CN110583573B - 一种血虚小鼠模型的构建及评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于模型的评价方法技术领域，具体为一种血虚小鼠的模型构建方法及评价方法。主要解决现有血虚模型的评价方法存在精确性低、专属性差的技术问题。本发明采用代谢组学技术，分析空白对照组与模型组小鼠脾脏中内源性代谢产物的变化，通过CD软件对所有质谱谱图进行处理得到积分数据，并结合15个生物标志物的含量统计学分析空白对照组与模型组小鼠脾脏中的生物标志物的积分均值变化趋势，得出血虚小鼠脾脏代谢物含量的变化趋势，从而针对性的评价血虚小鼠的模型。本发明体现出模型复制的合理性和科学性，系统综合的表现出空白对照组与模型组小鼠机体轮廓，具有全面系统、高效、特异性强的优点，为新药研发和药理研究提供可靠的评价方法。
Description
技术领域
本发明属于模型的构建及评价方法技术领域，具体涉及一种血虚小鼠模型的构建及评价方法。
背景技术
血虚是中医临床常见证候，是指机体血液不足、营养功能低下，致使脏腑组织濡养不足的病理状态。传统中医认为血虚形成的原因主要包括失血过多，或久病阴血虚耗，或脾胃功能失常，水谷精微不能化生血液等。
现代药理学研究中，常采用放血、化学性损伤、放射性损伤等手段建立血虚证动物模型。目前判断血虚模型复制成功与否主要是根据血常规指标、脏器指数、股骨病理切片等指标。多数研究人员也会检测骨髓有核细胞、网织红细胞等相关造血功能指标。
但在长期以往的实验研究中，血虚模型评价仍存在以下不足之处。(1)主观性：股骨组织形态直接观察指标包括造血细胞的松散度、红细胞和巨噬细胞的含量等，这种评价方法主要是主观人为评价，存在很大的主观性和不确定性。(2)片面性：通过血虚相关造血功能指标评价模型存在一定的片面性，只能反映个别器官或组织的状态和生化功能，缺乏整体的，系统的评价标准。(3)专属性差：几乎所有血虚疾病包括心血虚、肝血虚等血虚病症的红细胞(RBC)和白细胞(WBC)指标均发生改变，不具备专属性。
发明内容
为了解决现有血虚模型的评价方法精确性低、专属性差的技术问题，本发明提供一种血虚小鼠模型的评价方法。
为解决本发明的技术问题，所采用的技术方案为：
一种血虚小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：第一天对小鼠皮下注射20mg/kg的乙酰苯肼，第四天早上对小鼠皮下注射10mg/kg的乙酰苯肼，两个小时之后对小鼠腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺，第四天到第七天对小鼠腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺，即获得血虚小鼠模型。与其他方法相比，该方法用小鼠构建血虚模型，操作简单、成本低廉、周期短、成功率高、病理改变稳定，可重复性强，具备突出的实质性特点，与临床血虚病症更为一致。
一种血虚小鼠模型的评价方法，包括以下步骤：通过空白对照组与模型组小鼠脾脏中内源性代谢产物的变化来评价。机体免疫失衡是血虚症发生的重要病因之一。脾脏作为血虚小鼠免疫系统紊乱的靶器官，更可以直接反映血虚疾病的生物功能紊乱。尤其是针对内源性代谢物的变化，更可以灵敏地揭示血虚小鼠的机体状态。
进一步地，所述的空白对照组小鼠，具体构建方法为：第一天对小鼠皮下注射20mg/kg的无菌水，第四天早上对小鼠皮下注射10mg/kg的无菌水，两个小时之后对小鼠腹腔注射20mg/kg的无菌水，第四天到第七天对小鼠腹腔注射20mg/kg的无菌水，即获得空白对照组小鼠模型。平行采用无菌水灌胃实验小鼠，有利于模拟与血虚小鼠复制的细节，克服灌胃行为对机体的干扰，能更加准备地进行与模型小鼠的差异比较。
进一步地，具体评价方法为：在小鼠模型构建完成后，收集的空白对照组与模型组小鼠的脾脏分别进行质谱分析，得出空白对照组与模型组小鼠的质谱谱图；分析空白对照组与模型组小鼠机体脾脏中内源性代谢产物的变化，使用Compound Discover软件对所有的质谱谱图进行处理得到积分数据，然后对空白对照组与模型组小鼠的质谱谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出小鼠模型的轮廓图；对小鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出小鼠模型的轮廓动态变化趋势图；进而采用主成分分析法，即PCA，对数据进行模式识别，得出生物标志物的含量变化，结合小鼠模型的动态轮廓变化趋势图和生物标志物的含量统计学分析，评价血虚小鼠模型是否构建成功。在代谢组学研究中，核磁共振(NMR)和质谱(MS)是代谢组学研究中应用最为广泛的两种分析技术。其中，质谱技术(MS)凭借其高灵敏度、高选择性等优点能更加广泛全面地表征血虚小鼠的代谢轮廓，更加准确评价模型的复制情况，具有高效、快速、准确性高等优点。
进一步地，所述的生物标志物为15个，分别为：4-Indolecarbaldehyde、Acetyl-L-carnitine、Azelnidipine、Cytarabine、Cytidine 5'-monophosphate(hydrate)、Cytosine、Deoxyadenosine monophosphate、L-Tryptophan、L-Glutathione oxidized、N(6)-Methyladenosine、N-Acetyl-D-galactosamine 4-sulfate、N-Acetyl-L-glutamicacid、Uracil、Uric acid和Xanthosine。这些指标的变化，能整体系统地评价血虚模型的成功性，克服了其他血虚相关评价指标的片面性。
进一步地，所述15个生物标志物获取的具体方法为：首先分析得出的空白对照组与模型组的PCA图；然后，观察PCA图，空白对照组与模型组能够显著分开，表明血虚小鼠模型造模成功；在PCA的基础上，利用正交偏最小二乘-判别分析法对正常对照组和模型组小鼠脾脏进一步分析，得到与正常对模型组小鼠脾脏轮廓图，通过载荷图对变量加载结果进行描述，利用变量重要性分析，S-plot相关性＞0.58并结合统计学p＜0.05获得潜在的生物标志物，从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，然后对空白对照组与模型组小鼠脾脏进行质谱分析得出质谱图谱进行积分，得出15个生物标志物的含量变化。
与单维筛选方法比较，PCA和OPLS-DA多元统计分析方法可以筛选去除很多干扰，获得与血虚症直接相关的差异变量(生物标志物)。此外，生物机体内代谢物彼此关联,相应的变量之间也存在相互联系,有些变量甚至只有和其他变量结合在一起时才具有统计学意义或生物学意义,多维统计方法正好能够捕捉到这些单维分析认为没有意义的变量。
进一步地，所述的15个生物标志物的含量变化为：
Acetyl-L-carnitine的积分面积均数从正常鼠的80830893.2±14688120下降到76088592.1±7124082.7，p＜0.01；
Azelnidipine的积分面积均数从正常鼠的857230.3±125275.7下降到560366.4±183125.3，p＜0.001；
Cytarabine的积分面积均数从正常鼠的25652096.6±6572296.2下降到22709443.8±2330271.1，p＜0.05；
Cytidine 5'-monophosphate(hydrate)的积分面积均数从正常鼠的6677870±1286108.5下降到5096042.5±1493492.0；p＜0.05；
Cytosine的积分面积均数从正常鼠的30070366.4±6107532.8下降到22781514.4±8831677.4；p＜0.001；
N-Acetyl-D-galactosamine 4-sulfate的积分面积均数从正常鼠的1244567.9±240259.7下降到961032.2±154902.3；p＜0.05；
Uracil的积分面积均数从正常鼠的4052967.8±837815.1下降到3361426.7±1105663.8；p＜0.05；
4-Indolecarbaldehyde的积分面积均数从正常鼠的2783004.9±522536.7上升到4618384.9±447059.6，p＜0.001；
Deoxyadenosine monophosphate的积分面积均数从正常鼠的2065619.8±863159.5上升到5454850.7±1241369.2，p＜0.001；
L-Tryptophan的积分面积均数从正常鼠的27948400.4±6023854.6上升到40916209.2±4198142.2，p＜0.001；
L-Glutathione oxidized的积分面积均数从正常鼠的23877892.8±23631027上升到55890783.9±18901060.3；p＜0.05；
N(6)-Methyladenosine的积分面积均数从正常鼠的1418739.8±376657.3上升到1768678.7±322331.1；p＜0.05；
N-Acetyl-L-glutamic acid的积分面积均数从正常鼠的530155.5±213737.4上升到1526306.7±369684.7；p＜0.001；
Uric acid的积分面积均数从正常鼠的7654224.6±2633236.6上升到16682826.5±6246385.1；p＜0.05；
Xanthosine的积分面积均数从正常鼠的1228613.3±227431上升到2004903.7±435123.4；p＜0.001。
血虚小鼠机体的病变会导致其内源性代谢轮廓的异常，进而引发相应代谢物含量的变化。这些代谢物在空白对照组和模型组之间的显著性变化，可整体评价小鼠从正常状态向血虚状态的转变。
本发明应用上述技术方案，采用代谢组学的技术，通过分析空白对照组与模型组小鼠脾脏中内源性代谢产物的变化，获得代谢轮廓图谱。同时，使用Compound Discover(CD)软件对所有的质谱谱图进行处理得到积分数据，并结合15个生物标志物的含量统计学分析，发现空白对照组与模型组小鼠脾脏中的15个生物标志物积分均值的变化一定程度上反应了血虚小鼠脾脏代谢物含量的变化趋势，从而针对性地评价血虚的模型。代谢产物处于生物机体中的终端，上游基因和蛋白质的微小变化都会在代谢物上得到放大，因而代谢产物可更加灵敏地表征生命现象，能忠实反应外界干预对机体代谢网络调控过程的微观变化。且迄今为止，未见代谢组学方法用于血虚模型的评价。
相对于现有技术，本发明能够取得的有益效果为：该方法较以往的模型评价相比更加全面、综合系统的体现出空白对照组与模型组小鼠机体的动态轮廓，也体现出模型复制的合理性和科学性，可以为新药研发和药理研究提供一种可靠的血虚模型的评价方法，具有高效、快速、特异性强的优点。
附图说明
图1为本发明实施例的空白对照组与模型组小鼠脾脏质谱代谢物指纹谱图；
图2为本发明实施例的空白对照组与模型组的主成分分析法得分图；
图3为本发明实施例的空白对照组与模型组的正交偏最小二乘-判别分析法得分图；
图4为本发明实施例的空白对照组与模型组的正交偏最小二乘-判别分析法载荷图；
图5至图6为本发明实施例的空白对照组与模型组小鼠股骨组织病理图。
具体实施方式
以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。需要说明的是，只要不构成冲突，本发明中的实施例以及实施例中的各个特征可以相互结合，所形成的技术方案均在本发明的保护范围之内。
本实施例中一种血虚小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
第一天对小鼠皮下注射20mg/kg的乙酰苯肼，第四天早上对小鼠皮下注射10mg/kg的乙酰苯肼，两个小时之后对小鼠腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺，第四天到第七天对小鼠腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺，即获得血虚小鼠模型。
本实施例中一种血虚小鼠模型的评价方法，包括以下步骤：
(1)应用多元统计分析方法对代谢轮廓进行表征，采用主成分分析法对数据进行模式识别，考察各组数据轮廓的分离情况。具体方法是在小鼠模型构建完成后，收集空白对照组与模型组小鼠的脾脏分别进行质谱分析，得出空白对照组与模型组小鼠的质谱谱图；然后对空白对照组与模型组小鼠的质谱谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出空白对照组与模型组小鼠的轮廓图；如图1(横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和第二主成分。C：空白对照组；M：模型组)所示：模型组偏离正常对照组，模型复制第7天时显著分离，说明在第7天代谢调控网络发生显著变化，证明血虚模型复制成功。通过空白对照组与模型组小鼠机体脾脏中内源性代谢产物的变化来评价。
(2)所述的空白对照组小鼠，具体构建方法为：第一天对小鼠皮下注射20mg/kg的无菌水，第四天早上对小鼠皮下注射10mg/kg的无菌水，两个小时之后对小鼠腹腔注射20mg/kg的无菌水，第四天到第七天对小鼠腹腔注射20mg/kg的无菌水，即获得空白对照组小鼠模型。
(3)在PCA的基础上，利用正交偏最小二乘-判别分析法对空白对照组和模型组小鼠脾脏进一步分析，得到空白对照组和模型组小鼠脾脏轮廓图，结果见图2(横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和第二主成分)。从图2可以看出两组在主成分一轴上的分离效果明显。接着通过载荷图对变量加载的结果进行描述，载荷图见图3：(横坐标及纵坐标表征第一主成分和相关性系数，系数越大，对分组贡献越大)。利用变量重要性(VIP)分析，S-plot相关性＞0.58的绝对值并结合统计学p＜0.05获得潜在的生物标志物，从空白对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，这些变量涉及到的代谢通路有可能导致血虚模型的形成。15个生物标志物为：4-Indolecarbaldehyde、Acetyl-L-carnitine、Azelnidipine、Cytarabine、Cytidine 5'-monophosphate(hydrate)、Cytosine、Deoxyadenosinemonophosphate、L-Tryptophan、L-Glutathione oxidized、N(6)-Methyladenosine、N-Acetyl-D-galactosamine 4-sulfate、N-Acetyl-L-glutamic acid、Uracil、Uric acid和Xanthosine。
(4)分析步骤(3)得出15个生物标志物的含量变化，与空白对照组小鼠相比，在模型构建第8天时的15个生物标志物的含量变化如下：
模型小鼠脾脏中acetyl-L-carnitine、azelnidipine、cytarabine、cytidine 5'-monophosphate(hydrate)、cytosine、N-acetyl-D-galactosamine4-sulfate和uracil含量显著下降，具体含量变化如下：
Acetyl-L-carnitine的积分面积均数从正常鼠的80830893.2±14688120下降到76088592.1±7124082.7，p＜0.01；
Azelnidipine的积分面积均数从正常鼠的857230.3±125275.7下降到560366.4±183125.3，p＜0.001；
Cytarabine的积分面积均数从正常鼠的25652096.6±6572296.2下降到22709443.8±2330271.1，p＜0.05；
Cytidine 5'-monophosphate(hydrate)的积分面积均数从正常鼠的6677870±1286108.5下降到5096042.5±1493492.0；p＜0.05；
Cytosine的积分面积均数从正常鼠的30070366.4±6107532.8下降到22781514.4±8831677.4；p＜0.001；
N-Acetyl-D-galactosamine 4-sulfate的积分面积均数从正常鼠的1244567.9±240259.7下降到961032.2±154902.3；p＜0.05；
Uracil的积分面积均数从正常鼠的4052967.8±837815.1下降到3361426.7±1105663.8；p＜0.05；
模型小鼠脾脏中4-Indolecarbaldehyde、Deoxyadenosine monophosphate、L-Tryptophan、L-Glutathione oxidized、N(6)-Methyladenosine、N-Acetyl-L-glutamicacid、Uric acid和Xanthosine含量显著上调，具体含量变化如下：
4-Indolecarbaldehyde的积分面积均数从正常鼠的2783004.9±522536.7上升到4618384.9±447059.6，p＜0.001；
Deoxyadenosine monophosphate的积分面积均数从正常鼠的2065619.8±863159.5上升到5454850.7±1241369.2，p＜0.001；
L-Tryptophan的积分面积均数从正常鼠的27948400.4±6023854.6上升到40916209.2±4198142.2，p＜0.001；
L-Glutathione oxidized的积分面积均数从正常鼠的23877892.8±23631027上升到55890783.9±18901060.3；p＜0.05；
N(6)-Methyladenosine的积分面积均数从正常鼠的1418739.8±376657.3上升到1768678.7±322331.1；p＜0.05；
N-Acetyl-L-glutamic acid的积分面积均数从正常鼠的530155.5±213737.4上升到1526306.7±369684.7；p＜0.001；
Uric acid的积分面积均数从正常鼠的7654224.6±2633236.6上升到16682826.5±6246385.1；p＜0.05；
Xanthosine的积分面积均数从正常鼠的1228613.3±227431上升到2004903.7±435123.4；p＜0.001；
综合以上，若符合在第7天的空白对照组与模型组小鼠内源性代谢轮廓出现显著分离，且15个代谢物积分数据满足上述范围，则表明血虚小鼠模型造模成功。
为表明本发明的优点，分别采用空白对照组与模型组小鼠血常规、脾脏指数与胸腺指数、股骨病理切片变化评价血虚小鼠模型的方法(结果见表1、表2、图5和图6)和本发明所述方法评价血虚模型的方法(结果见图1、图2、图3和图4)。
表1 空白对照组与模型组小鼠的血常规变化情况(Means±SD)
“*”代表与空白对照组相比，**p<0.5
利用空白对照组与模型组小鼠血常规定量的变化评价模型的可靠性。结果表明，与空白对照组相比，在实验的第七天，模型组小鼠白细胞、红细胞、血小板含量与空白对照组具有显著性差异，结果表明血虚小鼠模型造模成功。
表2 空白对照组与模型组小鼠的脾脏指数与胸腺指数变化情况(Means±SD)
“*”代表与空白对照组相比，**p<0.01，***p<0.001
利用空白对照组与模型组小鼠脾脏指数与胸腺指数的变化评价模型的可靠性。结果表明，与空白对照组相比，模型组脾脏指数值显著升高；胸腺指数值显著下降，结果表明血虚小鼠模型造模成功。
通过对比可知，采用本发明所述评价方法能更加全面系统的评价小鼠血虚模型，具有灵敏、高效、快速、特异性强的优点。
Claims (4)
1.一种血虚小鼠模型的评价方法，其特征在于：通过空白对照组与模型组小鼠机体脾脏中内源性代谢产物的变化来评价，具体为：在小鼠模型构建完成后，收集空白对照组小鼠与模型组小鼠的脾脏分别进行质谱分析，得出空白对照组与模型组小鼠的质谱谱图；分析空白对照组小鼠与模型组小鼠机体脾脏中内源性代谢产物的变化，使用CompoundDiscover软件对所有的质谱谱图进行处理得到积分数据，然后对空白对照组与模型组小鼠的质谱谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出小鼠模型的轮廓图；对小鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出小鼠模型的轮廓动态变化趋势图；进而采用主成分分析法对数据进行模式识别，得出生物标志物的含量变化，结合小鼠模型的动态轮廓变化趋势图和生物标志物的含量统计学分析，评价血虚小鼠模型是否构建成功；
所述的生物标志物为15个，分别为：4-Indolecarbaldehyde、Acetyl-L-carnitine、Azelnidipine、Cytarabine、Cytidine 5'-monophosphate(hydrate)、Cytosine、Deoxyadenosine monophosphate、L-Tryptophan、L-Glutathione oxidized、N(6)-Methyladenosine、N-Acetyl-D-galactosamine 4-sulfate、N-Acetyl-L-glutamic acid、Uracil、Uric acid和Xanthosine。
2.根据权利要求1所述的一种血虚小鼠模型的评价方法，其特征存在于：所述15个生物标志物获取的具体方法为：首先分析得出的空白对照组与模型组的主成分分析法图，即PCA图；然后，观察PCA图，空白对照组与模型组能够显著分开，表明血虚小鼠模型造模成功；在PCA的基础上，利用正交偏最小二乘-判别分析法对正常对照组和模型组小鼠脾脏进一步分析，得到与正常对模型组小鼠脾脏轮廓图，通过载荷图对变量加载结果进行描述，利用变量重要性分析，S-plot相关性＞0.58并结合统计学p＜0.05获得潜在的生物标志物，从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，然后对空白对照组与模型组小鼠脾脏进行质谱分析得出质谱图谱进行积分，得出15个生物标志物的含量变化。
3.根据权利要求1所述的一种血虚小鼠模型的评价方法，其特征存在于：所述的空白对照组小鼠，具体构建方法为：第一天对小鼠皮下注射20mg/kg的无菌水，第四天早上对小鼠皮下注射10mg/kg的无菌水，两个小时之后对小鼠腹腔注射20mg/kg的无菌水，第四天到第七天对小鼠腹腔注射20mg/kg的无菌水，即获得空白对照组小鼠模型。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种血虚小鼠模型的评价方法，其特征在于：所述的15个生物标志物的含量变化为：
Acetyl-L-carnitine的积分面积均数从正常鼠的80830893.2±14688120下降到76088592.1±7124082.7，p＜0.01；
Azelnidipine的积分面积均数从正常鼠的857230.3±125275.7下降到560366.4±183125.3，p＜0.001；
Cytarabine的积分面积均数从正常鼠的25652096.6±6572296.2下降到22709443.8±2330271.1，p＜0.05；
Cytidine 5'-monophosphate(hydrate)的积分面积均数从正常鼠的6677870±1286108.5下降到5096042.5±1493492.0；p＜0.05；
Cytosine的积分面积均数从正常鼠的30070366.4±6107532.8下降到22781514.4±8831677.4；p＜0.001；
N-Acetyl-D-galactosamine 4-sulfate的积分面积均数从正常鼠的1244567.9±240259.7下降到961032.2±154902.3；p＜0.05；
Uracil的积分面积均数从正常鼠的4052967.8±837815.1下降到3361426.7±1105663.8；p＜0.05；
4-Indolecarbaldehyde的积分面积均数从正常鼠的2783004.9±522536.7上升到4618384.9±447059.6，p＜0.001；
Deoxyadenosine monophosphate的积分面积均数从正常鼠的2065619.8±863159.5上升到5454850.7±1241369.2，p＜0.001；
L-Tryptophan的积分面积均数从正常鼠的27948400.4±6023854.6上升到40916209.2±4198142.2，p＜0.001；
L-Glutathione oxidized的积分面积均数从正常鼠的23877892.8±23631027上升到55890783.9±18901060.3；p＜0.05；
N(6)-Methyladenosine的积分面积均数从正常鼠的1418739.8±376657.3上升到1768678.7±322331.1；p＜0.05；
N-Acetyl-L-glutamic acid的积分面积均数从正常鼠的530155.5±213737.4上升到1526306.7±369684.7；p＜0.001；
Uric acid的积分面积均数从正常鼠的7654224.6±2633236.6上升到16682826.5±6246385.1；p＜0.05；
Xanthosine的积分面积均数从正常鼠的1228613.3±227431上升到2004903.7±435123.4；p＜0.001。
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| GR01 | Patent grant | ||
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