CN110501443B

CN110501443B - 无创识别/预警脂肪肝奶牛的新型生物标记物

Info

Publication number: CN110501443B
Application number: CN201910873316.4A
Authority: CN
Inventors: 师科荣; 张璇; 胡成长; 王中华; 闫振贵; 王生轩; 张乐天; 李冉冉; 徐忠金
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: LU101772B1; AU2020100617A4; CN110501443A

Abstract

本发明公开了一组无创识别/预警脂肪肝奶牛的新型生物标记物，所述生物标记物分别为：粪便中的L‑α‑氨基丁酸和山嵛酸，尿液中的3‑硝基酪氨酸。经诊断能力验证，上述每一种标记物的AUC值都比传统的临床血清生化指标高，具有更高的临床诊断应用价值；而且，这三种生物标记物的联合诊断结果显示出更高的诊断应用价值。利用本发明的生物标记物对脂肪肝奶牛进行诊断、鉴别和监测，不仅成本低、操作简单，而且是一种无创且非侵入性的检测手段，符合动物福利与健康养殖的理念，未来可广泛应用于奶牛的规模化养殖，促进奶业产业的健康、高效发展。

Description

无创识别/预警脂肪肝奶牛的新型生物标记物

技术领域

本发明涉及分析化学及临床医学技术领域，具体涉及一种无创识别/预警脂肪肝奶牛的新型生物标记物。

背景技术

正常肝脏中含脂肪约5％(按湿重计算)，由于某种原因或多种原因而影响肝内脂肪代谢过程，使脂肪在肝中积存超过肝脏的正常含量时，称为脂肪肝。肝内细胞发生脂肪变性，组织学表现为肝细胞胞浆内充满脂肪滴。此病常发生于奶牛的产后，而且在高产奶牛更为多发。奶牛脂肪肝病作为奶牛围产期常发的代谢紊乱性疾病之一，严重的还会引发酮病、产后瘫痪等，严重影响奶牛的产奶性能、繁殖性能、使用寿命。该病的发生率在奶牛围产期尤为常发，发生比例相对较高(5-10％的奶牛患重度脂肪肝，30-40％患中度或轻度脂肪肝)，对奶业造成巨大经济损失。

脂肪肝作为常见的代谢紊乱疾病长期存在，并且对乳制品行业造成相当大的经济损失，但仍缺乏有效的诊断方法。目前唯一可靠的诊断方法就是肝脏活检——奶牛活体取肝组织进行脂肪含量测定。该方法是一种侵入性方法，对奶牛的健康产生雪上加霜的影响，不利于动物福利；况且，预后不良还会导致并发性感染疾病。因此，寻求一种能够满足兽医临床和养牛生产实践需要的非损伤、特异性高、灵敏度和准确性好的诊断方法，已成为防治奶牛脂肪肝病急需突破的瓶颈。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一组可用于奶牛脂肪肝病无创识别或预警的代谢生物标记物，利用本发明的生物标记物对脂肪肝奶牛进行诊断和鉴别，不仅成本低、操作简单，而且是一种无创且非侵入性的检测手段，符合动物福利与健康养殖的理念，未来可广泛应用于奶牛的规模化养殖，促进奶业健康、高效发展。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供如下1)-3)至少一项所述的物质作为生物标记物在制备诊断奶牛脂肪肝病的试剂或试剂盒中的用途：

1)L-α-氨基丁酸(L-Alpha-aminobutyric acid)；

2)山嵛酸(Behenic acid)；

3)3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)。

其中，L-α-氨基丁酸和山嵛酸为粪便中的小分子代谢标记物，3-硝基酪氨酸为尿液中的小分子代谢标记物。上述三种生物标记物均能准确的识别奶牛脂肪肝病，每一种生物标记物的AUC值都比传统临床生化指标高，而且，多个联合应用时，AUC比单个更接近于1，诊断效果更好；上述三个生物标记物联合应用时，对奶牛脂肪肝病的识别效果最好。

由此，本发明优选保护L-α-氨基丁酸、山嵛酸和3-硝基酪氨酸作为生物标记物组合在制备识别奶牛脂肪肝病的试剂或试剂盒中的用途。

本发明的第二方面，提供一种检测奶牛代谢物中的生物标记物含量的物质在制备用于非侵入性识别奶牛脂肪肝病的产品中的用途。

所述奶牛代谢物包括：粪便和尿液。

所述奶牛代谢物中的生物标记物包括：粪便中的L-α-氨基丁酸和山嵛酸；尿液中的3-硝基酪氨酸。

非侵入性识别奶牛脂肪肝病的方法包括：

(1)收集来自待测奶牛的代谢物；

(2)检测奶牛代谢物中的生物标记物含量；

(3)基于检测到的生物标记物相对含量识别待测奶牛是否患有脂肪肝病。

本发明的第三方面，提供上述用于诊断奶牛脂肪肝病的生物标志物的获得方法，包括以下步骤：

(1)经过579头、两个群体的11个血清生化指标的筛选，选取18头奶牛组成Discovery set，通过肝组织活检诊断，将奶牛分为正常组和脂肪肝患病组，采集奶牛的粪便和尿液，通过质谱检测粪便和尿液中的小分子代谢物的含量，分别采用多维检验和单维T检验分别筛选出在正常组和脂肪肝患病组中分布差异显著的小分子代谢物，将两种方法筛选得到的小分子代谢物取交集，得到Discovery set的候选差异标记物；结果发现该发明的3个标记物在患病组和正常组表达差异极显著。

(2)随机选取16头奶牛组成Test set，目的是为了验证上述3个标记物的表达差异。通过传统的临床血清指标、B超透视以及兽医综合诊断的结果，将其分为疑似正常组和疑似患病组，采集粪便和尿液，通过质谱检测粪便和尿液中的小分子代谢物的含量，分别采用多维检验和单维T检验分别筛选出在正常组和脂肪肝患病组中分布差异显著的小分子代谢物，将两种方法筛选得到的小分子代谢物取交集，得到Test set的候选差异标记物；结果发现该发明的3个标记物在疑似患病组和疑似正常组表达差异极显著。

(3)将Discovery set的候选差异标记物和Test set的候选差异标记物进行比对，将两者候选差异标记物取交集，得到潜在的生物标记物；将潜在的生物标记物进行诊断能力验证，得到用于诊断奶牛脂肪肝病的生物标志物。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中，多维检验以VIP>1和P<0.05为标准；单维T检验以P<0.05为标准。

优选的，步骤(3)中，采用小提琴图和ROC曲线对潜在的生物标记物的诊断能力进行验证。

本发明的有益效果：

(1)本发明基于代谢组学技术，首次提出了三个可以作为非侵入性识别和鉴定脂肪肝病奶牛的生物标记物，分别为：粪便中的L-α-氨基丁酸(L-Alpha-aminobutyric acid)和山嵛酸(Behenic acid)，尿液中的3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)。经诊断能力验证，上述每一种标记物的AUC值都比传统临床生化指标高，具有更高的临床诊断应用价值；而且，这三种生物标记物的联合诊断结果显示出更高的诊断应用价值。

(2)利用本发明的生物标记物对脂肪肝奶牛进行识别、鉴定和监测，不仅成本低、操作简单，而且是一种无创且非侵入性的检测手段，符合动物福利与健康养殖的理念，未来可广泛应用于奶牛的规模化养殖，促进奶业健康、高效发展。

附图说明

图1：本发明的生物标记物的发现流程图；

图2：粪便样本VIP火山图，VIP>1；

图3：粪便样本单维T检验图，P<0.05；

图4：粪便样本单多维交集维恩图；交集部分共有23个候选差异代谢物。

图5：尿液样本VIP火山图，VIP>1；

图6：尿液样本单维T检验图，P<0.05；

图7：尿液样本单多维交集维恩图；交集部分共有7个候选差异代谢物；

图8：差异生物标记物的小提琴图；其中，A.患病组粪便标志物L-Alpha-aminobutyric acid显著低于对照组，患病组粪便标记物Behenic acid显著高于对照组；B.患病组尿液标志物3-Nitrotyrosine显著低于对照组。

图9：生物标记物L-Alpha-aminobutyric acid的ROC曲线图；L-Alpha-aminobutyric acid曲线下面积(AUC)为0.863。

图10：生物标记物Behenic acid的ROC曲线图；Behenic acid曲线下面积为0.794。

图11：生物标记物3-Nitrotyrosine的ROC曲线图；3-Nitrotyrosine曲线下面积为0.802。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，奶牛脂肪肝病作为奶牛围产期常发的代谢紊乱性疾病之一，严重的还会引发酮病、产后瘫痪等，严重影响奶牛的产奶性能、繁殖性能、使用寿命。对奶业造成巨大经济损失。如果能提前识别或有相应的预警措施，就可以有效避免这种损失。但是，目前唯一可靠的诊断方法就是肝脏活检——奶牛活体取肝组织进行脂肪含量测定。该方法是一种侵入性方法，对奶牛的健康产生雪上加霜的影响，不利于动物福利；况且，预后不良还会导致并发性感染疾病；因此，采用无创方法进行脂肪肝奶牛的早期诊断具有重要的意义与价值。

代谢组学等新技术涉及整个代谢组的研究，已被确定为一种有前景的技术，用于探测疾病的进展，阐明其病理，并评估药物对某些病理状况的影响。代谢组学技术为开发新的生物标记物提供了大量机会，这些生物标记物是识别和分析疾病、预测疾病进展、确定治疗干预措施的有效性、安全性的重要工具。

本发明旨在研究奶牛脂肪肝病的早期诊断和预警的无创生物标志物，本发明运用到了XploreMET^TM技术对代谢标记物进行了测定。该技术用飞行时间质谱仪、气相色谱法和机器人在线衍生站，对样本中的主要功能代谢物(如氨基酸和胺、有机酸、碳水化合物、脂肪酸和脂类、核苷酸、糖、维生素和辅助因子)进行测量。XploreMET^TM软件集成代谢组学社区和流线中最全面的哺乳动物代谢物库(JiaLib^TM)、数据处理、代谢物注释、统计分析、代谢路径丰富分析和项目报告。本发明生物标记物的发现过程在科学的技术、科学的方法支撑下，经过了严格的筛选过程和严谨的群体验证过程。这得益于在以下5个方面的一一攻关与突破。

(1)本发明采用了GC-MS技术进行粪、尿的代谢组学分析。代谢组学的优势在于其更趋近于动物的表现型，可以灵敏指证表型，被大量发掘用于疾病的识别。

(2)代谢组数据首先经过了QC质控，剔去不合格或不合理数据；经过主成分分析(PCA)和OPLS-DA方法验证了筛选模型的可靠性，然后经过VIP火山图和独立样本T检验筛选候选差异标记物。

(3)本发明中的生物标记物经过了严谨的筛选过程，不仅在肝活检诊断的群体中显著差异表达，而且在由血清生化指标诊断为疑似的群体中验证，给这3个生物标记物上了“双保险”！

(4)代谢标记物在不同个体间具有变异性，这也是筛选具有诊断价值的代谢标记物的难点所在。为攻克这一技术难点，本发明在发现过程中经过了大量样本(579头群，两个群体)的标记物检测和筛选、多个样本重复取交集来消除变异。与传统常见的根据血清生化指标识别脂肪肝个体的方法相比，具有明显的准确识别优势(表2)。

该发明的标记物经过了独立样本集的准确性验证，这在前人的研究中极少涉及的难点突破(图8和图9)。

本发明最终发现了三个具有诊断价值的生物标记物：粪便中L-Alpha-aminobutyric acid和Behenic acid，尿液中的3-Nitrotyrosine，作为识别脂肪肝病奶牛的非侵入性小分子代谢标记物。

其中：Alpha-aminobutyric acid，分子式C₄H₉NO₂，分子量103.1198，可由L-苏氨酸和DL-2-氨基丁酸为原料合成，通过多维VIP，单维T检验技术筛选，存在于围产期奶牛的粪便代谢产物中，其在奶牛对照组和患病组中呈现显著差异。

Behenic acid，分子式为C₂₂H₄₄O₂，为气味柔和的固体，用于制造山嵛醇、山嵛酸酯、山嵛酸酰胺，可广泛用于纺织、石油、洗涤剂、化妆品等行业。通过多维VIP，单维T检验技术筛选，发现于奶牛围产期粪便代谢产物中，其在奶牛对照组和患病组中呈现显著差异。

3-Nitrotyrosine，分子式为C₉H₉N₂O₅，分子量为225.1787，通过多维VIP，单维T检验技术筛选，发现于奶牛围产期尿液代谢产物中，其在奶牛对照组和患病组中呈现显著差异。

本发明所发现的3个具有诊断价值的生物标记物来自于粪、尿，利用奶牛的正常代谢产物进行识别，省时便捷，节约诊断成本；进行诊断时不需要传统的血样采集或手术穿刺，为无痛识别标记物，对奶牛的健康安全和动物福利具有重要意义；利用本发明的标记物对奶牛脂肪肝病进行识别诊断，不会影响奶牛生产，不会产生由于血样采集、手术穿刺等造成的奶牛产量下降、健康应激甚至并发感染等负作用。节约诊断和治疗成本，促进高产增效。

本发明所采用的生物标记物来自于粪/尿，是奶牛的代谢物，可以很好地指证奶牛的代谢情况，对于奶牛的脂肪肝可以精确地通过代谢物中生物标记含量的变化指示奶牛的代谢状况。

本发明利用了代谢组学技术，优势在于其标记物含量与疾病发生关联的灵敏性。利用代谢标记物可以发现由蛋白和基因检测不到的表型代谢物，直接联系到疾病本身，并可通过代谢物的代谢通路找到上游的靶基因和靶蛋白，有利于根据表征追溯病源，增强诊断准确性。在进行代谢组学研究之前，我们进行了大量血清样本的生化指标检验与筛选(579头，两个群体)，为该发明中生物标记物的发现奠定了坚实的基础。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：候选标记物的筛选和发现——肝活检诊断群体的代谢物差异标记物的筛选与发现

首先选取18头奶牛作为Discovery set，通过肝组织活检，将其分为正常组(n＝8)和患病组(n＝10)，采集奶牛的粪便和尿液，通过质谱检测，检测出小分子代谢物在正常组和患病组中的差异分布。对代谢物进行模型检测，显示两组差异分布显著，模型可靠。通过两种统计分析方法筛选差异标记物：VIP(Variable importance in projection)多维检验，以VIP>1和P<0.05为标准，筛出在两组中分布差异显著的小分子(图2)；单维T检验，以P<0.05为标准，筛出两组中分布差异显著的小分子(图3)，将两种方法筛得的候选标记物取交集(图4)，最终得出Discovery set的候选差异标记物。

实施例2：潜在生物标记物的筛选——候选标记物在他群个体的差异表达验证

选取16头奶牛作为Test set，目的是通过一个独立的样本群，对Discovery set的候选差异标记物进行验证；通过传统的临床血清指标、B超透视以及兽医综合诊断的结果，将其分为疑似正常组(n＝7)和疑似患病组(n＝9)，采集粪便和尿液，按照与实施例1相同的方法：：VIP(Variable importance in projection)多维检验(图5)，单维T检验(图6)，将两种方法筛得的候选标记物取交集(图7)进行小分子代谢物质谱检测，统计分析，最终筛得Test set的候选差异标记物。

将Discovery set和Test set的候选差异标记物进行比对，二者取交集，最后得出潜在生物标记物：粪便中2个——L-Alpha-aminobutyric acid和Behenic acid，尿液中1个3-Nitrotyrosine。

上述3个生物标记物的信息如表1所示：

表1：3种代谢生物标记物的基本信息

表中详细给出了三种标记物的来源，种类，HMDB号，KEGG通路号，T检验的P值，均小于0.05，以及Fold change(FL/Normal)值，其中FC值显示粪便中标记物L-Alpha-aminobutyric acid和尿液中标记物3-Nitrotyrosine在FL患病组中下调，粪便标记物Behenic acid在患病组中上调。

实施例3：3个潜在的生物标记物的识别能力验证——小提琴图和ROC曲线。

小提琴图显示(图8)，与正常组奶牛相比，患病组奶牛粪中L-Alpha-aminobutyricacid和尿中3-Nitrotyrosine明显下调，而粪中的Behenic acid明显上调。ROC曲线分析可知(如图9-图11)，每一种标记物的AUC值都比传统临床生化指标高，具有更高的临床诊断应用价值；而且，3种粪和尿生物标记物的联合诊断结果显示出更高的诊断应用价值(AUC值可达0.988，表2)。

在奶牛养殖应用中，可通过检测奶牛粪便或尿液中的这3种生物标记物相对含量，可识别检测潜在的脂肪肝患病奶牛。该生物标记物为未来无创检测、诊断奶牛脂肪肝病提供了新技术和新方法。

实施例4：3个代谢生物标记物对脂肪肝奶牛个体的识别能力远远高于传统血清生化指标

将本发明的3种生物标记物与传统的血清生化指标对脂肪肝病奶牛的识别能力进行比较，结果见表2。由表2可以看出，本发明的3种生物标记物，每一种的AUC值(0.794～0.863)均高于传统的血清生化指标(0.112～0.756)；粪便的2中标记物的联合诊断能力(AUC＝0.975)高于单个粪便标记(AUC分别为0.863和0.794)；而且，粪便与尿液两类代谢物、3种标记物的联合诊断能力最高(AUC＝0.988)。本发明将来自粪便和尿液的3个生物标记物作为联合诊断标记物组合，可以显著提高对脂肪肝奶牛的诊断识别能力。

表2：对脂肪肝病奶牛的诊断能力比较

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.L-α-氨基丁酸、山嵛酸和3-硝基酪氨酸联合作为生物标记物组合在制备识别奶牛脂肪肝病的试剂或试剂盒中的用途。

2.一种检测奶牛代谢物中的生物标记物含量的物质在制备用于非侵入性识别奶牛脂肪肝病的产品中的用途；

所述奶牛代谢物包括：粪便和尿液；

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，非侵入性识别奶牛脂肪肝病的方法包括：

（1）收集来自待测奶牛的代谢物；

（2）检测奶牛代谢物中的生物标记物含量；

（3）基于检测到的生物标记物含量识别或预警待测奶牛是否患有脂肪肝病。