CN114705861A

CN114705861A - 检测样本中9种血清代谢物的表达水平的试剂在制备用于评估结直肠癌风险的试剂盒的应用

Info

Publication number: CN114705861A
Application number: CN202210632264.3A
Authority: CN
Inventors: 陈利民; 李振; 孙西予; 莫苑宁
Original assignee: Tianjin Yunjian Medical Instrument Co ltd; Tianjin Yunjian Medical Lab Co ltd
Current assignee: Tianjin Yunjian Medical Instrument Co ltd; Tianjin Yunjian Medical Lab Co ltd
Priority date: 2022-05-30
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2042-05-30
Also published as: CN114705861B

Abstract

本发明为检测样本中9种血清代谢物的表达水平的试剂在制备用于评估结直肠癌风险的试剂盒的应用，利用9个相关的血清代谢物构建了用于诊断结直肠癌的代谢组衰老时钟模型。相比传统诊断方法，该试剂能够有效提高诊断和预测结直肠癌的准确性。

Description

检测样本中9种血清代谢物的表达水平的试剂在制备用于评估结直肠癌风险的试剂盒的应用

技术领域

本发明属于生物医药建模领域，涉及检测样本中9种血清代谢物的表达水平的试剂在制备用于评估结直肠癌风险的试剂盒的应用。

背景技术

人类血清代谢组分析可以探索衰老模式中体内发生的代谢变化。不同年龄健康人血清的代谢谱能够解析不同生理年龄的代谢模态，作为研究个人衰老的正常生物学基线。观察正常衰老基线在疾病（例如结直肠癌）中发生的偏移和变化，将有助于临床诊断并揭示潜在的病理生理学，进而加深对疾病发病机制的理解。申请人公开了一种代谢年龄预测模型及其在结直肠癌诊断中的应用CN114334170A，其中明确了代谢年龄的延缓衰老的结直肠癌风险大于其他代谢年龄的衰老形式，但公开文件并没有给出具体的血清代谢物能够更好的评估结直肠癌风险。

发明内容

本发明的主要目的在于提供基于9种血清代谢物的表达水平的试剂在制备用于评估结直肠癌风险的试剂盒的应用。

具体的，9种血清代谢物分别为：硫酸脱氢表雄酮(DHEAS；KEGG条目：C04555)、瓜氨酸 (KEGG条目：C00327)、古洛糖酸盐(KEGG条目： C00800)、脯氨酸 (HMDB0253068)、枸橼酸盐(KEGG条目：C00158)、鸟氨酸（KEGG条目：C00077）、3-（4-羟基苯基）乳酸（KEGG条目：C03672）、犬尿氨酸（KEGG条目：C00328）和苯丙氨酸（KEGG条目：C00079）。9种代谢物特征于真实年龄的相关性表达如图3所示。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种结构识别与生物标志物发现的方法。步骤如下：

第一步，在获得的数据相关采集（DDA）MS2光谱中进一步搜索了所有可能的作用途径注释，前体离子耐受性为±5 ppm，搜索结果与HMDB和METLIN数据库62,63匹配。

第二步，从满足以下所有标准的代谢物中选择生物标记物：

（a）代谢物出现在重要评分>0的作用途径中；

（b）代谢产物相应的代谢特征符合|r|≥0.3；

（c）通过结构鉴定对代谢物进行了验证。

优选的，所述评估结直肠癌的风险包括如下步骤：

(1)采集健康人群和结直肠癌人群的样本，通过液相-质谱方法进行非靶向代谢组学和DDA（数据依赖型采集模式）分析，并统计样本的实际年龄；

(2)通过代谢老化时钟模型对步骤(1)的样本代谢组学数据进行分析，获得样本的代谢年龄；

(3)将步骤(1)中统计的实际年龄与步骤(2)中得到的代谢年龄进行对比分析，对其中延缓衰老的样本给出结直肠癌阳性高风险诊断。

根据本发明的一个方面，提供了一种代谢老化模型，所述代谢老化模型的数据集分为健康人群和结直肠癌人群；

所述健康人群，是通过液相-质谱方法得到的健康人群的代谢组检测结果,用于代谢老化时钟建模的训练和预测年龄与实际年龄之间的对比；

所述结直肠癌人群，是通过液相-质谱方法得到的结直肠癌人群（APL和I\II\III三个分期型）的代谢组检测结果,用于评估代谢老化时钟模型的准确度和应用效果；

本发明首先通过充分利用代谢物特征数据，基于弹性网络的机器学习模型预测样本年龄，代谢老化时钟模型的组成和构建包括了以下步骤：

步骤一：采集健康人群血清样本，并将数据中3002个样本随机分成75%训练集（2252个样本）和25%测试集（750个样本），通过液相-质谱方法进行非靶向代谢组学和DDA（数据依赖型采集模式）分析，并统计样本的实际年龄；

步骤二：在质谱代谢组学特征进行处理和标准化后，使用代谢的浓度/强度作为预测指标。利用训练集样本和9个代谢组特征数据，将步骤一中所得数据输入弹性网络模型，以各个检测项为自变量，样本采集时年龄为因变量；

具体的，根据所述经过预处理的样本数据库，利用弹性网络模型（elasticnetwork model, ENM）进行监督学习，根据三倍交叉验证进行参数优化，选取回归系数最高的参数，构建年龄回归模型。

步骤三：通过R包caret完成弹性网络回归模型的建立，定义目标函数，目标函数包括正则化；

其中，正则化的主要作用是防止过拟合，并对模型添加正则化项可以限制模型的复杂度，使得模型在复杂度和性能达到平衡。常用的正则化方法有L1正则化和L2正则化。弹性网络则是一种使用 L1，L2范数作为先验正则项训练的线性回归模型。

上述弹性网络回归模型公式如下：

模型预测年龄=49.053837-7.716626* 硫酸脱氢表雄酮(DHEAS；KEGG条目：C04555) + 5.623817 * 瓜氨酸 (KEGG条目：C00327) + 3.503359 * 古洛糖酸盐(KEGG条目： C00800) + 10.022953 * 脯氨酸 (HMDB0253068) + 4.793853 * 枸橼酸盐(KEGG条目：C00158) + 3.415520 * 鸟氨酸（KEGG条目：C00077） + 4.935489 * 3-（4-羟基苯基）乳酸（KEGG条目：C03672）+ 1.061718 * 犬尿氨酸（KEGG条目：C00328）+ 1.213430 * 苯丙氨酸（KEGG条目：C00079）。

各代谢物特征在年龄评估模型中的贡献如图4所示。

其次，通过充分利用基于弹性网络的机器学习模型预测样本年龄，预测结直肠癌人群风险，包括了如下步骤：

步骤一：采集结直肠癌2647个样本，通过液相-质谱方法进行非靶向代谢组学和DDA（数据依赖型采集模式）分析，并统计样本的实际年龄；

其中，结直肠癌患者人群可分为APL（715个样本）和I（1008个样本）\II（427个样本）\III（417个样本）三个分期型。

步骤二：将质谱代谢组学9个特征数据带入上述的弹性网络代谢年龄预测回归模型，并根据预测年龄与真实年龄间的95%置信区间(CI,2.5%~97.5%)，将样本分类为预测正常年龄组、预测延缓衰老组和预测过度衰老组；

具体的，预测年龄结果超过预测拟合线97.5%置信区间的样本被分类为预测过度衰老组，低于预测拟合线2.5%置信区间的样本被分类为预测延缓衰老组，预测结果在95%置信区间内的样本被分类为预测正常年龄组。

步骤三：根据以上预测年龄分组，判断患有结直肠癌的风险；

其中，所述输出值判定结果如下：

（A）预测为延缓衰老组判定为结直肠癌高风险人群；

（B）预测为正常组与过度衰老组判定为结直肠癌低风险组。

该分类结果如图5所示，结直肠癌样本可与正常健康组样本显著分离。

具体的，与正常健康人群对照组相比，总的ROC（Receiver OperatingCharacteristic）的AUC（Area Under Curve）区分值为0.813，其阳性预测值（PositivePredicted Value，PPV）65.47％（ 95％置信区间[CI]， 62.25% - 68.54%），表明该检测方法效果良好。

本发明的有益效果是：

本发明建立了一个高精度的代谢组衰老时钟，代谢组衰老时钟是通过血清代谢谱建立的代谢年龄预测模型，先发现了参与其中的高贡献度代谢通路，并从中筛选出9种重要性评分较高的血清代谢物。本发明从代谢组学的角度阐明了在结直肠癌发生过程中衰老模式存在的延缓衰老组现象，并通过9种重要性评分较高的血清代谢物验证了所述的延缓衰老现象用于结直肠癌诊断的可能性，其准确性高于传统的Cologuard法和Setpin 9methylation法。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1.在正常人群的训练组(75%)和测试组(25%)中，通过代谢衰老时钟生成的预测年龄与实际年龄的比较。

图2.代谢衰老时钟的构件中贡献度最高的9个代谢通路。

图3.衰老生物标志物的统计学数值随着实际年龄变化的单变量轨迹，这九种物质按照贡献度的大小（从左向右，从上向下）依次排序。

图4.在基于代谢物构建的代谢衰老时钟模型中生物标志物的重要性评分，按重要性从高到低排序。

图5.APL和CRC样本中的低老化现象：(A)以代谢物为基础构建的代谢衰老时钟预测年龄与实际年龄的比较。低于2.5%分位线的样本定义为低老化组，高于97.5%的样本定义为超老化组。(B)APL和CRC样本在低老化组中的样本分数明显较大，表明APL和CRC存在低老化现象。

图6. 结构识别与生物标志物发现的过程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部试验结果。

本发明提供了代谢年龄预测模型在评估结直肠癌的风险的应用。代谢年龄预测模型建模及训练的过程，实施例中健康人群，并选取不同的人群。

样本的收集和人群信息：

在本实施例中，总共使用3002个健康人群样本（Normal）建立参考年龄型并构成基线，其中2252个样本作为训练组，750个样本作为测试组。另一组研究对象是由2647例结直肠癌（CRC）患者组成的集合，其中晚期癌前病变（advanced precancerous lesions，APL）患者（CRC-APL）715例，I期（CRC-stage I）1088例，II期（CRC-stage II）427例，III期（CRC-stage III）417例。从每个人身上采集一份血清样本。所有样本的人口学统计信息如下。

实施例的实施方法：

样本处理方法：

从-80°C冰箱中取出血清样品，在冰上融化。每个样本用移液器取10 μL血清加入1.5mL离心管中。下之后加入240 μL 工作提取缓冲液（各组分体积比为甲醇：乙腈：ddH₂O =5:3:2），该缓冲液储存在-20 °C。在4°C的冰箱中对上述混合后的样品进行涡旋振荡，混匀后放入冷冻离心机，条件为，温度为：4°C；转速为：12000 × g；时间为：30 min。最后用移液器对每个样品取170 μL的上清液加入2 mL带200 μL内插管的进样瓶中（未进样分析前储存在-20 °C冰箱）。

质谱检测方法：

使用基于美国Thermo Fisher公司的Q-Exactive Plus质谱仪（液相部分为Vanquish）的检测平台进行流动注射分析(简称：FIA)。

液相条件：流动相流速为0.050 mL/min等度洗脱；流动相组分采用5%乙腈水溶液（加入0.1%甲酸）；加样体积为10 μL；分析时长3 min。

质谱条件：

分别采用正、负两种电离模式，样品在4kv电压和325°C温度下喷雾电离，质核比m/z检测范围是60-900，分辨率为140000。依次设置为，以收集每个样品的完整代谢谱，得到原始质谱文件（raw文件）。

同时，这些样品还采用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 在数据相关采集 (DDA)模式下进行了分析。

数据处理方法：

原始MS文件使用ProteoWizard进行转换和中心化，并保存为mzXML文件。通过proFIA包提取同一批次样本的进样时间段并检测m/z特征峰。然后用xcms包中的MzClust方法对检测到的特征峰进行对齐，得到同一批次（batch）内样本共有的代谢特征（比例阈值minProp = 0.5），将各个样本的正负极代谢特征按行堆叠，形成数据矩阵。将鲁棒局部估计散点图平滑(robust LOESS)模型应用于每一个代谢特征，以消除注入过程中的同一批次内的信号漂移。通过归一化到每个代谢特征的正常基线的中位数，以消除信号的批次间差异。使用impute包采用k-最近邻(kNN)算法补全缺失值。

构建基于多变量建模和机器学习的代谢衰老时钟：

健康人群被随机分为训练组(75%)和测试组(25%)。训练组中的代谢特征首先与实际年龄进行相关分析，并保留绝对相关系数|r| ≥ 0.3的特征。使用xMSannotator软件包包以± 5 ppm的离子容差，对筛选后的代谢特征峰在KEGG代谢物数据库中进行注释。使用绝对相关系数对代谢物的数值进行加权，通过绝对相关系数将注释的化合物与特征值的加权平均值进行正相关或负相关，分别聚合到KEGG通路中。简而言之，首先用实际年龄计算每个代谢特征 i 的单变量相关性 r_i。接下来，根据相关系数的符号计算特征方向性（上/ 下）。然后，从METLIN中鉴定出的代谢物被映射到

每个方向的KEGG通路，如：

.

最后，使用特征表达值计算

样本的

通路表达值

，如下所示，其中

代表集合

中的元素数量：

如前所述，基于健康志愿者与年龄相关的代谢组学数据，构建了一个基于路径的代谢时钟。通过对训练集的3折交叉验证(CV)调整超参数 α和 λ，利用所有路径特征拟合这些路径的弹性网络，并建立代谢衰老时钟模型。路径重要性得分由使用caret软件包的最终弹性网络模型的系数得出。重要度评分> 0的路径被定义为贡献路径。对训练组和测试组都进行了预测。

结构鉴定与生物标志物发现：

在对前体离子的±5 ppm容差的DDA MS2光谱中进一步搜索所有可能的注释，搜索结果与HMDB和METLIN数据库进行匹配。从符合下列所有标准的代谢物中选择生物标记物：(a)重要度得分为> 0的代谢产物出现在促进通路中；(b)代谢物相应代谢特征符合|r|≥0.3；(c)通过结构鉴定验证的代谢物。通过发现的生物标记物，另一个基于代谢物的代谢时钟以同样的方式拟合，但只与生物标记物的代谢特征吻合。

基于代谢产物的代谢时钟的构建：

建立以代谢产物为基础的代谢衰老时钟的方法与以代谢途径为基础建立的代谢衰老时钟的方法基本一致，在具体操作上的区别是前者（以代谢产物为基础的代谢衰老时钟）使用了与健康志愿者群体的代谢特征相对应的经过验证的代谢生物标志物，而不是像后者（以代谢途径为基础建立的代谢衰老时钟）使用代谢途径作为建立模型的原始数据。重要性评分被用来验证每个生物标志物的贡献。对健康志愿者和CRC受试者进行预测，将前者作为参考代谢年龄型。为了可视化参考代谢年龄型中代谢年龄的中位数和95%置信区间(CI)，我们使用quantreg软件包拟合了一个分位数线性回归模型，以预测正常人群实际年龄和代谢年龄的2.5%、50%和97.5%分位数线。得出的回归线与正常人群和大肠癌人群的预测结果基本重合。预测低于2.5%分位数回归线的样本被归类为延缓衰老组，即低老化组，预测高于97.5%的样本被归类为过度衰老组，即超老化组，其余的被归类为正常衰老组，即正常老化组。

基于模型低老化分类的结直肠癌诊断方法：

为了展示衰老分类在结直肠癌诊断中的应用，所有低老化分组中的样本被认定为结直肠癌阳性。为了模拟大众人群中结直肠癌的发病率，以30倍的覆盖率（coverage）在所有待测样本中中进行有替换的自举（bootstrap），使得APL的发病率为760/10023,结直肠癌（所有分期）的发病率为65/10023，即分别从健康人群的评估集1、CRC人群的APL组和CRC人群的所有分期中分别有替换地自举抽样9198×30、760×30和65×30个样本，并以抽样后样本的分类结果给出结直肠癌诊断。以真阳性计数与总检测阳性计数的比值计算阳性预测值(PPVs)，以中心极限定理假设通过logit变换计算PPV的置信区间。

实施例的实施效果：

代谢年龄预测模型和分类结果：

在这项研究中，我们建立了一个精确定时的代谢衰老时钟模型，该时钟模型为弹性网络模型，通过拟合来自三千多名 30 岁以上的健康个体血清中的非靶向代谢物全谱检测结果的KEGG代谢通路构建。如图1所示，在训练组r = 0.88（75%）和测试组r = 0.81（25%）中，代谢年龄的预测值随着实际年龄的增长呈现出增加的趋势。如图2所示，重要性评分揭示了代谢衰老时钟最重要的下调贡献途径包括胆汁分泌、类固醇激素生物合成、组氨酸代谢、P450 的异生物质代谢和化学致癌作用。上调的贡献途径包括 ABC 转运蛋白、核黄素代谢、苯丙氨酸代谢和TCA循环。

建立基于血清代谢物的代谢老化时钟：

从基于途径的时钟生成的包含列表中，确定了一组 9 种重要的贡献代谢物。如图3所示，它们按绝对相关系数递减排序：硫酸脱氢表雄酮(DHEAS；KEGG条目：C04555)、瓜氨酸(KEGG条目：C00327)、古洛糖酸盐(KEGG条目：C00800)、脯氨酸 (HMDB0253068)、枸橼酸盐(KEGG条目：C00158)、鸟氨酸（KEGG条目：C00077）、3-(4-羟基苯基)乳酸（KEGG条目：C03672）、犬尿氨酸（KEGG条目：C00328）和苯丙氨酸（KEGG条目：C00079）。使用弹性网络模型构建基于这9种血清代谢物的代谢老化时钟，经训练组和测试组的交叉验证后，与健康人群数据集对比，计算出r=0.83。如图4所示，重要性分数验证了代谢衰老时钟模型中每个生物标志物的贡献，且脯氨酸、DHEAS 和瓜氨酸是贡献度排名前三的代谢物。该基于九种代谢物的代谢时钟将用于预测 CRC 患者的代谢年龄。

基于模型低老化分类的结直肠癌诊断效果：

把分位数回归线双尾95%置信区间(CI, 2.5%~97.5%)设定为代谢年龄型中实际年龄的正常范围。按照基于上述九血清代谢物的代谢时钟，拟合CRC样本的代谢年龄（图5A）时，低老化组中与正常人群中低于2.5%的样本分数相比，在APL样本中高出>23倍，在CRC样本中高出>20倍（图5B）。这揭示了低衰老表型是APL和所有阶段的CRC样本中代谢年龄的显着趋势。在90%（5%~95%）和 80%（10%~90%）置信区间下也进行了类似的分析（补充图4和5）。由于放宽了置信区间，APL和CRC患者的样本分数在低衰老组中均有所增加，从95%置信区间的58.6%增加到90%置信区间的65.5%和80%置信区间的74.0%，而超衰老组中APL和CRC患者的样本分数几乎没有变化从95%置信区间的1.4%到90%置信区间的1.8%和80%置信区间的2.8%。无论置信区间怎样设定，所有阶段的APL和CRC患者仍然在低衰老组显示出更多的人口分布。

低衰老表型及其对提高结直肠癌临床诊断率的临床意义：

CRC 队列中低老化样本分数的显着增加表明代谢时钟在 CRC 诊断中有很大潜在效用。如表2所示，模拟样本情况与普通人群的真实发病率一致后，通过将基于血清代谢物（代谢组）构建的代谢衰老时钟中具有低老化预测（CI = 95%）的所有健康-CRC阳性样本在APL和所有阶段的阳性预测值（PPV）分别为68.38%（64.34%、72.16%）和 21.9%（17.47%、25.90%）

通过上述步骤，基于代谢组中9种血清代谢衰老时钟预测模型，预测所有健康样本和结直肠癌样本患有结直肠癌的风险。其中，结直肠癌样本可被分类为APL以及其他所有I/II/III癌症分期。

进一步，将所有预测为延缓衰老组的样本预测为结直肠癌高风险，在结直肠癌APL分组与结直肠癌所有分期分组种的阳性预测值（PPV）分别为65.47%（CI 62.25%、68.54%）和12.67%（CI 10.03%、15.87%）。

若从预测为结直肠癌高风险人群中去除具有正常癌胚抗原检测值（CEA）的样本，即去除CEA检测值小于5ng/ml的样本，则9种代谢物预测为结直肠癌高风险的阳性预测值（PPV）将分别在APL组与所有分期组种提高到68.38%（CI 64.34%、72.16%）和21.9%（CI17.47%、25.90%）。其中，结直肠癌所有阶段样本的阳性预测值在去除CEA检测值样本后与原有9种血清代谢衰老时钟预测模型相比，阳性检测值有显著增加。

与LDT产品，Cologuard与Septin 9甲基化，两种市售产品相比，我们基于9种血清代谢衰老时钟预测模型的阳性检测率将分别在结直肠癌APL组中分别超越上述两样产品3倍与5倍，在结直肠癌所有阶段的样本组中分别超越上述两样产品6倍与9倍。进一步的，通过将基于9种血清代谢衰老时钟预测模型与癌胚抗原检测值相结合，我们的多靶点阳性预测值比起目前单独诊断标记CEA和两种市售LDT产品有更加显著改善。

结直肠癌人群在精准的衰老分类中下存在明显的低老化趋势。仔细研究与结直肠癌的衰老代谢谱及其相关的代谢通路，不仅可以提高结直肠癌诊断的PPV，从而更有效地找出阳性诊断中真正患有结直肠癌的病人，还可以通过所发现的代谢通路为结直肠癌的病理生理学提供新的见解。

本领域技术人员会理解，本发明不限于这里的实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims

1.检测样本中9种血清代谢物的表达水平的试剂在制备用于评估结直肠癌风险的试剂盒的应用：9种所述血清代谢物分别为：硫酸脱氢表雄酮，DHEAS；KEGG条目：C04555、瓜氨酸，KEGG条目：C00327、古洛糖酸盐，KEGG条目： C00800、脯氨酸，HMDB0253068、枸橼酸盐，KEGG条目：C00158、鸟氨酸，KEGG条目：C00077、3-（4-羟基苯基）乳酸，KEGG条目：C03672、犬尿氨酸，KEGG条目：C00328和苯丙氨酸，KEGG条目：C00079。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述评估结直肠癌的风险包括如下步骤：

A．采集健康人群和结直肠癌人群的9种血清代谢物样本，通过液相-质谱方法进行非靶向代谢组学和数据依赖型采集模式分析，并统计样本的实际年龄；

B．通过代谢衰老时钟模型对步骤A的样本代谢组学数据进行分析，获得样本的代谢年龄；

C．将步骤A中统计的实际年龄与步骤B中得到的代谢年龄进行对比分析，对其中延缓衰老组的样本给出结直肠癌阳性风险诊断。