio auto-imune num mamífero. Opcionalmente, os métodos compreendem administrar uma quantidade eficaz de um agente terapêutico dirigido (por exemplo, um anticorpo que se liga e/ou bloqueia a actividade de interferões Tipo 1 e/ou seus correspondentes receptores), e um segundo agente terapêutico (por exemplo, esteróides, etc.) a dito mamífero.

Biomarcadores podem ser seleccionados a partir daqueles listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. 14 ΕΡ2327792Β1

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é uma representação gráfica de análise de dados de IRGM para amostras de células de sangue completo (WBC) de paciente com SLE e indivíduos normais classificadas. A FIG. 2 é uma representação gráfica de análise de dados de IRGM para amostras de células de sangue completo (WBC) de paciente com nefropatia pro IgA e indivíduos normais classificadas. A FIG. 3 é uma representação gráfica de análise de dados de IRGM para amostras de biópsia de pele psoríatica sem lesões, individuais normais classificadas. A FIG. 4 é uma representação gráfica de correlação de pontuações de SLEDAI com IRGM. A FIG. 5 é um representação gráfica de densidade que mostra uma região de alta concentração de genes induzido por interferon num agrupamento bidimensional de dados de expressão génica de genoma completo de controlo e amostras de sangue completo de SLE. A FIG. 6 representa médias distintas de Métricas de gene de resposta a interferon de Tipo 1 (IRGM) para SLE e saudável controlo pacientes. A FIG. 7 representa distribuições distintas de Métricas de gene de resposta a interferon de Tipo 1 (IRGM) para 15 ΕΡ2327792Β1

SLE e pacientes de controlo saudáveis. MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO Técnicas Gerais A prática da presente invenção empregará, a não ser que seja indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (que inclui técnicas recombinantes) , microbiologia, biologia celular, bioquímica, e imunologia, que estão dentro da perícia da especialidade. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al.f eds., 1987, e atualizações periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994).

Os iniciadores, oligonucleótidos e polinucleótidos utilizados na presente invenção podem ser gerados utilizando técnicas padrão conhecidss na especialidade. A não ser que seja definido de outro modo, os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado como comummente entendido por um perito ordinário na especialidade a que esta invenção pertence. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nova Iorque, N.Y. 1994), e March, Na presente memória descritiva Reactions, Mechanisms 16 ΕΡ2327792Β1 and Structure 4a ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), dão ao perito na especialidade um guia geral para muitos do termos utilizados na presente memória descritiva.

Definições 0 termo "arranjo" ou "micro-arranjo", como é utilizado no presente documento refere-se a um arranjo ordenado de elementos de arranjo hibridizáveis, preferentemente polinucleótido probes (por exemplo, oligonucleótidos) , num substrato. 0 substrato pode ser um substrato sólido, tal como um porta-ob jecto de vidro, ou um substrato semi-sólido, tal como membrana de nitrocelulose. As sequências de nucleótido podem ser ADN, ARN, ou quaisquer permutações dos mesmos.

Uma "sequência alvo", "ácido nucleico alvo" ou "proteína alvo", como é utilizado no presente documento, é um sequência de polinucleótido de interesse, em que uma mutação é suspeito ou conhecido por residir, a detecção da qual é desejada. Geralmente, um "molde," como é utilizado no presente documento, é um polinucleótido que contém a sequência de nucleótido alvo. Em alguns casos, o termos "sequência alvo," " ADN de molde," " polinucleótido de molde," "ácido nucleico alvo," " polinucleótido alvo," e variações dos mesmos, são utilizados de forma intercambiável. "Amplificação", como é utilizado no presente documento, geralmente refere-se a o processo de produzir cópias múltiplas de uma sequência desejada. "Cópias 17 ΕΡ2327792Β1 múltiplas" significa pelo menos 2 cópias. Um "cópia" não necessariamente significa complementaridade perfeita de sequência ou identidade à sequência de molde. Por exemplo, cópias podem incluir análogos de nucleótido tais como deoxiinosina, alterações de sequência intencionais (tais como alterações de sequência introduzidas através de um iniciador que compreende uma sequência é que hibridizável, mas não complementar, ao molde), e/ou erros de sequência que ocorrem durante a amplificação. 0 nível de xpressão/quantidade de um gene ou biomarcador numa primeira amostra está num nível "superior a" o nível numa segunda amostra se o nível de expressão/quantidade do gene ou biomarcador na primeira amostra é pelo menos cerca de 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X ou 10X o nível de expressão/quant idade do gene ou biomarcador na segunda amostra. Os níveis de expressão /quantidade podem ser determinados com base em qualquer critério adequado conhecido na especialidade, que inclui, mas não é limitado a ARNm, ADNc, proteínas, fragmentos de proteína e/ou cópia de gene. Os níveis de expressão/quantidades podem ser determinados qualitativamente e/ou quantitativamente. "Polinucleótido", ou "ácido nucleico", como é utilizado de forma intercambiável no presente documento, referem-se a polímeros de nucleótidos de qualquer comprimento, e incluem ADN e ARN. Os nucleótidos podem ser desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados ou bases, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado num polímero por meio de 18 ΕΡ2327792Β1 ADN ou ARN polimerase. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tal como nucleótidos metilados e seus análogos. Se estiver presente, a modificação à estrutura do nucleótido pode ser conferida antes de ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleótidos. Um polinucleótido pode ser ainda modificado após polimerização, tal como por meio de conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleótido tais como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, metilo fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, cabamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles que contêm fracções pendentes, tal como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinal, poli- L- lisina, etc.), aqueles com intercalantes (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aqueles que contêm quelantes (por exemplo, metais, metais radioactivos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueles que contêm alquilantes, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas dos polinucleótido. Além disso, qualquer dos grupos hidroxilo ordinariamente presentes nos açúcares em podem ser substituídos, por exemplo, pelos grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos de protecção padrão, ou activados para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos. 0 OH terminal 5' e 3' pode 19 ΕΡ2327792Β1 ser fosforilado ou substituído com aminas ou fracções de grupos de cobertura orgânicos de desde 1 até 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podem também ser derivatizadas a grupos de protecção padrão. Polinucleótidos podem também conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxiribose que são geralmente conhecidos na especialidade, que inclui, por exemplo, 2, O- metil- 2'- O- alilo, 2'- fluoro- ou 2'- azido- ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares a- anomérico, açúcares epimérico tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleósido abásico tais como metilo ribósido. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não são limitados a, formas de realização em que fosfato é substituídos por P (0) S ("tioato"), P (S) S ("ditioato") , "(0) NR 2 ("amidato"), P (0) R, P (0) OR', CO ou CH 2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído (1- 20 C) opcionalmente que contém uma ligação éter (— O— ), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo ou araldilo. Não todas as ligações num polinucleótido necessitam ser idênticas. A descrição anterior se aplica a todos os polinucleótidos referidos no presente documento, que inclui ARN e ADN. "Oligonucleótido", como é utilizado no presente documento, geralmente refere-se a polinucleótidos geralmente sintéticos curtos, geralmente de cadeia simples, que são geralmente, mas não necessariamente, inferiores a cerca de 200 nucleótidos em comprimento. O termos 20 ΕΡ2327792Β1 "oligonucleótido" e "polinucleótido" não são mutuamente exclusivo. A descrição acima para polinucleótidos é igualmente e completamente aplicável a oligonucleótidos.

Um "iniciador" é geralmente um polinucleótido curto de cadeia simples, geralmente com um grupo 3'-OH livre, que se liga a um alvo potencialmente presente numa amostra de interesse por meio de hibridização com uma sequência alvo, e depois disso promove a polimerização de um polinucleótido complementar ao alvo. A frase "amplificação de gene" refere-se a um processo pelo qual cópias múltiplas de um gene ou fragmento de gene são formados numa particular célula ou linha celular. A região duplicada (um trecho de ADN amplificado) é com frequência referida como "amplicon." Usualmente, a quantidade do ARN mensageiro (ARNm) produzido, isto é, o nivel de expressão génica, também aumenta na proporção do número de cópias feito do gene expresso particular. 0 termo "mutação", como é utilizado no presente documento, significa uma diferença na sequência de aminoácido ou ácido nucleico de uma proteína ou ácido nucleico particular (gene, ARN) com relação à proteína ou ácido nucleico de tipo selvagem, respectivamente. Uma proteína ou ácido nucleico mutado pode ser expresso a partir de ou encontrado num alelo (heterozigoto) ou ambos os alelos (homozigoto) de um gene, e pode ser somático ou linha germinal. "Inibir" é diminuir ou reduzir uma actividade, função, 21 ΕΡ2327792Β1 e/ou quantidade em comparação com uma referência. 0 termo "3'" geralmente refere-se a um região ou posição num polinucleótido ou oligonucleótido 3' (a jusante) de outra região ou posição no mesmo polinucleótido ou oligonucleótido. 0 termo "5'" geralmente refere-se a um região ou posição num polinucleótido ou oligonucleótido 5' (a montante) de outra região ou posição no mesmo polinucleótido ou oligonucleótido. "Detecção" inclui quaisquer meios do quais detectam, que inclui detecção directa e indirecta. 0 termo "diagnóstico" é utilizado no presente documento para se referir à identificação de um estado molecular ou patológico, doença ou condição, tal como a identificação de um distúrbio auto-imune. 0 termo "prognóstico" é utilizado no presente documento para se referir à predição da probabilidade de sintomas de distúrbio doença atribuíveis auto-imune, que inclui, por exemplo, recorrência, erupções, e resistência a fármaco, de uma doença auto-imune. 0 termo "predição" é utilizado no presente documento ara se referir à probabilidade de que um paciente responda de forma favorável ou desfavorável a um fármaco ou conjunto de fármacos. Numa forma de realização, a predição refere-se à extensão daquelas respostas. Numa forma de realização, a predição refere-se a se e/ou a probabilidade de que um paciente sobrevida ou melhore após o tratamento, por exemplo, tratamento com um particular agente terapêutico, e durante um certo período de tempo sem recorrência da doença. Os métodos preditivos da invenção 22 ΕΡ2327792Β1 podem ser utilizados clinicamente para tomar decisões de tratamento escolhendo as modalidades de tratamento mais apropriadas par qualquer paciente particular. Os métodos preditivos da presente invenção são ferramentas valiosas em predizer se um paciente é provável de responder favoravelmente a um regime de tratamento, tal como um dado regime terapêutico, que inclui, por exemplo, administração de um dado agente terapêutico ou combinação, intervenção cirúrgica, tratamento com esteróide, etc., ou se sobrevivência de longo prazo do paciente, após um regime terapêutico é provável. 0 termo sobrevivência de "longo prazo" é utilizado no presente documento para se referir a sobrevivência durante pelo menos 1 ano, 5 anos, 8 anos, ou 10 anos após tratamento terapêutico. 0 termo "resistência aumentada" a um particular agente terapêutico ou opção de tratamento, quando é utilizado de acordo com a invenção, significa resposta diminuída a uma dose padrão do fármaco ou a um protocolo de tratamento padrão. O termo "sensibilidade diminuída" a um particular agente terapêutico ou opção de tratamento, quando é utilizado de acordo com a invenção, significa resposta diminuída a uma dose padrão do agente ou a um protocolo de tratamento padrão, onde a resposta diminuída pode ser compensada por (pelo menos, parcialmente) aumentar a dose de agente, ou a intensidade de tratamento. 23 ΕΡ2327792Β1 A "Resposta do paciente" pode ser avaliada utilizando qualquer critério de avaliação que indica um beneficio ao paciente, que inclui, sem limitação, (1) inibição, to algumas extensão, de progressão da doença, que inclui diminuir a velocidade e deter completamente; (2) redução no número de episódios e/ou sintomas da doença; (3) redução em tamanho de lesão; (4) inibição (isto é, redução, diminuir a velocidade ou parada completa) de doença célula infiltração em órgãos periféricos adjacentes e/ou tecidos; (5) inibição (isto é, redução, diminuir a velocidade ou parada completa) de espalhamento da doença; (6) diminuição da resposta auto-imune, que pode, mas does não tem de, resultar na regressão ou ablação da lesão da doença; (7) alivio, a alguma extensão, de um ou mais sintomas associadod ao distúrbio; (8) aumento na duração de apresentação livre de doença após o tratamento; e/ou (9) mortalidade diminuída num dado ponto de tempo após o tratamento. 0 termo "inibidor de interferon" como é utilizado no presente documento refere-se a uma molécula que tem a capacidade de inibir uma função biológica de tipo selvagem ou interferon Tipo 1 mutado. Consequentemente, o termo "inibidor" é definido no contexto do papel biológico de interferon Tipo 1. Numa forma de realização, um inibidor de interferon referido no presente documento especificamente inibe sinalização celular via a via interferon de Tipo 1 /receptor de interferon. Por exemplo, um inibidor de interferon pode interagir com (por exemplo, ligar a) receptor de interferon alfa, ou com um interferon Tipo 1 que normalmente se liga a receptor de interferon. Numa forma de realização, um inibidor de interferon se liga ao 24 ΕΡ2327792Β1 domínio extracelular de receptor de interferon alfa. Numa forma de realização, um inibidor de interferon se liga ao domínio intracelular de receptor de interferon alfa. Numa forma de realização, um inibidor de interferon se liga a interferon Tipo 1. Numa forma de realização, o interferon Tipo 1 é um subtipo de interferon alfa. Numa forma de realização, o interferon Tipo 1 não é interferon beta. Numa forma de realização, o interferon Tipo 1 não é interferon ómega. Numa forma de realização, actividade biológica de interferon inibida por um inibidor de interferon é associado a um distúrbio imune, tal como um distúrbio auto-imune. Um inibidor de interferon pode ser em qualquer forma, desde que seja capaz de inibir interferon/ actividade de receptor; inibidores incluem anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais como definido a seguir no presente documento) , moléculas orgânicas/inorgânicas pequenas, oligonucleótidos antissense, aptámeros, péptidos/polipéptidos inibidores, ARN inibidores (por exemplo, ARN interferentes pequenos), combinações dos mesmos, etc. "Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteínas que têm as mesmas características estruturais. Enquanto anticorpos exibem especificidade de ligação a um antigénio especifico, imunoglobulinas incluem ambos anticorpos e outras moléculas do tipo anticorpo que geralmente não possuem especificidade a antigénio. Polipéptidos do último tipo são, por exemplo, produzido em níveis baixos pelo sistema linfático e em níveis aumentados por mielomas. 25 ΕΡ2327792Β1

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados de forma intercambiável no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, comprimento completo ou anticorpos monoclonais intactos), anticorpos policlonais, anticorpos monovalentes, multivalentes, anticorpos multiespecificos (por exemplo, anticorpos biespecificos contanto que exibam a actividade biológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpo (como descrito em mais pormenores no presente documento). Um anticorpo pode ser quimérico, humano, humanizado e/ou de afinidade madura. "Fragmentos de anticorpo" compreendem somente uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção preferentemente retém pelo menos um, preferentemente a maior parte ou toda as funções normalmente associadas a essa porção quando presente num anticorpo intacto. Numa forma de realização, um fragmento de anticorpo compreende um local de ligação a antigénio do anticorpo intacto e assim retém a capacidade de ligar-se a antigénio. Em outra forma de realização, um fragmento de anticorpo, por exemplo, um que compreende a região Fc, retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associado à região Fc quando presente num anticorpo intacto, tal como ligação a FcRn, modulação de semivida de anticorpo, função de ADCC e ligação a complemento. Numa forma de realização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma semivida in vivo substancialmente similar a um anticorpo intacto. Por exemplo, tal fragmento de anticorpo pode compreender no braço de ligação a antigénio ligado a uma sequência de Fc capaz de conferir estabilidade in vivo 26 ΕΡ2327792Β1 ao fragmento. 0 termo "anticorpo monoclonal" como é utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticas excepto para mutações de ocorrência natural possível que podem estar presented em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direccionados contra um único antigénio. Além disso, em contraste a preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes direccionados contra diferente determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direccionado contra um único determinante no antigénio.

Os anticorpos monoclonais no presente documento especificamente incluem anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a um classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante de a(s) cadeia (s) é idêntico com ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibam a actividade biológica desejada (Patente US N° 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)) .

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por 27 ΕΡ2327792Β1 exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) em que resíduos de uma região hipervariável do recebedor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano que tem a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recebedor ou no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar mais a performance do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das alças hipervariáveis correspondem a aquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma imunoglobulina região constante (Fc), tipicamente essa de uma imunoglobulina humana. Para mais pormenores, veja-se Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Veja-se também os seguintes artigos de revisão e referências citadas nos mesmos: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Imunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); 28 ΕΡ2327792Β1

Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde a essa de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou foi feita utilizando qualquer das técnicas para realizar anticorpos humanos como revelado no presente documento. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um ser anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação a antigénio não humano.

Um anticorpo "de afinidade madura" é um com uma ou mais alterações numa ou mais CDRs/ HVRs do mesmo que resultam numa melhora na afinidade do anticorpo para antigénio, em comparação com um anticorpo parental que não possui aquelas alteração(ões). Anticorpos de afinidade madura preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antigénio alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por procedimentos conhecidos na especialidade. Marks et al. Biol/ Technology 10: 779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por embaralhamento de domínio de VH e VL. Mutagénese aleatória de CDR/HVR e/ou resíduos estruturais é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91: 3809- 3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147- 155 (1995); Yelton et al. J. Imunol. 155: 1994- 2004 (1995); Jackson et al., J. Imunol. 154 (7) : 3310- 9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889- 896 (1992). O termo "região Fc" é utilizado para definir a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que pode 29 ΕΡ2327792Β1 ser gerada por digestão de papaína de um anticorpo intacto. A região Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina poderia variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida para o estiramento de um resíduo de aminoácido em cerca de posição Cys226, ou de cerca de posição Pro230, ao terminal carboxil da região Fc. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3, e opcionalmente compreende um domínio CH4. Por "cadeia de região Fc" no presente documento pretende-se uma das duas cadeias de polipéptido de uma região Fc. 0 termo "agente citotóxico" como é utilizado no presente documento refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. 0 termo é destinado a incluir isótopos radioactivos (por exemplo, At21, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterápicos, e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, que incluem fragmentos e/ou variantes das mesmas.

Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um que inibe ou reduz a actividade biológica do antigénio ao qual se liga. Tal bloqueio pode ocorrer por qualquer meio, por exemplo, por meio da interferência com interacção proteína-proteína tal como ligação de ligando a um receptor. Numa forma de realização, 30 ΕΡ2327792Β1 anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas substancialmente ou completamente inibem a actividade biológica do antigénio.

Uma "doença auto-imune" no presente documento é um doença ou distúrbio não maligno que surge de e direccionado contra um tecido do próprio indivíduo. As doenças auto-imunes no presente documento especificamente excluem doenças ou condições malignas ou cancerosas, especialmente excluindo linfoma de célula B, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de célula em cabeleira e leucemia mieloblástica crónica. Exemplos de doenças auto-imunes ou distúrbios incluem, mas não são limitados a, respostas inflamatórias tais como doenças inflamatórias da pele que incluem psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); escleroderma sistémica e esclerose; respostas associadas a doença inflamatória intestinal (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome da angústia respiratória (que inclui síndrome da angústia respiratória do adulto; ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveíte; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições que envolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas; aterosclerose; deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatóide; lúpus eritematoso sistémico (SLE) (que inclui, mas não é limitado a nefrite lúpica, lúpus cutâneo); diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus do Tipo I ou diabetes mellitis dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tiroidite auto-imune; tiroidite de Hashimoto; encefalomielite alérgica; sindrome 31 ΕΡ2327792Β1 de Sjogren; diabetes de aparecimento juvenil; e respostas imunes associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T tipicamente encontrados em tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem diapedese de leucócitos; distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (CNS); sindrome de lesão de órgão múltiplo; anemia hemolítica (que inclui, mas não é limitado a crioglobinemia ou anemia Coombs positiva) ; miastenia grave; doenças mediadas por complexo de antigénio-anticorpo; doença de membrana basal anti-glomerular; sindrome antifosfolípido; neurite alérgica; doença de Graves; sindrome miasténica de Lambert-Eaton; penfigoide bulhosa; pênfigo; poliendocrinopatias auto-imunes; doença de Reiter; sindrome de stiff-man; doença de Behcet; arterite de célula gigante; nefrite de complexo imune; nefropatia de IgA; polineuropatias de IgM; púrpura trombocitopénica imune (ITP) ou trombocitopenia auto-imune etc. 0 termo "amostra", como é utilizado no presente documento, refere-se a uma composição que é obtida ou derivada de um indivíduo de interesse que contém uma entidade celular e/ou outra entidade molecular que é para ser caracterizada e/ou identificada, por exemplo, com base em caracteristicas fisicas, bioquímicas, químicas e/ou fisiológicas. Por exemplo, a frase "amostra de doença" e variações da mesma referem-se a qualquer amostra obtida de um indivíduo de interesse que seria esperada ou seja conhecida por conter a entidade celular e/ou molecular que é para ser caracterizada. 32 ΕΡ2327792Β1

Como é utilizado no presente documento, "tratamento" refere-se a intervenção clinica numa tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula a ser tratada, e pode ser realizado por profilaxia ou durante o curso de patologia clinica. Efeitos desejáveis de tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alivio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas directas ou indirectas da doença, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas formas de realização, métodos e composições da invenção são úteis em tentativas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio.

Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profiláctico desejado. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente terapêutico pode variar de acordo com factores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do agente terapêutico têm mais importância que os efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profiláctica é utilizada em indivíduos antes de ou num estágio precoce da doença, a quantidade 33 ΕΡ2327792Β1 profilacticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Como é utilizado no presente documento, os termos "interferão do tipo I" e "interferão do tipo I humano" são definidos como todas as espécies de interferão sintético e nativo humano que estão dentro das classes sintéticas e humanas de interferão- a, interferão- ω e interferão- β e que se ligam a um receptor celular comum. Interferão- α natural humano compreende 23 ou proteínas mais proximamente relacionadas codificadas por genes distintos com um alto grau de homologia estrutural (Weissmann e Weber, Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol., 33: 251 (1986); J. Interferon

Res., 13: 443- 444 (1993) ). 0 locus de IFN- oí humano compreende duas subfamílias. A primeira subfamília consiste em pelo menos 14 genes funcionais, não alélicos, que

incluem genes que codificam IFN- aA (IFN- oí2) , IFN- aB (IFN- a8), IFN- aC (IFN- alO), IFN- aD (IFN- acl), IFN- aE (IFN- a22), IFN- aF (IFN- 0(21), IFN- aG (IFN- 0(5) , IFN-0(16, IFN- 0(17, IFN- oc4, IFN- 0(6, IFN- a7, e IFN- OíH (IFN-al4), e pseudogenes que têm pelo menos 80 % de homologia. A segunda subfamília, oíh ou ω, contém pelo menos 5 pseudogenes e 1 gene funcional (denotado no presente documento como "IFN- oíhI" ou "IFN- ω") que exibe 7 0 % de homologia com o gene de IFN- α (Weissmann e Weber (1986)) . 0 IFN- β humano é geralmente pensado que seja codificado por uma única cópia de gene.

Como é utilizado no presente documento, o termos "primeiro receptor de interferão-oí humano (hIFN-α) ", "IFN-aR", "hlFNARl", "IFNAR1", e "cadeia de Uze" são definidos 34 ΕΡ2327792Β1 como a proteína de receptor de 557 aminoácidos clonada por Uze et al., Cell, 60: 225-234 (1990), que inclui um domínio extracelular de 409 resíduos, um domínio transmembrana de 21 resíduos, e um domínio intracelular de 100 resíduos, como é mostrado na Fig. 5 na página 229 de Uze et al. Numa forma de realização, os termos anteriores incluem fragmentos de IFNAR1 que contêm o domínio extracelular (ECD) (ou fragmentos do ECD) de IFNAR1.

Como é utilizado no presente documento, o termos "segundo receptor de interferão-α humano (hIFN-α) ", "IFN-apR", "hIFNAR2", "IFNAR2", e "cadeia de Novick" são definidos como a proteína de receptor de 515 aminoácidos clonada por Domanski et al., J. Biol. Chem., 37: 21606-21611 (1995), que inclui um domínio extracelular de 217 resíduos, um domínio transmembrana de 21 resíduos, e um domínio intracelular de 250 resíduos, como é mostrado na Fig. 1 na página 21608 de Domanski et al. Numa forma de realização, os termos anteriores incluem fragmentos de IFNAR2 que contêm o domínio extracelular (ECD) (ou fragmentos do ECD) de IFNAR2, e soluble forms de IFNAR2, tal como IFNAR2 ECD fundido a pelo menos uma porção de uma sequência de imunoglobulina. O termo "gene de manutenção" refere-se a um grupo de genes que codifica proteínas cujas actividades são essenciais para a manutenção de função da célula. Estes genes são tipicamente expressos de forma similar em todos os tipos decélula. Os genes de manutenção incluem, sem limitação, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH), Cypl, albumina, actinas, por exemplo, β-actina, tubulinas, 35 ΕΡ2327792Β1 ciclofilina, hipoxantina fosforribosiltransferase (HRPT), L32. 28S, e 18S. 0 termo "biomarcador" como é utilizado no presente documento refere-se geralmente a um molécula, que inclui um gene, proteina, estrutura de hidrato de carbono, ou glicolipido, a expressão do qual em ou num tecido ou célula de mamífero pode ser detectada por meio de métodos padrão (ou métodos revelados no presente documento) e é preditivo, diagnóstico e/ou prognóstico para uma sensibilidade de célula ou tecido de mamífero a regimes de tratamento com base em inibição de interferões, por exemplo, interferões Tipo 1. Opcionalmente, a expressão de tal biomarcador é determinada como que é maior que aquela observada para uma amostra de tecido ou célula de controlo/referência. Opcionalmente, por exemplo, a expressão de tal biomarcador será determinada num ensaio de PCR ou FACS como que é pelo menos 50 vezes, ou preferentemente pelo menos 100 vezes maior da amostra de tecido ou célula de teste que aquela observada para um amostra de tecido ou célula de controlo. Opcionalmente, a expressão de tal biomarcador será determinada num ensaio de IHC para pontuar pelo menos 2 ou mais para intensidade de coloração. Opcionalmente, a expressão de tal biomarcador será determinada utilizando um ensaio chip com base em gene.

Um "IRG" ou "gene de resposta a interferão", como é utilizado no presente documento, refere-se a um ou mais dos genes, e correspondentes produtos génicos, listado nos Quadros 1 e 2. Como é mostrado no presente documento, níveis aberrantes de expressão/quantidades de um ou mais 36 ΕΡ2327792Β1 destes genes são correlacionados com uma variedade de distúrbios auto-imunes. Como seria evidente para um perito na especialidade, dependendo de contexto, o termo IRG pode se referir a ácido nucleico (por exemplo, genes) ou polipéptidos (por exemplo, proteínas) que tem a designação ou identificador único listado nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6, e/ou 7.

Por "amostra de tecido ou célula" se quer dizer uma colecção de células similares obtidas de um tecido de um indivíduo ou paciente. A fonte da amostra de tecido ou célula pode ser tecido sólido como de um órgão fresco, congelado e/ou conservado ou amostra de tecido ou biópsia ou aspirado; sangue ou quaisquer constituintes do sangue; fluidos corporais tais como fluido cérebro-espinhal, fluido amniótico, fluido peritoneal, ou fluido intersticial; células de qualquer tempo em gestação ou desenvolvimento do indivíduo. A amostra de tecido pode também ser primária ou células cultivadas ou linhas celulares. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula é obtida de uma tecido/ órgão doente. A amostra de tecido pode conter compostos que não são naturalmente misturados com o tecido na natureza tal como conservantes, anticoagulantes, tampões, fixantes, nutrientes, antibióticos, ou similares.

Para os propósitos no presente documento uma "secção" de uma amostra de tecido quer dizer uma parte ou peça individual de uma amostra de tecido, por exemplo, uma fatia fina de corte de tecido ou células de uma amostra de tecido. É entendido que secções múltiplas de amostra de tecidos podem ser tomadas e submetidas a análise de acordo 37 ΕΡ2327792Β1 com a presente invenção, proporcionado que é entendido que a presente invenção compreende um método pelo qual a mesma secção de amostra de tecido é analisada tanto no nivel morfológico com molecular, ou é analisada com respeito a tanto a proteína como o ácido nucleico.

Por "correlacionar" ou "correlacionando" se quer dizer comparar, em qualquer forma, o desempenho e/ou resulta de uma primeira análise ou protocolo com o desempenho e/ou resulta de uma segunda análise ou protocolo. Por exemplo, um pode utilizar os resultados de uma primeira análise ou protocolo para levar a cabo um segundo protocolos e/ou um pode utilizar os resultados de uma primeira análise ou protocolo para determinar se uma segunda análise ou protocolo deveria ser realizado. Com respeito à forma de realização da análise ou protocolo de expressão génica, um pode utilizar os resultados da análise ou protocolo de expressão génica para determinar se um regime terapêutico específico deveria ser realizado. A palavra "etigueta" guando é utilizada no presente documento refere-se a um composto ou composição que é conjugado ou fundido directamente ou indirectamente a um reagente tal como uma sonda de ácido nucleico ou um anticorpo e facilita a detecçao do reagente ao qual é conjugado ou fundido. A própria etiqueta pode ser detectável (por exemplo, etiguetas de radioisótopo ou etiguetas fluorescente) ou, no caso de uma etiqueta enzimática, pode catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. 38 ΕΡ2327792Β1 Técnicas ilustrativas gerais

Uma amostra que compreende uma molécula alvo pode ser obtida por métodos bem conhecidos na especialidade, e que são apropriados para o tipo particular e localização da doença de interesse. Biópsia de tecido é com frequência utilizada para obter uma peça representativa de tecido de doença. Alternativamente, as células podem ser obtidas indirectamente na forma de tecidos/fluidos que são conhecidos ou pensados que contenham a células de doença de interesse. Por exemplo, amostras de lesões de doença podem ser obtidas por meio de ressecção, bronquoscópia, aspiração com agulha fina, escovados brônquicos, ou de esputo, fluido pleural ou sangue. Genes ou produtos génicos podem ser detectados a partir do tecido de doença ou de outras amostras corporais tais como urina, esputo ou soro. As mesmas técnicas discutidas acima para a detecção de genes alvo ou produtos génicos em amostra de doenças podem ser aplicadas a outras amostras corporais. Células de doença são separados a partir das lesões de doença e parecem em tais amostras corporais. Por rastreio de tais amostras corporais, um simples diagnóstico precoce pode ser alcançado para estas doenças. Além disso, o progresso da terapêutica pode ser monitorizado mais facilmente por meio de testes tais amostras corporais para genes alvo ou produtos génicos. Métodos revelados no presente documento são úteis para a detecção de qualquer distúrbio auto-imune com o qual se associa a activação anormal (por exemplo, sobre-expressão) de interferões, em particular interferões do Tipo 1 e/ou a 39 ΕΡ2327792Β1 sua via de sinalização associada. Os métodos de diagnóstico da presente invenção são úteis para os clinicos de modo que podem decidir sobre um curso de tratamento apropriado. Por exemplo, uma amostra de um indivíduo que apresenta um alto nivel de expressão dos genes ou produtos génicos revelados no presente documento poderia sugerir um regime terapêutico mais agressivo que uma amostra que exibe um nivel de expressão comparativamente mais baixo. Métodos da invenção podem ser utilizados numa variedade de ajustes, que inclui, por exemplo, em ajudar na selecção de paciente durante o curso de desenvolvimento de fármaco, predição de probabilidade de sucesso ao tratar um paciente individual com um regime de tratamento particular, em avaliar a progressão da doença, em monitorizar a eficácia do tratamento, em determinar o prognóstico para pacientes individuais, em avaliar a predisposição de um indivíduo para desenvolver um distúrbio auto-imune particular (por exemplo, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren), em diferenciar o estágio da doença, etc.

Meios para enriquecer uma preparação de tecido para células de doença são conhecidos na especialidade. Por exemplo, o tecido pode ser isolado a partir de secções de parafina ou criostato. As células de doença podem também ser separadas das células normais por citometria de fluxo ou microdissecção de captura a laser. Estas, bem como outras técnicas para separar a doença das células normais, são bem conhecidas na especialidade. Se o tecido de doença estiver altamente contaminado com células normais, a detecção da assinatura de perfil de expressão génica pode ser mais difícil, embora as técnicas para minimizar a 40 ΕΡ2327792Β1 contaminação e/ou resultados positivos/negativos falsos sejam conhecidas, algumas das quais são descritas a seguir no presente documento. Por exemplo, uma amostra pode também ser avaliada para a presença de um biomarcador (que inclui uma mutação) conhecido como sendo associado a uma célula de doença de interesse, mas não uma célula normal correspondente, ou vice versa.

Divulga-se no presente documento uma variedade de composições adequadas para utilização na realização de métodos da invenção. Por exemplo, a invenção fornece arranjos que podem ser utilizados em tais métodos. Divulga-se no presente documento um arranjo que compreende moléculas individuais ou colecções de moléculas de ácido nucleico úteis para a detecção de mutações da invenção. Por exemplo, um arranjo pode compreender uma série de oligonucleótidos de ácido nucleico individuais discretamente colocados ou conjuntos de combinações de oligonucleótido de ácido nucleico que são hibridizáveis com uma amostra que compreende ácidos nucleicos alvo, pelo qual tal hibridação é indicativa de presença ou ausência de uma mutação.

Diversas técnicas são bem conhecidas na especialidade para unir ácidos nucleicos a um substrato sólido tal como um porta-objecto de vidro. Um método é incorporar bases modificadas ou análogos que contêm uma fracção que é capaz de unir a um substrato sólido, tal como um grupo amina, um derivado de um grupo amina ou outro grupo com uma carga positiva, em moléculas de ácido nucleico que são sintetizados. 0 produto sintetizado é então colocado em 41 ΕΡ2327792Β1 contacto com um substrato sólido, tal como um porta-objecto de vidro, que é revestido com um aldeído ou outro grupo reactivo que formará uma ligação covalente com o grupo reactivo que está no produto amplificado e torna-se covalentemente unido ao porta-objecto de vidro. Outros métodos, tais como aqueles utilizando química de superfície de amino propil silício são também conhecidos na especialidade, como revelado em http://www.cmt.Corning.com e http://cmqm.stanford.edu/pbrownl. A união de grupos a oligonucleótidos que poderiam ser depois convertidos a grupos reactivos é também possível utilizando métodos conhecidos na especialidade. Qualquer união a nucleótidos de oligonucleótidos se tornará parte de oligonucleótido, que poderia então ser unida à superfície sólida do microarranjo. Ácidos nucleicos amplificados podem ser ainda modificados, tal como através de clivagem em fragmentos ou por união de etiquetas detectáveis, antes de ou em seguida à união ao substrato sólido, como requerido e/ou permitido pelas técnicas utilizadas.

MÉTODOS E MATERIAIS TÍPICOS DA INVENÇÃO

Os métodos e ensaios revelados no presente documento são direccionados à examinação de expressão de um ou mais biomarcadores numa amostra de tecido ou célula de mamífero, em que a determinação dessa expressão de um ou mais tais biomarcadores é preditiva ou indicativa de se a amostra de tecido ou célula será sensível ao tratamento com base na 42 ΕΡ2327792Β1 utilização de inibidor de interferões. Os métodos e ensaios incluem aqueles que examinam a expressão de biomarcadores tais como um ou mais daqueles listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6, e/ou 7.

Como discutido acima, existem algumas populações de tipos de célula humana doente que são associados a expressão anormal de interferões tais como os interferões do Tipo 1 que é associado a várias distúrbios auto-imunes. Acredita-se, portanto que os métodos e ensaios revelados podem tratar de meios convenientes, eficientes, e potencialmente económicos para obter dados e informação útel na avaliação de terapêuticas apropriadas ou eficazes para tratar pacientes. Por exemplo, um paciente que foi diagnosticado com uma condição imune relacionada poderia ter uma biópsia realizada para obter uma amostra de tecido ou célula, e a amostra poderia ser examinada por meio de vários ensaios in vitro para determinar se as células do paciente seriam sensíveis a um agente terapêutico tal como um inibidor de interferão (por exemplo, um anticorpo anti-interferão alfa ou um anticorpo a receptor de interferão alfa).

Revelam-se no presente documento métodos para predizer a sensibilidade de uma amostra de células ou tecido de mamífero (tal como uma célula associada a um distúrbio auto-imune) a um inibidor de interferão. Nos métodos, uma amostra de célula ou tecido de mamífero é obtida e examinada para expressão de um ou mais biomarcadores. Os métodos podem ser conduzidos numa variedade de formatos de ensaio, que inclui ensaios que detectam a expressão de 43 ΕΡ2327792Β1 ARNm, ensaios enzimáticos que detectam a presença de actividade enzimática, e ensaios de imunohistoquimica. A determinação de expressão de tais biomarcadores nos ditos tecidos ou células será preditiva de que tais tecidos ou células serão sensíveis à terapêutica de inibidor de interferão. Requerentes de maneira surpreendente encontraram que a expressão de tais biomarcadores particulares se correla proximamente com a presença e/ou extensão de vários distúrbios auto-imunes.

Como discutido a seguir, a expressão de vários biomarcadores numa amostra pode ser analisada por um número de metodologias, muitas das quais são conhecidas na especialidade e entendidas por um perito hábil, que incluem, mas não são limitadas a, imuno-histoquímica e/ou análise de Western, ensaios quantitativos com base no sangue (como, por exemplo, ELISA Soro) (para examinar, por exemplo, níveis de expressão de proteína), ensaios de actividade enzimática bioquímica, hibridação in situ, análise de Northern e/ou análise de PCR de ARNm, bem como qualquer uma da ampla variedade de ensaios que podem ser realizados por análise de arranjo de gene e/ou tecido. Protocolos típicos para avaliar o status de genes e produtos génicos são encontrados, por exemplo, em Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting), 15 (Imunoblotting) e 18 (PCR Analysis).

Os protocolos a seguir que se referem à detecção de biomarcadores particulares, tais como aqueles listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6, e/ou 7, numa amostra são 44 ΕΡ2327792Β1 proporcionados para propósitos ilustrativos. Métodos revelados no presente documento incluem protocolos que examinam ou testam para presença de IRG numa amostra de célula ou tecido de mamífero. Uma variedade de métodos para a detecção de IRG pode ser utilizada e inclui, por exemplo, análise de imunohistoquímica, imunoprecipitação, análise de Western blot, ensaios de ligação molecular, ELISA, ELIFA, classificação de células activadas por fluorescência (FACS) e similares. Por exemplo, um método opcional de detecção da expressão de IRG num tecido ou amostra compreende colocar em contacto a amostra com um anticorpo de IRG, um fragmento reactivo a IRG do mesmo, ou uma proteína recombinante que contém uma região de ligação a antigénio de um anticorpo de IRG; e então que detectam a ligação de proteína de IRG na amostra. A expressão de proteínas de IRG numa amostra pode ser examinada utilizando protocolos de imunohistoquímica e coloração. Coloração por imunohistoquímica de secções de tecido mostrou-se ser um método confiável de avaliar ou detectar a presença de proteínas numa amostra. Técnicas de imunohistoquímica ("IHC") utilizam um anticorpo para sondar e visualizar antigénios celulares in situ, geralmente por métodos cromogénicos ou fluorescentes.

Para a preparação de amostra, uma amostra de tecido ou célula de um mamífero (tipicamente um paciente humano) pode ser utilizado. Exemplos de amostras incluem, mas não são limitados a, biópsia de tecido, sangue, aspirado de pulmão, esputo, fluido linfático, etc. A amostra pode ser obtida 45 ΕΡ2327792Β1 por meio de uma variedade de procedimentos conhecidos na especialidade que incluem, mas não são limitados a cirurgia-excisão, aspiração ou biópsia. 0 tecido pode ser fresco ou congelado. Numa forma de realização, a amostra é fixa e incrustada em parafina ou similares. A amostra de tecido pode ser fixa (isto é, conservada) por metodologia convencional (Veja-se, por exemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3a edição (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, Nova Iorque; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute.. of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Um perito na especialidade apreciará que a escolha de um fixador é determinada pelo propósito para o qual a amostra é para ser histologicamente corada ou de outro modo analisada. Um perito na especialidade também apreciará que o comprimento da fixação depende do tamanho da amostra de tecido e o fixador utilizado. Por meio de exemplo, formalina tamponada neutra, paraformaldeido ou de Bouin podem ser utilizados para fixar uma amostra.

Geralmente, a amostra é primeiro fixa e é em seguida desidratada através de uma série ascendente de álcoois, infiltrada e incrustada com parafina ou outros meios de seccionamento de modo que a amostra de tecido pode ser seccionada. Alternativamente, pode-se seccionar o tecido e fixar as secções obtidas. Por meio de exemplo, a amostra de tecido pode ser incrustada e processada em parafina por 46 ΕΡ2327792Β1 metodologia convencional (Veja-se, por exemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Exemplos de parafina gue podem ser utilizadas incluem, mas não são limitados a, Paraplast, Broloid, e Tecidomay. Uma vez que a amostra de tecido tenha sido incrustada, a amostra pode ser seccionada por um micrótomo ou similares (Veja-se, por exemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Por meio de exemplo para este procedimento, secções podem variar de cerca de três micrones a cerca de cinco mícrones em espessura. Uma vez que seccionada, as secções podem ser unidas a lâminas por diversos métodos padrão. Exemplos de adesivos de lâmina incluem, mas não são limitados a, silano, gelatina, poli-L- lisina e similares. Por meio de exemplo, as secções de parafina incrustada podem ser unidas a positivamente lâminas carregadas e/ou lâminas revestidas com poli- L-lisina.

Se a parafina foi utilizada como o material de embebimento, as secções de tecido são geralmente desparafinadas e reidratadas a água. As secções de tecido podem ser desparafinadas por diversas metodologias convencionais padrão. Por exemplo, xilenos e uma série gradualmente descendente de álcoois pode ser utilizada (Veja-se, por exemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Alternativamente, comercialmente disponíveis agentes não orgânicos de desparafinação tais como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas) podem ser utilizados. 47 ΕΡ2327792Β1

Opcionalmente, subsequente à preparação de amostra, uma secção de tecido pode ser analisada utilizando IHC. IHC pode ser realizado em combinação com técnicas adicionais tais como coloração morfológica e/ou hibridação fluorescência in situ. Dois métodos gerais de IHC estão disponíveis; ensaios directos e indirectos. De acordo com o primeiro ensaio, a ligação do anticorpo ao antigénio alvo (por exemplo, um IRG) é determinado directamente. Este ensaio directo utiliza um reagente marcado, tal como uma etiqueta fluorescente ou um anticorpo primário marcado com enzima, que pode ser visualizado sem interacção de anticorpo posterior. Num ensaio indirecto típico, o anticorpo primário não conjugado liga-se ao antigénio e então um anticorpo secundário marcado liga-se ao anticorpo primário. Onde o anticorpo secundário é conjugado a uma etiqueta enzimática, um substrato cromogénico ou fluorogénico é adicionado para fornecer a visualização do antigénio. A amplificação de sinal ocorre porque diversos anticorpos secundários - pode reagir - com epítopos diferentes no anticorpo primário. 0 anticorpo primário e/ou secundário utilizado para a imunohistoquímica tipicamente será marcado com uma fracção detectável. Numerosas etiquetas estão disponíveis as quais podem ser geralmente agrupadas nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 125I, 3H, e 13I. 0 anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley- Interscience, Nova Iorque, Nova Iorque, Pubs. (1991), por exemplo, e a 48 ΕΡ2327792Β1 radioactividade pode ser medida utilizando contagem de cintilação. (b) Partículas de ouro coloidal. (c) Etiquetas fluorescentes que incluem, mas não são limitadas a, quelatos de terra rara (quelatos de európio), Texas Red, rodamina, fluoresceína, dansilo, Lissamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina, ou fluoróforos comercialmente disponíveis tais como SPECTRUM 0RANGE7 e SPECTRUM GREEN7 e/ou derivados de qualquer um ou mais dos acima. As etiquetas fluorescentes podem ser conjugadas ao anticorpo utilizando as técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro. (d) Várias etiquetas de enzima-substrato estão disponíveis e a Patente US N° 4.275.149 fornece uma revisão de algumas destas. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogénico que pode ser medido utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor num substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente.

Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimiluminescência do substrato. As técnicas para quantificar uma mudança em fluorescência são descritas acima. 0 substrato quimiluminescente torna-se electronicamente excitado por uma reacção química e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando um quimiluminómetro, por exemplo) ou doa energia a um 49 ΕΡ2327792Β1 aceptor fluorescente. Exemplos de etiquetas enzimáticas incluem luciferases (por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; Patente US N° 4.737.456), luciferina, 2, 3-dihidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano silvestre (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases de sacáridos (por exemplo, glucose oxidase, galactose oxidase, e glucose- 6- fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tal como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e similares. As técnicas para conjugar enzimas a anticorpos são descritas em 0'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme- Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, Nova Iorque, 73: 147- 166 (1981) .

Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano silvestre (HRPO) com peroxidase de hidrogénio como um substrato, -em que a peroxidase de hidrogénio-oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3, 3', 5, 5'-tetrametil benzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com para-Nitrofenil fosfato como substrato cromogénico; e (iii) β- D- galactosidase (β- D- Gal) com um substrato cromogénico (por exemplo, p-nitrofenil- β- D- galactosidase) ou fluorogénico 50 ΕΡ2327792Β1 substrato (por exemplo, 4- metilumbelliferil- β- D-galactosidase).

Numerosas outras combinações de enzima-substrato estão disponíveis aos peritos na especialidade. Para uma revisão geral destas, veja-se Patentes US N° 4.275.149 e 4.318.980. Algumas vezes, a etiqueta é indirectamente conjugada com o anticorpo. O perito hábil estará prevenido de várias técnicas para alcançar isto. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com bioestanho e quaisquer das quatro categorias amplas de etiquetas mencionadas acima de podem ser conjugadas com avidina, ou vice versa. Bioestanho liga-se selectivamente a avidina e assim, a etiqueta pode ser conjugada com o anticorpo desta maneira indirecta. Alternativamente, para alcançar a conjugação indirecta da etiqueta com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um hapteno pequeno e um dos tipos diferentes de etiquetas mencionadas acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno. Assim, a conjugação indirecta da etiqueta com o anticorpo pode ser alcançada. À parte dos procedimentos de preparação de amostra discutidos acima, o tratamento posterior da secção de tecido antes de, durante ou em seguida a IHC pode ser desejado. Por exemplo, métodos de recuperação de epítopo, tais como aquecer a amostra de tecido em tampão citrato podem ser levados a cabo (veja-se, por exemplo, Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).

Em seguida a uma etapa de bloqueio opcional, o secção de tecido é exposta a anticorpo primário durante um período 51 ΕΡ2327792Β1 de tempo suficiente e sob condições adequadas tal que o anticorpo primário se liga ao antigénio da proteína alvo na amostra de tecido. Condições apropriadas para alcançar isto podem ser determinadas por experimentação de rotina. A extensão de ligação de anticorpo à amostra é determinada utilizando qualquer uma das etiquetas detectáveis discutidas acima. Preferentemente, a etiqueta é uma etiqueta enzimática (por exemplo, HRPO) que catalisa uma alteração química do substrato cromogénico tal como cromogénio 3,3'-diaminobenzidina. Preferentemente a etiqueta enzimática é conjugada ao anticorpo que se liga especificamente ao anticorpo primário (por exemplo, o anticorpo primário é anticorpo policlonal de coelho e anticorpo secundário é anticorpo anti-coelho de cabra).

Opcionalmente, os anticorpos utilizados na análise de IHC para detectar a expressão de um IRG são anticorpos gerados para ligarem-se primariamente ao IRG de interesse. Opcionalmente, o anticorpo anti-IRG é um anticorpo monoclonal. Anticorpos anti-IRG estão prontamente disponíveis na especialidade, incluindo a partir de várias fontes comerciais, e podem também ser gerados utilizando técnicas de rotina conhecidas na especialidade.

Espécimes assim preparados podem ser montados e cobertos com lamínula. A avaliação de lâmina é então determinada, por exemplo, utilizando um microscópio, e critérios de intensidade de coloração, de modo rotineiro utilizado na especialidade, podem ser utilizados. Como um exemplo, critérios de intensidade de coloração podem ser avaliados como se segue: 52 ΕΡ2327792Β1

QUADRO A

Padrão de Coloração Pontuação Nenhuma coloração é observada em células. 0 Coloração fracamente/pouquíssima perceptível é detectada em mais de 10 % das células. 1 + Coloração fraca a moderada é observada em mais de 10 % das células. 2 + Coloração moderada a forte é observada em mais de 10 % das células. 3+

Em métodos alternativos, a amostra pode ser colocada em contacto com um anticorpo específico para o dito biomarcador sob condições suficientes para que um complexo de anticorpo-biomarcador se forme, e então detectar o dito complexo. A presença do biomarcador pode ser detectada num número de maneiras, tais como por procedimentos de Western blotting e ELISA para ensaiar uma ampla variedade de tecidos e amostras, que inclui plasma ou soro. Uma ampla série de técnicas de imunoensaio utilizando tal formato de ensaio estão disponíveis, veja-se, por exemplo, Patentes US N° 4.016.043, 4.424.279 e 4.018.653. Estas incluem ambos ensaios de um único local e dois locais ou "sandwich" dos tipos não competitivos, bem como nos ensaios de ligação competitivos tradicionais. Estes ensaios também incluem a ligação directa de um anticorpo marcado a um biomarcador alvo.

Os ensaios sandwich estão entre os ensaios mais úteis e comummente utilizados. Existe um número de variações das técnicas de ensaio sandwich, e todos são destinados a 53 ΕΡ2327792Β1 estarem abrangidos pela presente invenção. De maneira breve, num ensaio directo tipico, um anticorpo não marcado é imobilizado num substrato sólido, e a amostra a ser testada colocada em contacto com a molécula ligada. Após um periodo de incubação adequado durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo anticorpo-antigénio, um segundo anticorpo específico ao antigénio, marcado com uma molécula repórter capaz de produzir um sinal detectável é então adicionado e incubado, permitindo tempo suficiente para a formação de outro complexo de anticorpo-antigénio-anticorpo marcado. Qualquer material não reagido é retirado por lavagem, e a presença do antigénio é determinada pela observação de um sinal produzido pela molécula repórter. Os resultados podem ser qualitativos, por observação simples do sinal visível, ou pode ser quantificado por meio da comparação com uma amostra de controlo que contêm quantidades conhecidas de biomarcador.

Variações no ensaio directo incluem um ensaio simultâneo, em que ambos a amostra e o anticorpo marcado são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado. Estas técnicas são bem conhecidas pelos peritos na especialidade, que incluem quaisquer variações menores como será prontamente aparente. Num ensaio sandwich directo típico, um primeiro anticorpo que tem especificidade para o biomarcador é covalentemente ou passivamente ligado a uma superfície sólida. A superfície sólida é tipicamente vidro ou um polímero, os polímeros mais comummente utilizados são celulose, poliacrilamida, náilon, polistireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ser 54 ΕΡ2327792Β1 na forma de tubos, esferas, discos de microplacas, ou qualquer outra superfície adequada para conduzir um imunoensaio. Os processos de ligação são bem conhecidos na especialidade e geralmente consistem em ligação covalentemente de reticulação ou adsorção fisicamente, o complexo de polímero-anticorpo é lavado em preparação para a amostra de teste. Uma alíquota da amostra a ser testada é então adicionada ao complexo em fase sólida e incubada durante um período de tempo suficiente (por exemplo, 2-40 minutos ou durante a noite se for mais conveniente) e sob condições adequadas (por exemplo, desde temperatura ambiente até 40 °C tal como entre 25 °C e 32 °C inclusive) para permitir a ligação de qualquer subunidade presente no anticorpo. Em seguida ao período de incubação, a fase sólida da subunidade de anticorpo é lavada e seca e incubada com um segundo anticorpo específico para uma porção do biomarcador. O segundo anticorpo é ligado a uma molécula repórter que é utilizada para indicar a ligação do segundo anticorpo ao marcador molecular.

Um método alternativo envolve imobilizar os biomarcadores alvo na amostra e então expor o alvo imobilizado ao anticorpo específico que pode ou pode não ser marcado com uma molécula repórter. Dependendo da quantidade de alvo e a potência do sinal da molécula repórter, um alvo ligado pode ser detectável por marcação directa com o anticorpo. Alternativamente, um segundo anticorpo marcado, específico ao primeiro anticorpo é exposto ao complexo de alvo-primeiro anticorpo para formar um complexo terciário de alvo-primeiro anticorpo-segundo anticorpo. O complexo é detectado pelo sinal emitido pela 55 ΕΡ2327792Β1 molécula repórter. Por "molécula repórter", como é utilizado na presente especificação, entende-se uma molécula que, pela sua natureza quimica, fornece um sinal analiticamente identificável que permite a detecção de antigénio-anticorpo ligado. As moléculas repórteres mais comummente utilizadas neste tipo de ensaio são enzimas, fluoróforos ou moléculas que contêm radionúclido (isto é, radioisótopos) e moléculas quimiluminescentes.

No caso de um imunoensaio de enzima, uma enzima é conjugada ao segundo anticorpo, geralmente por meio de glutaraldeído ou periodato. Como será prontamente reconhecido, no entanto, existe uma ampla variedade de técnicas de conjugação diferentes, que estão prontamente disponíveis ao perito hábil. Enzimas comummente utilizadas incluem peroxidase de rábano silvestre, glucose oxidase, -galactosidase e alcalina fosfatase, entre outros. Os substratos a serem utilizados com as enzimas específicas são geralmente escolhidos para a produção, mediante hidrólise pela enzima correspondente, de uma mudança de cor detectável. Exemplos de enzimas adequadas incluem fosfatase alcalina e peroxidase. É também possível utilizar substratos fluorogénicos, que produzem um produto fluorescente ao invés dos substratos cromogénicos indicados acima. Em todos os casos, a enzima-anticorpo marcado é adicionada ao primeiro complexo de anticorpo-marcador molecular, deixado para ligar, e então o reagente em excesso é retirado por lavagem. Uma solução que contém o substrato apropriado é então adicionada ao complexo de anticorpo-antigénio-anticorpo. 0 substrato reagirá com a enzima ligada ao segundo anticorpo, dando um sinal visual 56 ΕΡ2327792Β1 qualitativo, que pode ser quantificado posteriormente, usualmente espectrofotometricamente, para dar uma indicação da quantidade de biomarcador que estava presente na amostra. Alternativamente, compostos fluorescentes, tais como fluoresceina e rodamina, podem ser quimicamente acoplados a anticorpos sem alterar a sua capacidade de ligação. Quando activados pela iluminação com luz de um comprimento de onda particular, o fluorocromo-anticorpo marcado adsorve a energia luminosa, induzindo um estado a excitabilidade na molécula, seguido por emissão da luz numa cor característica visualmente detectável com um microscópio de luz. Como no EIA, o anticorpo marcado fluorescente é deixado para ligar-se ao primeiro complexo de anticorpo-marcador molecular. Após a retirada por lavagem o reagente não ligado, o complexo terciário restante é então exposto à luz do comprimento de onda apropriado, a fluorescência observada indica a presença do marcador molecular de interesse. As técnicas de imunofluorescência e EIA estão ambas muito bem estabelecidas na especialidade. No entanto, outras moléculas repórteres, tais como radioisótopo, moléculas quimiluminescentes ou bioluminescentes, podem também ser utilizadas.

Contempla-se que as técnicas descritas acima podem também ser utilizadas para detectar a expressão de IRG.

Revelam-se no presente documento protocolos que examinam a presença e/ou expressão de ARNm, tais como ARNm de IRG, numa amostra de tecido ou célula. Métodos para a avaliação de ARNm em células são bem conhecidos e incluem, 57 ΕΡ2327792Β1 por exemplo, ensaios de hibridação utilizando sondas de ADN complementar (tal como hibridação in situ utilizando ribosondas de IRG marcado, Northern blot e técnicas relacionadas) e vários ensaios de amplificação de ácido nucleico (tal como RT-PCR utilizando iniciadores complementares específicos para IRG, e outros métodos de detecção do tipo amplificação, tais como, por exemplo, ADN ramificado, SISBA, ΤΜΆ e similares).

Amostra de tecido ou células de mamíferos podem ser convenientemente ensaiadas para, por exemplo, IRG. ARNm utilizando Northern, dot blot ou análise de PCR. Por exemplo, ensaios de RT-PCR tais como ensaios de PCR quantitativo são bem conhecidos na especialidade. Divulga-se no presente documento um método para a detecção de um ARNm de IRG numa amostra biológica que compreende produzir ADNc a partir da amostra por transcrição reversa utilizando pelo menos um iniciador; amplificar o ADNc assim produzido utilizando um polinucleótido de IRG como iniciadores sense e antissense para amplificar ADNc de IRG no mesmo; e detectar a presença do ADNc de IRG amplificado. Além disso, tais métodos podem incluir uma ou mais etapas que permitem determinar os níveis de ARNm de IRG numa amostra biológica (por exemplo, pelo exame simultaneamente dos níveis de uma sequência de ARNm de controlo comparativa de um gene "housekeeping" tal como um membro da família da actina). Opcionalmente, a sequência do ADNc de IRG amplificado pode ser determinada. São revelados no presente documento iniciadores e pares de iniciador IRG, que permitem a amplificação 58 ΕΡ2327792Β1 específica dos polinucleótidos revelados no presente documento ou de quaisquer partes específicas dos mesmos, e sondas que selectivamente ou especificamente hibridizam a moléculas de ácido nucleico reveladas no presente documento ou a qualquer parte das mesmas. As sondas podem ser marcadas com um marcador detectável, tal como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelante de metal ou enzima. Tais sondas e iniciadores podem ser utilizados para detectar a presença de IRG polinucleótidos numa amostra e como um meio para a detecção de uma célula que expressa proteínas de IRG. Como será entendido pelo perito na especialidade, um muitos iniciadores e sondas diferentes podem ser preparados com base nas sequências proporcionadas no presente documento e utilizados efectivamente para amplificar, clonar e/ou determinar a presença e/ou níveis de ARNm deIRG. São Revelados no presente documento protocolos que examinas ou detectam ARNm, tal como ARNm de IRG, numa amostra de tecido ou célula por meio de tecnologias de micro-arranjo. Utilizando micro-arranjos de ácido nucleico, amostras de ARNm de teste e controlo de amostras de tecidos de teste e controlo são transcritas de forma reversa e marcadas para gerar sondas de ADNc. As sondas são então hibridizadas a um arranjo de ácidos nucleicos imobilizado num suporte sólido. 0 arranjo é configurado tal que a sequência e posição de cada membro do arranjo é conhecido. Por exemplo, uma selecção de genes que têm potencial de serem expressos em certos estados patológicos pode ser arranjada num suporte sólido. Hibridização de uma sonda 59 ΕΡ2327792Β1 marcada com um membro do arranjo particular indica que a amostra da qua a sonda foi derivada expressa esse qene. A análise de expressão diferencial génica de tecido doente pode fornecer informação valiosa. A tecnologia de micro-arranjo utiliza técnicas de hibridização de ácido nucleico e tecnologia de computação para avaliar a expressão de perfil de ARNm de milheres de genes dentro de uma única experiência, (veja-se, por exemplo, o documento WO 01/75166 publicado em 11 de Outubro de 2001; (Veja-se, por exemplo, o documento U.S. 5, 700, 637, Patente dos EUA 5, 445, 934, e Patente dos EUA 5, 807, 522, Lockart, Nature Biotechnology, 14: 1675- 1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21 (Suppl) : 15- 19 (1999) para uma discussão de fabrico de arranjo) . Micro-arranjos de ADN são arranjos em miniatura que contêm fragmentos de gene que são sintetizados directamente sobre ou manchado sobre vidro ou outros substratos. Milhares de genes são usualmente representados num único arranjo. Uma experiência de micro-arranjo típica envolve as seguintes etapas: 1) preparação de alvo marcado fluorescentemente de ARN isolado da amostra, 2) hibridização do alvo marcado ao micro-arranjo, 3) lavagem, coloração e rastreio do arranjo, 4) análise da imagem rastreada e 5) geração de expressão perfis génicos. Actualmente dois tipos principais de micro arranjos de ADN Estão a ser utilizado arranjos de oligonucleótido (usualmente 25 até 70 mers) e arranjos de expressão génica que contêm produtos de PCR preparados a partir de ADNc. Na formação de um arranjo, os oligonucleótidos podem ser prefabricados e manchados as superfície ou directamente sintetizados na superfície (in situ). 60 ΕΡ2327792Β1 0 sistema Affymetrix GeneChip® é um sistema de micro-arranjo comercialmente disponível que compreende arranjos fabricados por meio de sintese directa de oligonucleótidos num superfície de vidro. Arranjos de Sonda/Gene: Oligonucleótidos, usualmente 25 mers, são directamente sintetizados sobre uma hóstia de vidro por meio de uma combinação de fotolitografia com base em semiconductor e tecnologias sintese química em fase sólida. Cada arranjo contém até 400.000 oligos diferentes e cada oligo é presente em milhões de cópias. Uma vez que as sondas de oligonucleótido são sintetizados em localizações conhecidas no arranjo, os padrões de hibridização e intensidades de sinal podem ser interpretadas em termos de identidade de gene e níveis de expressão relativos pelo software Affymetrix Micro-array Suite. Cada gene é representado no arranjo por uma série de diferentes sondas de oligonucleótido. Cada par de sondas consiste em um oligonucleótido de combinação perfeita e um oligonucleótido sem combinação perfeita. A sonda da combinação perfeita tem uma sequência exactamente complementar ao gene particular e assim mede a expressão do gene. A sonda sem combinação perfeita difere da sonda de combinação perfeita em uma única substituição de base na base de posição central, atrapalhando a ligação do transcrito gene alvo. Isto ajuda a determinar a hibridização antecedente e não específica que contribui ao sinal medido para o oligo de combinação perfeita. O software Micro-array Suite subtrai as intensidades de hibridização das sondas sem combinação perfeita daquelas das sondas de combinação perfeita para determinar o valor de intensidade absoluta ou específico para cada conjunto de sondas. As sondas são escolhidas com 61 ΕΡ2327792Β1 base em informação actual do Genbank e outros depósitos de nucleótido. Acredita-se que as sequências reconheçam regiões únicas da extremidade 3'do gene. Um forno de Hibridização de GeneChip (forno "de churrascaria") é utilizado para levar a cabo a hibridização de até 64 arranjos num tempo. A estação de fluidos realiza a lavagem e coloração dos arranjos de sonda. É completamente automático e contém quatro módulos, com cada módulo suportando um arranjo de sonda. Cada módulo é controlado independentemente através de software Micro-array Suite utilizando protocolos de fluidos pré-programados. 0 scanner é um scanner de fluorescência laser confocal que mede a intensidade de fluorescência emitida pelos ARNc marcados ligados ao arranjo de sondas. A estação de trabalho do computador com software Micro-array Suite controla a estação de fluidos e o scanner. 0 software Micro-array Suite pode controla até oitp estações de fluidos utilizando protocolos de hibridização, lavagem, e coloração pré-programados para o arranjo de sonda. 0 software também adquire e converte os dados de intensidade de hibridização num chamado de presença/ausência para cada gene utilizando apropriado algoritmos. Finalmente, o software detecta mudanças em expressão génica entre experiências por meio de análise de comparação e formata o resultado em ficheiros .txt, que podem ser utilizado com outros programas de software para análise de dados adicionais. A expressão, de um biomarcador seleccionado pode também ser avaliada pelo exame de deleção de gene ou amplificação de gene. A deleção ou amplificação de gene pode ser medida por qualquer um de uma ampla variedade de 62 ΕΡ2327792Β1 protocolos conhecidos na especialidade, por exemplo, por convencional Southern blotting, Northern blotting para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)), dot blotting (análise de ADN), ou hibridização in situ (por exemplo, FISH), utilizando uma sonda marcada apropriadamente, métodos citogenéticos ou hibridização genómica comparativa (CGH) utilizando uma sonda marcada apropriadamente. Por meio de exemplo, estes métodos podem ser utilizados para detectar deleção ou amplificação de genes de IRG. A expressão de um biomarcador seleccionado numa amostra de tecido ou célula pode também ser examinada por meio de ensaios funcional ou com base em actividade. Por exemplo, se o biomarcador é um enzima, um pode realizar ensaios conhecidos na especialidade para determinar ou detectar a presença da dada actividade enzimática na amostra de tecido ou célula.

Nos métodos revelados no presente documento, é contemplado que a amostra de tecido ou célula pode também ser examinada para a expressão de interferões tais como interferões Tipo 1, e/ou activação da via de sinalização de interferão Tipo 1, na amostra. Examinar a amostra de tecido ou célula para expressão de interferões Tipo 1 e/ou os correspondentes receptores, e/ou activação da via de sinalização de interferão Tipo, pode dar mais informação como se a amostra de tecido ou célula será sensível a um inibidor de interferão. Por meio de exemplo, as técnicas de IHC descritas acima podem ser utilizadas para detectar a presença de uma de mais de tais moléculas na amostra. É 63 ΕΡ2327792Β1 contemplado que nos métodos em que um tecido ou amostra está a ser examinada não somente para a presença de IRG, mas também para a presença de, por exemplo, interferão Tipo 1, receptores de interferão, porta-objectos separados podem ser preparados a partir do mesmo tecido ou amostra, e cada porta-objecto testado com um reagente específico para cada biomarcador ou receptor específico. Alternativamente, um único porta-objecto pode ser preparado a partir da amostra de tecido ou célula, e anticorpos direccionados a cada biomarcador ou receptor podem ser utilizados juntamente com um protocolo de coloração multicolor para permitir a visualização e detecção dos respectivos biomarcadores ou receptores.

Subsequente à determinação de que a amostra de tecido ou célula expressa um ou mais dos biomarcadores que indicam que a amostra de tecido ou célula será sensível ao tratamento com inibidor de interferões, é contemplado que uma quantidade eficaz do inibidor de interferão pode ser administrado ao mamífero para tratar um distúrbio, tal como distúrbio auto-imune que está a afligir o mamífero. 0 diagnóstico em mamíferos das várias condições patológicas descritas no presente documento pode ser feito pelo perito na especialidade. Técnicas de diagnóstico estão disponíveis na especialidade que permite, por exemplo, o diagnóstico ou detecção de doença relacionado à auto-imunidade num mamífero.

Um inibidor de interferão pode ser administrado de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa como um bolus ou por meio de infusão contínua 64 ΕΡ2327792Β1 ao longo de um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. Opcionalmente, a administração pode ser realizada através de infusão por meio de mini-bomba utilizando vários dispositivos comercialmente disponíveis.

Dosagens eficazes e programas para a administração de inibidor de interferões podem ser determinados empiricamente, e fazer tais determinações está dentro da perícia na especialidade. Dosagens únicas ou múltiplas podem ser utilizadas. Por exemplo, uma dosagem eficaz ou quantidade de inibidor de interferão utilizado em separado pode variar de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia. O escalonamento de dosagens inter-espécies pode ser realizado num maneira conhecida na especialidade, por exemplo, como revelado em Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991).

Quando a administração in vivo de inibidor de interferão é utilizada, quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10 ng/kg a 100 mg/kg de peso corporal do mamífero ou mais por dia, preferentemente de cerca de 1 mg/kg/dia até 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. Directrizes de dosagens e métodos particulares de administração são proporcionados na literatura; veja-se, por exemplo, Pat. U.S. Pat. N°. 4.657.760; 5.206.344; ou 5.225.212. É antecipado que diferentes formulações sejam eficazes para diferentes compostos de tratamento e distúrbios diferentes, que a administração dirigida a um órgão ou tecido, por exemplo, 65 ΕΡ2327792Β1 pode necessitar distribuição num menaira diferente daquela a outro órgão ou tecido. É contemplado que ainda terapêuticas adicionais podem ser utilizadas nos métodos. A uma ou mais outras terapêuticas podem incluir, mas não são limitadas a, administração de esteróides e outros regimes de cuidado padrão para o particular distúrbio auto-imune em questão. É contemplado que tais outras terapêuticas podem ser utilizadas como um agente separado do inibidor de interferão.

Para utilização nas aplicações descritas ou sugeridas acima de, kits ou artigos de fabrico são também revelados no presente documento. Tais kits podem compreender um meio portador sendo compartimentalizado para receber em confinamento fechado um ou mais meios contentores tais como frascos, tubos, e similares, cada um dos meios contentores que compreendem um do elementos separados a ser utilizado no método. Por exemplo, um dos meios contentores pode compreender uma sonda que é ou pode ser detectavelmente marcadas. Tal sonda pode ser um anticorpo ou polinucleótido especifico para gene IRG ou mensagem, respectivamente. Onde o kit utiliza hibridização de ácido nucleico para detectar o ácido nucleico alvo, o kit pode também ter contentores que contêm nucleótido(s) para amplificação da sequência de ácido nucleico alvo e/ou um contentor que compreende um meios de repórter, tais como um proteína de ligação a biotina, tal como avidina ou estreptavidina, ligados a um molécula repórter, tal como uma etiqueta enzimática, florescente, ou radioisótopo. 66 ΕΡ2327792Β1 0 kit revelado no presente documento tipicamente compreenderá o contentor descrito acima e um ou mais outros contentores que compreendem materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de utilizador, que inclui tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e folheto com instruções para utilização. Um etiqueta pode estar presente no contentor para indicar que a composição é utilizada para uma terapêutica especifica ou aplicação não terapêutica, e pode também indicar direcções para utilização in vivo ou in vitro, tal como aquelas descritas acima.

Os kits revelados no presente documento têm um número de formas de realização. Uma forma de realização típica é um kit que compreende um contentor, uma etiqueta em dito contentor, e uma composição contida dentro de dito contentor; em que a composição inclui um anticorpo primário que se liga a uma sequência de polipéptido IRG, a etiqueta em dito contentor indica que a composição pode ser utilizada para avaliar a presença de proteínas de IRG em pelo menos um tipo de célula de mamífero, e instruções para utilizar o anticorpo IRG para avaliar a presença de proteínas de IRG em pelo menos um tipo de célula de mamífero. 0 kit pode ainda compreender um conjunto de instruções e materiais para a preparação de uma amostra de tecido e aplicação de anticorpo e sonda à secção de uma amostra de tecido. 0 kit pode incluir tanto um anticorpo primário como secundário, em que o anticorpo secundário é conjugado a uma etiqueta, por exemplo, uma etiqueta enzimática. 67 ΕΡ2327792Β1

Divulga-se no presente documento um kit que compreende um contentor, uma etiqueta em dito contentor, e uma composição contida dentro de dito contentor; em que a composição inclui um polinucleótido que hibridiza a um complemento do polinucleótido de IRG sob condições restringentes, a etiqueta em dito contentor indica que a composição pode ser utilizada para avaliar a presença de IRG em pelo menos um tipo de célula de mamífero, e instruções para utilizar o polinucleótido de IRG para avaliar a presença de ARN ou ADN de IRG em pelo menos um tipo de célula de mamífero.

Outros componentes opcionais no kit incluem um ou mais tampões (por exemplo, tampão de bloqueio, tampão de lavagem, tampão de substrato, etc), outros reagentes tais como substrato (por exemplo, cromogéneo) que é quimicamente alterado por uma etiqueta enzimática, solução de recuperação de epítopo, amostras de controlo (controlos positivo e/ou negativo), porta-objectos de controlo etc. 0 seguinte são exemplos dos métodos e composições da invenção. É entendido que várias outras formas de realização pode ser praticadas, dado a descrição geral proporcionado acima. 68 ΕΡ2327792Β1

EXEMPLOS

Exemplo 1

Materiais e Métodos A expressão de genes sensíveis a IFN-α (IRG's) foi analisada em data de sangue - células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células brancas do sangue (WBC) de dadores normais e pacientes de SLE de duas fontes: um colaboração com Tim Richardson na Universidade de Michigan, e Genelogic Corportion.

Os dados de Richardson foram obtidos como segue: o sangue foi colhido de 25 pacientes de SLE e 20 dadores saudáveis. ARN foi preparado a partir de PBMC por meio de centrifugação de gradiente Ficoll padrão e hibridizadas a chips HGU133P Affymetrix. Os dados brutos foram processados por meio de Affymetrix MAS5 para produzir Sinal.

Os dados de SLE de Genelogic foram obtidos como segue: o sangue foi colhido de 73 pacientes de SLE e 64 controlos saudáveis. ARNm de Globin foi removido por meio de purificação por afinidade e os ARNm restante foi hibridizado a chips HGU133 A e B de acordo com protocolos padrão. Os dados brutos foram processados por meio de Affymetrix MAS5 para produzir Sinal.

Os dados Micro-arranjo foram agrupados em duas 69 ΕΡ2327792Β1 dimensões (amostras e conjuntos de sondas) utilizando o programa de computador xcluster (pearson em sinal de log2) em conjuntos de sondas com sinal médio > 100 e coeficiente de variabilidade superior a 0,2. Os dados agrupados foram vistos com o programa de computador Java Treeview. A análise numérica foi realizada com Excel (Microsoft, Redmond, WA).

Resultadoss e Análise

Análise de micro-arranjo foi realizada nas amostras de SLE de Richardson. Amostras claramente agrupadas por categoria de doença (SLE ou normal) , e este padrão foi robusto para variação nos parâmetros de conjunto de filtragem de sondas (50 < sinal < 200, 0,2 < CV < 0,6) . Diversos subagrupamentos diferentes de conjuntos de sondas agrupados proximamente mostraram atributos biológicos comuns óbvios. Por exemplo, um subagrupamento foi altamente enriquecido para genes conhecidos por serem específicos a células B, outro a neutrófilos, outro para anticorpos, e outro para IRG's. O subagrupamento de IRG mostrou um padrão interessante com respeito a amostras: todas as amostras normais mostraram baixa expressão de IRG's, enquanto amostras de SLE mostraram uma ampla variedade de expressão que variou desde quase normal até extremamente alto.

Os perfis de expressão de conjuntos de sondas dentro de um subagrupamento próximo são muito similares, mas não idênticas, e a variação entre perfis muito similares pode ser devida em parte significante a ruído de fontes biológicas ou tecnológicas. Por exemplo, alguns genes são 70 ΕΡ2327792Β1 representados no micro-arranjo por mais de um conjunto de sondas, e existem diversos pares de conjuntos de sondas na área de subagrupamento IRG que representam a mesma expressão de gene. Nestes casos, os conjuntos de sondas agrupados próximos entre si, algumas vezes, mas não sempre imediatamente adjacente. Assim parece que um claro padrão estava presente e reflectia em muitos conjuntos de sondas, e que a padrão poderia mais claramente ser identificada pela utilização dos dados de diversos conjuntos de sondas com a finalidade de limitar o efeito de ruído. Apesar de tudo, os genes que foram identificados poderiam ser utilizados como identificadores genéticos que correlacionam com presença de doença.

Desenvolvimento de uma métrica que correlaciona com a doença, e identificação de genes individuais que podem constituir tal métrica

Tentou-se medir o padrão por calcular uma métrica individual proporcional aos níveis Sinal do sub-grupo específico de conjuntos de sondas. Por exemplo, descreve-se esta abordagem a seguir com os conjuntos de sondas de IRG. 0 padrão (o perfil agregado de de IRG) foi pela primeira vez definido aproximadamente por estimativa visual de um grupo de conjuntos de sondas que aparecia em Treeview que era o conjunto que continha o padrão mais que qualquer outro padrão e mais que mero ruído. Este grupo foi os duzentos conjuntos de sondas que incluem ou agrupam ao redor o par correlacionado mais proximamente de núcleo de conjuntos de sondas no subagrupamento. 71 ΕΡ2327792Β1

Os dados de expressão deste grupo foi então transformado em pontuações z (média escalonada até 1, base-2 log transformado, então escalonado a um desvio padrão da média de 1), e o coeficiente de correlação de cada perfil do conjunto de sondas ao perfil médio foi calculado. Estes coeficientes de correlação foram utilizados como factores de ponderação para pondera relativamente pesado os conjuntos de sondas que mostraram a combinação mais forte à tendência do grupo, e para ponderam relativamente leve aqueles que aparentemente foram mais afectados por outras entradas ou ruído. 0 factores requeridos para escalonar conjuntos de sondas até 1 foram multiplicados pelo factor de ponderação, para produzir um factor composto que poderia proporcionar uma métrica normaliza, ponderada para um ponto de dados. As amostras normais de assinaturas de sangue foram multiplicados por esse factor, calculadas a média através de ambos os conjuntos de sondas e amostras, e este número foi invertido para produzir um factor de escalonamento global que transformaria o resultado da média de conjuntos de sondas de uma amostra numa métrica que seria esperada que fosse 1 se normal. Cada normalização/factor de ponderação foi multiplicado por este factor. 0 resultado é um vector de valores de escalonamento que são multiplicados por uma amostra assinatura de expressão e calculados a média para produzir a Métrica de Gene de Resposta a Interferão do tipo I (IRGM), uma métrica individual que mede o nível de resposta transcricional a IFN- α numa amostra. 0 número de conjuntos de sondas que foi utilizado nesta métrica foi menor que conjunto original de duzentos 72 ΕΡ2327792Β1 que originalmente ajudou a defini-lo. Vinte e quatro conjuntos de sondas foram tipicamente utilizados (Quadro 1), embora conjuntos de oito a cem foram testados e realizados também.

Para fins de validação, o IRGM foi determinado para conjuntos de amostras biológicas de tipo de tecido similar (isto é, todo sangue completo, todo biópsia de pele, etc.) e desenhado para grupos múltiplos que incluíam pelo menos uma grupo de doença e um grupo normal. As amostras analisadas não continham as amostras utilizados para gerar os parâmetros de IRGM. As métricas medidas para conjuntos diferentes foram comparadas entre si combinando-as numa lista única ordenada por classificação e avaliando o grau a que amostras de um grupo particular segregam a uma parte particular da lista.

As pontuações IRGM foram calculadas e avaliadas para um conjunto de amostras completamente distintos daquelas utilizadas para selecção dos genes de IRGM e treinamento dos parâmetros de teste. Tanto as amostras de PBMC como de sangue completo de pacientes saudáveis ou pacientes que sofrem de SLE mostraram uma separação muito clara (Figura 1): pacientes saudáveis tinham relativamente baixo IRGM, e proximamente agrupados, enquanto pacientes de SLE variavam quase uniformemten desde a extremidade superior do intervalo normal até 40. Doença de Wegener, nefropatia de IgA (Figura 2), artrite reumatóide todos mostraram pouca separação, com pontuações máximas amostra de doença entre 5 e 10. Amostras de sangue de psoríase mostraram padrões similares, mas separação menos marcada, com IRGM máximos de 73 ΕΡ2327792Β1 ao redor de 7. Biópsias de pele psoriaticas foram significativamente altas em comparação com tanto biópsias de pele sem lesões de pacientes com psoriase como com biópsias de pele de dadores saudáveis (Figura 3).

Para diversos genes no vector de conjunto de sondas de IRGM existe mais de um conjunto de sondas que os representa, dando uma oportunidade de calibrar se a variação técnica entre conjuntos de sondas exerce um efeito significante sobre os dados de expressão observados. Membros de cada um destes pares de conjuntos de sondas foram observados aqui que mostram perfis de expressão altamente correlacionados entre si com relação à magnitude de seus perfis individuais e por agrupar muito proximamente juntamente com relação a conjuntos de sondas de outros genes. Esta observação indica que os dados são mediç4oes precisas de expressão génica e que questões técnicas relacionadas com a selecção de sonda e desenho de conjunto de sondas têm no máximo um efeito menor negativo.

Medições clinicas de actividade de doença de SLE e gravidade tal como SLEDAI quantificam sintomas de doença no paciente e podem correlaciona com expressão de genes que baseiam a etiologia da doença. Com a finalidade de investigar esta hipótese, dados de IRGM de pacientes individuais foram comparados com aquelas pontuações de pacientes de SLEDAI. Embora globalmente a correlação pareceu ser relativamente fraca (R = 0,2125), the correlação foi estatisticamente significativa. A correlação foi confirmada pela observação de que interacção foi mais forte quando as pontuações de SLEDAI foram 74 ΕΡ2327792Β1 compartimentalizadas em três categorias iguais e a diferença entre as categorias foi testada (Figura 4). 0 teste de IRGM, e a expressão dos genes que proporcionaram tal teste (como representado em Quadro 1), poderia ser útil para a selecção de pacientes que poderiam se beneficiai de tratamento com base em IFN-oí para distúrbios auto-imunes (por exemplo, SLE) pela identificação de pacientes que têm uma pontuação relativamente alta de IRGM e assim têm sinalização de IFN-oí que poderia ser bloqueada. Equivalentemente, poderia ser utilizado para predizer se certos pacientes não se beneficiariam de tratamento com base em IFN-α porque não exibem uma pontuação alta de IRGM e assim não são actualmente experimentando sinalização activa de IFN-α que poderia ser interrompida. 0 teste de IRGM, e expressão dos genes que proporcionam tal teste (como representado em Quadro 1), são indicadores úteis numa variedade de configurações de desenvolvimento de fármaco, diagnóstico, prognóstico e terapêutico como descrito acima de. Por exemplo, esta informação poderia ser utilizada para verificar se pacientes que responderam bem a tratamento anti-IFN-a tinham altos níveis de expressão dos alvos de sinalização de IFN-α antes de tratamento e depois disso se o tratamento anulou esta expressão. Seria uma calibração útil da extensão a qual um tratamento particular afecta a via de sinalização de IFN-α. Poderia ser um marcador bio- ou farmacodinâmico útil, medindo o perfil dos efeitos de tratamento ao longo do tempo. 75 ΕΡ2327792Β1

Outros Interferões A abordagem baseada em métrica descrita acima poderia ser utilizada numa variedade de vias em caracterização de vias de doença, mecanismos de acção e farmacodinâmica de fármaco. Por exemplo, diferentes moléculas de interferão provavelmente têm diferentes propriedades que o IRGM e/ou um teste feito do mesmo modo com base em diferentes dados de micro-arranjo e/ou análises poderia ajudar a medir e elucidar. Por exemplo: 1) Todos interferões de Tipo I sinalizam através do mesmo receptor heterodimérico, mas podem diferir em sua semivida, receptor afinidade, ou poder para iniciar a sinalização numa célula alvo. Estas diferenças em magnitudes poderiam ser medidas facilmente e precisamente por meio de IRGM. Este classificação de medições poderia ser levada a cabo numa experiência de cultura celular ou numa instalação clinica. Do mesmo modo, o efeito de fármacos candidatos ou fármacos utilizados em instalação clinica podem ser calibrado utilizando esta abordagem. 2) Diferentes testes semelhante a IRGM poderia ser construídos por meio de ensaios de micro-arranjo de amostras de sangue cultivadas tratadas com diferentes interferões. À extensão em que os testes diferem entre si, poderiam ser aplicados a amostras clínicas para determinar as actividades relativas de diferente interferões e/ou fármacos. 76 ΕΡ2327792Β1

Outras Assinaturas 0 método utilizado para gerar o teste de IRGM poderia também ser aplicado a qualquer classificação de assinatura de expressão, de um estado ou actividade de células ou de um tipo de célula ou células. Por exemplo, existem mudanças transcricionais particulares associadas a replicação de célula mitótica activo. Estas mudanças transcricionais poderia ser consolidadas num teste que seria aplicado a uma variedade de amostras biológicas para medir como estão se dividindo activamente. Ou em outro exemplo, os genes cuja expressão é especifico a particular tipos de células imunes poderiam ser categorizado por qual tipo de célula os expressa e então para cada tipo de célula um teste poderia ser feito. Esta colecção de testes poderia então ser aplicada a qualquer de uma variedade de amostras clinicas (sangue de pacientes de SLE, biópsias intestinais de pacientes com Doença de Crohn, etc.) para determinar o equilíbrio de tipos de célula imune. 77 ΕΡ2327792Β1

Quadro 1. Conjuntos de sondas, identificadores de bases de dados única, e nomes correspondendo a genes que têm expressão aumentada. Estes conjuntos de sondas foram também utilizados para gerar um teste de métrica individual (também descrito como ο I teste de RGM no presente documento). conjunto de Símbolo RefSeq ID Nome sondas (Símbolos) 22670 2_at AFAR17068 NM_2 07 315 similar a membro induzivel (TYKI) do LPS da famnilia de timidilato cinase 22322 0_s_at BAL NM_0 31458 Gene de linfoma B agressivo (PARP9) 2198 63_at ERRS16511 NM_016323 proteína de ligação a (HERC5) ciclina-E 1 (LOC51191) 242625_at CIG5 NM_080657 Cig5 (RSAD2) 208436_s_at IRF7 NM_0 04 02 9 Factor regulador de (IRF 7) interferão 7 (IRF7) 204747_at IFIT4 NM_0 0154 9 Proteína de (IFIT3) tetratricopéptido induzida por interferão IFI60 (IFIT4) 213797_at CIG5 NM__0 80 657 Cig5 (RSAD2) 2 02 08 6_at MX1 NM__0 02 4 62 Resistência a influenza por (MX1) Myxovirus 1 213294_at WTCF34654 BG283489 FLJ38348 (PRKR) 227 60 9_at BRESI1 NM__0 01002264 Proteína de interacção (EPSTIl) estromar epitelial de mama putativo 205483_s_at Isgl5 NM_0 05101 Proteína estimulada por (G1P2) Interferão (15 kDa) 78 ΕΡ2327792Β1 218943_s_at RIG-1 NM_014314 (DDX58) AF 0 3 8 9 6 3 202446_s_at P37 NM_021105 Fosfolípido escramblase P37 (PLSCR1) 214453_s_at MTAP44 NM_0 0 6417 "Ag. microtubular associado (IFI44) a hepatite C induzida por interferão 21935 6_s_at HSPC177 NM_016410 Proteína de modificação de (SNF7DC2) cromatina 5 203595_s_at RI 5 8 NM_012420 Proteína induzível por (IFIT5) ácido retinóico e interferão (58kD) 2 04 4 3 9_at VERC16692 NM_006820 quadro de leitura aberta 1 (IFI44L) de cromossomo 29 218400_at OAS3 NM_0 0 618 7 2'-5'-oligoadenilato (OAS 3) sintetase 3 2 0 97 62_x_at SpllO NM_0 04 50 9 Co-activador transcricional (SP110) SpllO 2 30 03 6_at SAMD9L NM_152703 domínio de motivo estéril (C7orf 6) alfa que contém 9-similar 229450_at IFIT4 NM_0 0154 9 Proteína de (IFIT3) tetratricopéptido induzida por interferão IFI60 (IFIT4) 2 08 96 6_x_at ANNY16434 NM_0 05531 clone MGC:23885 (IFI16) IMAGE:4703266, ARNm, complete cds 203153_at IFIT1 NM_001001887 Proteína induzida por (IFIT1) interferão com repetições de tetratricopéptido 1 226603_at SAMD9L NM_152703 domínio de motivo estéril (C7orf 6) alfa que contém 9-similar 79 ΕΡ2327792Β1

Quadro 2. um conjunto ilustrativo de genes com expressão aumentada em distúrbios auto-imunes. conjunto de sondas Símbolo Identificador de RefSeq (Símbolos) Nome 21840 0_at OAS3 NM_0 06187 (OAS3) 2'-5'-oligoadenilato sintetase 3 218943_s_at RIG-1 NM_014314 (DDX58) AF038963 21935 6_s_at HSPC177 NM_016410 (SNF7DC2) Proteína de modificação de cromatina 5 2198 63_at ERRS16511 NM_016323 (HERC5) proteína de ligação a ciclina-E 1 (LOC51191) 223220_s_at BAL NM_0 31458 (PARP9) Gene de linfoma B agressivo 226603_at SAMD9L NM_152703 (C7orf 6) domínio de motivo estéril alfa que contém 9-similar 226702_at AFAR17068 NM_2 07 315 (TYKI) similar a membro induzível do LPS da família de timidilato cinase 227 60 9_at BRESI1 NM_0 01002264 (EPSTI1) Proteína de interacção estromar epitelial de mama putativo 2 30 03 6_at SAMD9L NM_152703 (C7orf 6) domínio de motivo estéril alfa que contém 9-similar

Exemplo 2 A abordagem utilizado no Exemplo 1 para definir sondas e genes a ser utilizadas como marcadores de assinatura interferão do tipo I foi então estendida para identificar 78 sondas (49 genes) como marcadores de assinatura de 80 ΕΡ2327792Β1 interferão do tipo I e para ilustram sua utilidade no diagnóstico de pacientes de doenças auto-imunes (tais como aqueles com SLE) com base nos niveis de expressão destes genes em amostras de paciente.

Materiais e Métodos

Dados Micro-arranjo foram obtido como segue: sangue foi colhido desde 76 pacientes de SLE e 46 controlos saudáveis. ARNm de Globin foi removido por meio de purificação por afinidade e o restante ARNm foi hibridizado a chips HGU133 A e B de acordo com protocolos padrão. Os dados brutos foram processados pelo algoritmo Affymetrix MAS5 para produzir dados de Sinal. Os dados de micro-arranjo foram agrupados em duas dimensões (amostras e conjuntos de sondas) utilizando o programa de computador xcluster (pearson em sinal de log2) nos conjuntos de sondas com sinal médio > 100 e coeficiente de variabilidade superior a 0,2. Os dados agrupados foram vistos com o programa de computador Java Treeview. A análise numérica foi realizada com R. "R" é um projecto com base em comunidade com fonte aberta com as seguintes características: titulo = R: A Language and Environment for Statistical Computing; autor = R Development Core Team; organização = R Foundation for Statistical Computing; Morada = Vienna, Áustria; ano = 2006; nota = ISBN 3- 900051- 07- 0.

Resultados e Análise

Os genes de Tipo I induzido por interferão foram 81 ΕΡ2327792Β1 identificados da anotação de Genbank e várias fontes de literatura. Estes genes foram mapeados para sondas Affymetrix e sua densidade através um agrupamento global de dados de micro-arranjo de sangue completo de SLE e saudável controlo foi representado em gráfico com uma largura de banda de 30 (Figura 5). A curva de densidade destas sondas revelou uma distribuição amplo, mas espalhada com um único agrupamento muito denso de sondas dentro da região do agrupamento que definiu a clara separação de amostra entre SLE e amostras de controlo saudáveis por sua modulação superior marcada em amostras de SLE. Sondas no pico da muito dense região foram relativamente altamente correlacionado em seus padrões de expressão. O conjunto de sondas diagnostica de forma óptima a assinatura de indução interferão do tipo I em SLE foi definido como aqueles que contêm o pico da curva de densidade e que inclui todas as sondas que foram ligadas com um coeficiente de correlação de superior a 0,9 (Quadro 3). A Métrica de Gene de Resposta de Interferão do tipo I (IRGM) foi calculada para cada amostra de sangue como previamente descrito, mas com base no conjunto de genes aprsentaod em Quadro 3. Um Teste t de Student mostra a grande (> 6 vezes) e significante (p-valor < .0001) diferença entre a média dos dois grupos (Figura 6) . Um gráfico de distribuições dos dois grupos de amostras contra normal quantiles mostra diferenças em suas distribuições (Figura 7) . A distribuição das amostras de controlo parece ser muito baixa e log-normal com algumas excepções superiores, enquanto as amostras de SLE são mais igualmente (linearmente) distribuídas através um amplo intervalo 82 ΕΡ2327792Β1 dentro do intervalo de controlos saudáveis até níveis muito altos. Este grande espalhamento de pontuações IRGM poderia suportar um robusto diagnóstico para diferentes categorias de estado da doença ou tipo de SLE.

Quadro 3. Conjuntos de sondas, identificadores de bases de dados única, símbolos, e nomes correspondendo a genes gue mostram um padrão de expressão induzida por interferão em SLE e amostras de controlo saudável.

Sonda Acesso a base de dados Símbolo Nome 213797_at NM_080657 RSAD2 domínio de radical S-adenosil metionina gue contém 2 226702_at NM_2 0 7 315 LOC129607 proteína hipotética LOC129607 214453_s_at NM_00 6417 IFI44 proteína induzida por interferão 44 227609_at NM_0 01002264 EPSTI1 interacção estromal epitelial 1 242625_at NM_080657 RSAD2 domínio de radical S-adenosil metionina gue contém 2 23003 6_at NM_152703 SAMD9L domínio de motivo estéril alfa gue contém 9-similar 214 05 9_at NM_006417 IFI44 proteína induzida por interferão 44 21840 0_at NM_006187 OAS3 2'-5'-oligoadenilato sintetase 3, lOOkDa 226603_at NM_152703 SAMD9L domínio de motivo estéril alfa gue contém 9-similar 21986 3_at NM_016323 HERC5 domínio hect e RLD 5 83 ΕΡ2327792Β1 2 04 4 3 9_at NM_006820 IFI44L proteína induzida por interferão 44-similar 228617_at NM_017523 XIAPAF1 Factor associado a XIAP-1, variante d etraanscripto 1 203596_s_at NM_012420 IFIT5 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 204972_at NM_001032731 OAS2 2'-5'-oligoadenilato sintetase 2, 69/71kDa 205483_s_at NM_005101 G1P2 interferão, proteína alfa-induzível (clone IFI-15K) 219211_at NM_017414 USP18 protease ubiquitina específica 18 223220_s_at NM_031458 PARP9 família poli (ADP-ribose) polimerase, membro 9 2 05 660_at NM_003733 OASL 2'-5'-oligoadenilato sintetase-similar 204747_at NM_001031683 IFIT3 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 218943_s_at NM_014314 DDX58 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polipéptido 58 203153_at NM_001001887 IFIT1 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 2 05552_s_at NM_001032409 OAS1 2',5'-oligoadenilato sintetase 1, 40/46kDa 224701_at NM_017554 PARP14 poli (ADP-ribose) polimerase família, membro 14 208436_s_at NM_001572 IRF7 factor regulador de interferão 7 84 ΕΡ2327792Β1 210797_s_at NM_003733 OASL 2'-5'-oligoadenilato sintetase-similar 203595_s_at NM_012420 IFIT5 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 2190 62_s_at NM_017742 ZCCHC2 dedo de zinco, domínio CCHC que contém 2 202145_at NM_002346 LY6E complexo 6 de linfócito antigénio, locus E 209417_s_at NM_005533 IFI35 proteína induzida por interferão 35 222154_s_at NM_015535 DPTP6 proteína D polimerase-transactivada 6 21935 6_s_at NM_016410 CHMP5 proteína de modificação de cromatina 5 219352_at NM_001013000 HERC6 domínio hect e RLD 6 218543_s_at NM_022750 PARP12 poli (ADP-ribose) polimerase família, membro 12 228607_at NM_001032731 OAS2 2'-5'-oligoadenilato sintetase 2, 69/71kDa 226757_at NM_001547 IFIT2 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 202446_s_at NM_021105 PLSCR1 Fosfolípido escramblase 1 219684_at NM_022147 TMEM7 proteína transmembrana 7 232222_at NM_017742 ZCCHC2 dedo de zinco, domínio CCHC que contém 2 208087_s_at NM_030776 ZBP1 Proteína de ligação Z-D 1 229450_at NM_001031683 IFIT3 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 85 ΕΡ2327792Β1 225291_at NM_033109 PNPT1 poliribonucleótido nucleotidiltransferase 1 2 02 08 6_at NM_0024 62 MX1 Resistência a myxovirus 1, proteína induzível por interferão p78 2 3527 6_at NM_001002264 EPSTI1 interacção estromal epitelial 1 (breast) 219209_at NM_022168 IFIH1 interferão indiuzido com helicase C domínio 1 209593_s_at NM_014506 TOR1B família torsina 1, membro B (torsina B) 228230_at NM_033405 PPARAIC2 85 complexo A de receptor activado por proliferador peroxissomal 2 218986_s_at NM_017631 FLJ20035 proteína hipotética FLJ20035 228531_at NM_017654 SAMD9 domínio de motivo alfa estéril que contém 9 2 02 8 6 9_at NM_001032409 OAS1 2',5'-oligoadenilato sintetase l,40/46kDa 212657_s_at NM_000577 IL1RN antagonista de receptor de interleucina 1 2 02 68 7_s_at NM_003810 TNFSF10 superfamília do factor de necrose tumoral (ligando), membro 10 239979_at NM_001002264 EPSTI1 interacção estromal epitelial 1 (breast) 2 42 02 0_s_at NM_030776 ZBP1 Proteína de ligação Z-D 1 222793_at NM_014314 DDX58 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polipéptido 58 227807_at NM_031458 PARP9 Família de poli (ADP-ribose) polimerase, membro 9 86 ΕΡ2327792Β1 200986_at NM_000062 SERPING1 inibidor de serina (ou cisteína) proteinase, clade G, membro 223501_at NM_006573 TNFSF13B superfamília do factor de necrose tumoral (ligando), membro 13b 223502_s_at NM_006573 TNFSF13B superfamília do factor de necrose tumoral (ligando), membro 13b 217502_at NM_001547 IFIT2 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 204994_at NM_0024 63 MX2 Resistência a Myxovirus 2 2 02 8 63_at NM_003113 HMG1L3 proteína de grupo de alta mobilidade 1-similar 3 2 2 8 4 3 9_at NM_138456 BATF2 factor de transcrição em zíper de leucina básica, ATF-like 2 218 08 5_at NM_016410 CHMP5 proteína de modificação de cromatina 5 219691_at NM_017654 SAMD9 domínio de motivo alfa estéril que contém 9 4 4 67 3_at NM_02 30 68 SN sialoadesina 219519_s_at NM_02 30 68 SN sialoadesina 206133_at NM_017523 XIAPAF1 Factor associado a XIAP-1, variante de transcripto 1 202430_s_at NM_021105 PLSCR1 Fosfolípido escramblase 243271_at NM_152 7 03 SAMD9L domínio de motivo estéril alfa que contém 9-similar 205098_at NM_001295 CCR1 quimiocina (Motivo C-C) receptor 1 87 ΕΡ2327792Β1 231577_s_at NM_002053 GBP1 proteína de ligação a guanilato 1, interferão-induzível, 67kDa 2 02 2 6 9_x_at NM_002053 GBP1 proteína de ligação a guanilato 1, interferão-induzível, 67kDa 241916_at NM_021105 PLSCR1 Fosfolípido escramblase 1 205099_s_at NM_001295 CCR1 quimiocina (Motivo C-C) receptor 1 202270_at NM_002053 GBP1 proteína de ligação a guanilato 1, interferão-induzível, 67kDa

Quadro 4. Identificadores de bases de dados única e símbolos correspondendo a genes únicos dentro da lista de genes em Quadro 3.

Acesso a base de dados Símbolo NM_080657 RSAD2 NM_2 0 7 315 LOC12 9607 NM_0 0 6417 IFI44 NM_001002264 EPSTI1 NM_152 7 03 SAMD9L NM_006187 OAS 3 NM_016323 HERC5 NM_006820 IFI44L NM_017523 XIAPAF1 NM_012420 IFIT5 NM_001032731 OAS 2 NM_005101 G1P2 NM_017414 USP18 NM_031458 PARP9 NM_003733 OASL NM_001031683 IFIT3 NM_014314 DDX58 NM_001001887 IFIT1 NM_001032409 OAS 1 NM_017554 PARP14 NM_001572 IRF7 NM_017742 ZCCHC2 NM_002346 LY6E NM_005533 IFI35 NM_015535 DPTP6 88 ΕΡ2327792Β1 NM_016410 CHMP5 NM_001013000 HERC6 NM_022750 PARP12 NM_001547 IFIT2 NM_021105 PLSCR1 NM_022147 TMEM7 NM_030776 ZBP1 NM_033109 PNPT1 NM_0024 62 MX1 NM_022168 IFIH1 NM_014506 TOR1B NM_033405 PPARAIC2 8 5 NM_017631 FLJ20035 NM_017654 SAMD9 NM_000577 IL1RN NM_003810 TNFSF10 NM_000062 SERPING1 NM_006573 TNFSF13B NM_0024 63 MX2 NM_003113 HMG1L3 NM_138456 BATF2 NM_02 30 68 SN NM_001295 CCR1 NM_002053 GBP1

Quadro 5. Identificadores de bases de dados única e símbolos correspondendo à lista de genes em Quadro 4, mas com genes de Quadro 1 removido.

Acesso a base de dados Símbolo NM_017523 XIAPAF1 NM_001032731 OAS2 NM_017414 USP18 NM_003733 OASL NM_001032409 OAS1 NM_017554 PARP14 NM_017742 ZCCHC2 NM_0 02 34 6 LY6E NM_005533 IFI35 NM_015535 DPTP6 NM 001013000 HERC6 89 ΕΡ2327792Β1 NM_022750 PARP12 NM_001547 IFIT2 NM_022147 TMEM7 NM_030776 ZBP1 NM_033109 PNPT1 NM_022168 IFIH1 NM_014506 TOR1B NM_033405 PPARAIC2 8 5 NM_017631 FLJ20035 NM_017654 SAMD9 NM_000577 IL1RN NM_003810 TNFSF10 NM_000062 SERPING1 NM_006573 TNFSF13B NM_0024 63 MX2 NM_003113 HMG1L3 NM_138456 BATF2 NM_02 30 68 SN NM_001295 CCR1 NM 002053 GBP1

Quadro 6. Identificadores de bases de dados única e nomes de combinação de genes dos quadros anteriores.

Acesso a base de dados Nome NM_2 0 7 315 (TYKI) similar a membro induzivel do LPS da família de timidilato cinase NM_031458 (PARP9) Gene de linfoma B agressivo NM_016323 (HERC5) proteína de ligação a ciclina-E 1 (LOC51191) NM_080657 (RSAD2) Cig5 NM_0 0 4 02 9 (IRF7) Factor regulador de interferão 7 (IRF7) 90 ΕΡ2327792Β1 NM_001549 (IFIT3) Proteína de tetratricopéptido induzida por interferão IFI60 (IFIT4) ΝΜ_0024 62 (ΜΧ1) Resistência a influenza por Myxovirus 1 BG283489 (PRKR) FLJ38348 ΝΜ_001002264 (EPSTI1) Proteína de interacção estromar epitelial de mama putativo ΝΜ_005101 (G1P2) Proteína estimulada por Interferão (15 kDa) ΝΜ_014314 (DDX58) AF 0 3 8 9 6 3 ΝΜ_021105 (PLSCR1) Fosfolípido escramblase P37 ΝΜ_006417 (IFI44) "Ag. microtubular associado a hepatite C induzida por interferão ΝΜ_016410 (SNF7DC2) Proteína de modificação de cromatina 5 ΝΜ_012420 (IFIT5) Proteína induzível por ácido retinóico e interferão (58kD) ΝΜ_00 682 0 (IFI44L) quadro de leitura aberta 1 de cromossomo 29 ΝΜ_006187 (OAS3) 2'-5'-oligoadenilato sintetase 3 ΝΜ_004509 (SP110) Co-activador transcricional SpllO ΝΜ_152703 (C7orf6) domínio de motivo estéril alfa que contém 9-similar ΝΜ_005531 (IFI16) clone MGC:23885 IMAGE:4703266, ARNm, complete cds ΝΜ_0 01001887 (IFIT1) Proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 1 ΝΜ_017523 Factor associado a XIAP-1, variante de transcripto 1 ΝΜ_001032731 2'-5'-oligoadenilato sintetase 2,69/71kDa ΝΜ_017414 ubiquitina específico protease 18 ΝΜ_0 037 33 2'-5'-oligoadenilato sintetase-like ΝΜ_001032409 2', 5'-oligoadenilato sintetase l,40/46kDa ΝΜ_017554 poli (ADP-ribose) polimerase família, membro 14 91 ΕΡ2327792Β1 NM_017742 dedo de zinco, CCHC domínio que contém 2 NM_002346 complexo 6 de linfócito antigénio, locus E ΝΜ_005533 proteína induzida por interferão 35 ΝΜ_015535 proteína D polimerase-transactivada 6 ΝΜ_001013000 domínio hect e RLD 6 ΝΜ_022750 poli (ADP-ribose) polimerase família, membro 12 ΝΜ_001547 proteína induzida por interferão com repetições de tetratricopéptido 2 ΝΜ_022147 transmembrana proteína 7 ΝΜ_030776 Proteína de ligação Z-D 1 ΝΜ_033109 poliribonucleótido nucleotidiltransferase 1 ΝΜ_022168 interferão induzido com helicase C domínio 1 ΝΜ_014506 família torsina 1, membro B (torsina B) ΝΜ_033405 complexo A de receptor activado por proliferador peroxissomal 285 ΝΜ_017631 proteína hipotética FLJ20035 ΝΜ_017654 domínio de motivo alfa estéril que contém 9 ΝΜ_000577 antagonista de receptor de interleucina 1 ΝΜ_003810 superfamília do factor de necrose tumoral (ligando), membro 10 ΝΜ_000062 inibidor de serina (ou cisteína) proteinase, clade G, membro 1 ΝΜ_006573 superfamília do factor de necrose tumoral (ligando), membro 13b ΝΜ_0024 63 Resistência a Myxovirus 2 ΝΜ_003113 proteína de grupo de alta mobilidade 1-similar 3 ΝΜ_138456 factor de transcrição em zíper de leucina básica, ATF-like 2 92 ΕΡ2327792Β1 ΕΡ2327792Β1 NM_02 30 68 sialoadesina NM_001295 quimiocina (Motivo C-C) receptor 1 NM_002053 proteína de ligação a guanilato 1, interferão-induzível, 67kDa

Quadro 7(i) Subconjunto de conjuntos de sondas do Quadro 3. 214453_s_at 204 972_at

Quadro 7 (ii) Subconjunto de conjuntos de sondas do Quadro 3.

Quadro 7 (iii) Subconjunto de conjuntos de sondas do Quadro 3.

93 ΕΡ2327792Β1 214 05 9_at 2184 0 0_at 226603 at 2198 6 3_at 20443 9_at 228617 at 2035 9 6_s_at 204972 at 205483 s at 219211_at 223220 s at 20566 0_at 20474 7_at 218943_s_at 203153 at 205552 s_at 224701 at 2 0 84 3 6_s_at

Declarações 1. Um método que compreende determinar se um indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que presença de dita célula indica que o indivíduo tem um distúrbio auto-imune. 2. Um método de predição de receptividade de um indivíduo a 94 ΕΡ2327792Β1 terapêutica de doença auto-imune, o dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que presença de dita célula indica que o indivíduo responderia à terapêutica da doença auto-imune. 3. Um método para a monitorização de doença residual mínima num indivíduo tratado para uma doença auto-imune, o dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula é indicativa de presença de doença residual mínima auto-imune. 4. Um método para a detecção de um estado patológico auto-imune num indivíduo, o dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1,2, 3,4, 5, 6 ou 7 num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula é indicativa de presença de um estado patológico auto-imune no indivíduo. 5. Um método para a avaliação de predisposição de um indivíduo para desenvolver um distúrbio auto-imune, o dito 95 ΕΡ2327792Β1 método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula é indicativa de uma predisposição para o indivíduo desenvolver o distúrbio auto-imune. 6. Um método para o diagnóstico de um distúrbio auto-imune num indivíduo, o dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula indica que o indivíduo tem o dito distúrbio auto-imune . 7. 0 método de qualquer dos anteriores em que (a) os genes são seleccionados a partir dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) no Quadro 2, em que os genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) no Quadro 2 compreendem um subgrupo dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, ou (b) os genes são seleccionados a partir dos genes associados aos conjuntos de sondas no Quadro 7(i) , (ii) ou (iii) . 8. Um conjunto de arranjo/chip de gene/gene que compreende polinucleótidos capaz de hibridizar especificamente com pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de 96 ΕΡ2327792Β1 sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. 9. Um kit que compreende o conjunto de arranjo/chip de gene/gene de 8, e instruções para utilizar o conjunto de arranjo/chip de gene/gene para detectar um distúrbio auto-imune pela determinação de se a expressão de pelo menos 2 dos genes (ou genes associados a conjuntos de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 está num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal. 10. Um método de identificar um valor métrico correlacionado com presença e/ou extensão de um distúrbio auto-imune num indivíduo ou amostra, o dito método compreende: (a) estimar um grupo de conjuntos de sondas que esteja colectivamente associado a um padrão em que a expressão de genes representada pelos conjuntos de sondas está associada a uma doença característica; (b) gerar um factor de ponderação que pondera conjuntos de sondas de acordo com uma escala que reflecte a extensão de correspondência de cada conjunto individual de sondas à tendência do grupo de conjuntos de sondas, e calcular o coeficiente de correlação de cada perfil do conjunto de sondas ao perfil médio calculado; (c) determinar um factor de escalonamento, em que o factor de escalonamento é o valor requerido para escalonar conjuntos individuais de sondas até 1; 97 ΕΡ2327792Β1 (d) multiplicar o factor de escalonamento pelo factor de ponderação para gerar um factor composto (e) multiplicar assinaturas de uma amostra de sangue normal com o factor composto, e calcular a média dos valores resultantes através de ambos os conjuntos de sondas e amostras para gerar um valor médio, e inverter o valor médio para produzir um factor de escalonamento global; (f) multiplicar cada factor de ponderação pelo factor de escalonamento global para obter um vector de valores de escalonamento, e multiplicar os valores de escalonamento por uma assinatura de expressão de uma amostra de interesse, e calcular a média dos valores resultantes para produzir uma métrica individual que é indicativo de grau de expressão génica associado a interferões de Tipo I na amostra. 11. 0 método de 10, em que na etapa (a), o grupo de conjuntos de sondas compreende conjuntos de sondas que incluem, ou agrupam ao redor, o par correlacionado mais proximamente do núcleo de conjuntos de sondas em subagrupamento associado a uma doença característica. 12. O método de 10 ou 11, em que na etapa (b), o factor é gerado pela transformação de dados de expressão do grupo de conjuntos de sondas em pontuações z que compreende escalonamento médio até 1, transformação de base-2 log, então escalonamento a um desvio padrão da média de 1. 98 ΕΡ2327792Β1 13. 0 método de 10, 11 ou 12, em que na etapa (e), o factor de escalonamento global é útil para transformar resultado da média de conjuntos de sondas de uma amostra de interesse numa métrica, em que a métrica é 1 se a amostra for de um indivíduo normal, saudável. 14. O método de qualquer de 10-13, em que o grupo de conjuntos de sondas compreende pelo menos 2 daqueles listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. 15. O método de qualquer de 10-14, em que o grupo de conjuntos de sondas compreende aqueles listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 2004033498 A [0006] • WO 03090694 A [0006] • US 4816567 A [0062] • US 4275149 A [0102] [0104] • US 4737456 A [0102] • US 4318980 A [0104] 99 ΕΡ2327792Β1 us 4016043 A [0109] us 4424279 A [0109] us 4018653 A [0109] wo 0175166 A [0118] us 5700637 A [0118] us 5445934 A [0118] us 5807522 A [0118] us 4657760 A [0126] us 5206344 A [0126] us 5225212 A [0126]

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Lisboa, 14 de Novembro de 2013 102

Claims (5)

1. ΕΡ2327792Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método sistémico num determinar se expressa: eritematoso compreende célula que para o diagnóstico de lúpus indivíduo, dito método que o indivíduo compreende uma (i) TYKI e pelo menos um outro gene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, ou (ii) HERC5 e pelo menos um outro gene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula indica que o indivíduo tem lúpus eritematoso sistémico.
2. 2. Um método de predição de receptividade de um indivíduo a um inibidor de interferão do tipo I, dito método que compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa: (i) TYKI e pelo menos um outro gene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, ou (ii) HERC5 e pelo menos um outro gene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de 1 ΕΡ2327792Β1 referência normal, em que presença de dita célula indica que o indivíduo seria receptivo ao inibidor de interferão do tipo I.
3. 3. Um método para a avaliação de predisposição de um indivíduo desenvolver lúpus eritematoso sistémico, dito método que compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa: (i) TYKI e pelo menos um outro qene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, ou (ii) HERC5 e pelo menos um outro gene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, num nível superior ao nível de expressão dos respectivos genes numa amostra de referência normal, em que a detecção de dita célula é indicativa de uma predisposição para o indivíduo desenvolver lúpus eritematoso sistémico.
4. 4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o método compreende a utilização de um conjunto de arranjo/chip de gene/gene que compreende polinucleótidos capaz de especificamente hibridizar a: (i) TYKI e pelo menos um outro gene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, ou (ii) HERC5 e pelo menos um outro gene (ou gene associado a conjunto de sondas) listados nos Quadros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, 2 ΕΡ2327792Β1 em que o conjunto de arranjo/chip de gene/gene é útil para a detecção de lúpus eritematoso sistémico num indivíduo.
5. 5. 0 método de qualquer das reivindicações 1-4, em que dito método compreende determinar se o indivíduo compreende uma célula que expressa pelo menos 3 dos genes listados nos Quadros 1 ou 2. Lisboa, 14 de Novembro de 2013 3